腦心通膠囊提取物通過增強(qiáng)CXCR4表達(dá)促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移*

楊岳，李慧影，張璐莎，馬亞珂，趙步長(zhǎng)，賈力夫，趙菁，陳璐，王虹

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津　300193；2.陜西步長(zhǎng)集團(tuán)，西安　710082）

腦心通膠囊提取物通過增強(qiáng)CXCR4表達(dá)促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移*

楊岳1，李慧影1，張璐莎1，馬亞珂1，趙步長(zhǎng)2，賈力夫2，趙菁2，陳璐1，王虹1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津300193；2.陜西步長(zhǎng)集團(tuán)，西安710082）

［目的］探討腦心通（NXT）對(duì)小鼠心臟干細(xì)胞（CSCs）CXCR4表達(dá)的影響。［方法］應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）芯片技術(shù)研究腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞CXCR4表達(dá)的影響。應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用Transwell法測(cè)定腦心通對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞遷移能力的影響。［結(jié)果］芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦心通促進(jìn)心臟干細(xì)胞CXCR4基因的表達(dá)；流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，腦心通促進(jìn)心臟干細(xì)胞APC-CXCR4陽性細(xì)胞率；Western Blot結(jié)果表明，腦心通促進(jìn)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦心通促進(jìn)SDF-1誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞的遷移作用。［結(jié)論］腦心通可以促進(jìn)心臟干細(xì)胞CXCR4的表達(dá)。

腦心通；心臟干細(xì)胞；CXCR4的表達(dá)

缺血性心臟病及繼發(fā)的心功能衰竭已成為當(dāng)今世界威脅人類健康的重大疾病之一，目前藥物治療、內(nèi)科介入治療等僅僅只能恢復(fù)局部心肌組織的血液供應(yīng)，不能從根本上修復(fù)已經(jīng)發(fā)生壞死的心肌組織［1］。近年來細(xì)胞治療技術(shù)為缺血性心臟病的治療帶來了新的前景。

心臟干細(xì)胞（CSCs）又稱心臟祖細(xì)胞（CPCs），是一類存在于心臟組織中，具有自我更新、克隆形成、多種分化潛能，可分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的干細(xì)胞。它的出現(xiàn)推翻了心臟是一個(gè)終末分化器官、缺乏自我更新潛能的這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)。心臟干細(xì)胞可在心肌損傷后通過遷移來參與心臟損傷修復(fù)［2］，對(duì)心臟維持自我穩(wěn)定及損傷修復(fù)具有重要意義。當(dāng)前，基于心臟干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病已成為心血管疾病研究中的熱點(diǎn)，研究已發(fā)現(xiàn)多種具有不同表型特征的心臟干細(xì)胞，它們均具有參與心肌和血管再生的能力，可用于缺血性心臟病的治療。

步長(zhǎng)腦心通膠囊（以下簡(jiǎn)稱腦心通，NXT）是根據(jù)中醫(yī)理論研制而成的中藥制劑，由黃芪、全蝎、地龍、水蛭、丹參、當(dāng)歸、川芍、赤芍、紅花、乳香（制）、沒藥（制）、桑枝、桃仁、桂枝、牛膝16味中藥加工制成，具有活血化瘀、行氣止痛等心血管方面的藥物作用。藥理研究表明，腦心通膠囊中許多成分均對(duì)心血管有保護(hù)作用［3-4］。很多臨床實(shí)驗(yàn)表明腦心通膠囊能有效改善心肌缺血癥狀，治療心血管疾?。?-8］。

本研究觀察了腦心通對(duì)小鼠心臟干細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響，旨在探討腦心通能否干預(yù)心臟干細(xì)胞治療缺血性心臟病。

1　材料

1.1細(xì)胞及試劑心臟干細(xì)胞：由美國(guó)西北大學(xué)覃剛建教授惠贈(zèng)；腦心通超微粉（步長(zhǎng)公司）；DMEM/ F12，Hyclone；L-Glutamine、β-mercaptoethanol、36%多聚甲醛（Sigma公司）；MEM nonessential amino acids、Basic fibroblast grow factor（Gibco）；胎牛血清、胰蛋白酶液（Biological Industries）；High Pure RNA Isolation Ki（tRoche）；TaqManReverse Transcription Rengents、TaqManGene Expression Master Mix、基因芯片（Applied Biosystems）；Anti-CXCR4 antibody，abcam；APC Rat IgG2b，κIsotype Control、APC Rat anti-Mouse CD184（CXCR4，BD公司）；結(jié)晶紫染色液，碧云天；SDF-1、mTNF-α（RD公司）；24孔板小室、chemiluminescent HRP substrate，Millipore；全蛋白提取試劑盒，生工；PageRuler Prest Protein Ladder，Thermo；β-Actin（13E5）Rabbit mAb、BCA Protein Assay Kit（cell signal）；Anti-CXCR4 antibody，abcam。

1.2儀器ABI PRISM 7500（Applied Biosystems），EXPRESS PCR儀、SEMI-DAY TRANSFER CELL（BIO-RAD公司），流式細(xì)胞儀（BD公司），凝膠成像分析儀（Syngene公司），STIK氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱［施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司］，Ti-U倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司），HR 40-ⅡA2生物安全柜（Haier公司）。

2　方法

2.1藥物溶液配制

2.1.1CCM完全培養(yǎng)液DMEM/F12，10%FBS，2 mmol/L L-Glutamine，0.1mmol/L β-mercaptoethanol，1%（V/V）MEM nonessential amino acids，5 ng/mL Basic fibroblast grow factor，1%（V/V）抗生素。

2.1.2腦心通混合物的提取腦心通超微粉172.36 g，以1∶8的料液比（kg/L）用1 378.88 mL 95%乙醇回流提取2 h，然后用布氏漏斗抽濾。所得濾渣用1 378.88 mL 60%乙醇按上述方法回流提取2 h，然后用布氏漏斗過濾。兩次濾液合并，以55℃水溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。旋蒸后置于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上揮去殘留有機(jī)溶劑，然后在真空干燥箱中烘干，最終得到腦心通超微粉提取物即腦心通混合物53.183 g。

2.2心臟干細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代將心臟干細(xì)胞從液氮中迅速取出后，直接放入37～40℃的溫水中，快速搖動(dòng)使其融化。在無菌條件下，吸出細(xì)胞凍存液，轉(zhuǎn)移至離心管并加入CCM完全培養(yǎng)基。1 000 r/min 25℃下離心5 min，去除上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗滌1次。加足夠量培養(yǎng)液輕輕吹打使其成為細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶（接種密度為5×105/mL），置于5%二氧化碳（CO2）、95%空氣、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞關(guān)鍵功能基因表達(dá)的影響心臟干細(xì)胞種板培養(yǎng)24h后，分別向細(xì)胞中加入0.1%（V/V）二甲基亞砜（DMSO）和終濃度為12.5 mg/L的腦心通混合物。孵箱中孵育8 h后，采用High Pure RNA Isolation Kit提取總RNA，采用TaqMan Reverse Transcription Rengents試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（20 μL體系），取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板2.5 μL，按照TaqManGene Expression Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，測(cè)定心臟干細(xì)胞中基因相對(duì)表達(dá)量。采用2-ΔΔCt方法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。功能基因的種類、符號(hào)及基因名見表1。

表1　功能基因的種類、符號(hào)及基因名

2.4腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞流式CXCR4表達(dá)的影響心臟干細(xì)胞種板培養(yǎng)24 h后，分別向細(xì)胞中加入0.1%（V/V）DMSO和終濃度為6.25、12.5、25 mg/L的腦心通混合物。孵箱中培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶液進(jìn)行消化，300 g下離心10 min收集細(xì)胞，Buffer洗去胰蛋白酶液。100 μL Buffer重懸細(xì)胞，加入10 μL APC Isotype Control或APC-CXCR4抗體，2～8℃下避光孵育45 min。加入適量Buffer洗去未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)APC-CXCR4的表達(dá)。

2.5蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的影響心臟干細(xì)胞種板培養(yǎng)24 h后，分別向細(xì)胞中加入0.1%（V/V）DMSO和終濃度為12.5 mg/L的腦心通混合物。孵箱中培養(yǎng)48h后，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCAProteinAssayKit對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。取20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，Anti-CXCR4 antibody（1∶2 000）、β-Actin（13E5）Rabbit mAb（1∶1 000），4℃孵育過夜。加入按一定比例稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶15 000），室溫孵育1 h后顯影。采用凝膠成像分析儀進(jìn)行電泳條帶的拍照與分析。將目的條帶與β-Actin灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6腦心通對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞遷移的影響心臟干細(xì)胞種板培養(yǎng)24 h后，分別向細(xì)胞中加入DMSO和終濃度為12.5 mg/L的NXT混合物。孵箱中培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶液進(jìn)行消化，分別用含藥1%FBS CCM全培基懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至5×104/mL。將收集到的細(xì)胞分為4組（A～D組）：A組為陰性對(duì)照組下室內(nèi)加入含0.1%（V/V）DMSO的1%FBS CCM全培基，B組下室內(nèi)加入含SDF-1α（125 μg/L）的1%FBS CCM全培基，C、D組下室內(nèi)加入SDF-1α（125 μg/L）+NXT混合物（12.5 mg/L）的1%FBS CCM全培基。在FN包被的小室的上室中，A～C組上室內(nèi)均加入200 μL細(xì)胞懸液，D組上室內(nèi)加入與100 mg/L CXCR4受體阻斷劑AMD3100共孵育30 min后的細(xì)胞懸液200 μL，將Transwell小室置孵箱中孵育。孵育4 h后，用棉簽擦掉濾膜上側(cè)沒有遷移的細(xì)胞，多聚甲醛固定20 min，D-Hanks洗2次，結(jié)晶紫染色10 min，用顯微鏡觀察染色的細(xì)胞，每個(gè)濾膜觀察6個(gè)隨機(jī)視野，進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)染色陽性的細(xì)胞。

3　結(jié)果

3.1腦心通上調(diào)心臟干細(xì)胞CXCR4基因的表達(dá)以芯片技術(shù)研究腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，心臟干細(xì)胞在孵箱中經(jīng)12.5 mg/L的腦心通混合物孵育8 h后，與空白對(duì)照組相比，腦心通能夠顯著上調(diào)心臟干細(xì)胞CXCR4基因表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），見圖1、圖2。

圖1　腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響

圖2　腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞CXCR4基因表達(dá)的影響（±s，n=3）

3.2腦心通促進(jìn)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá)以流式細(xì)胞術(shù)及蛋白免疫印跡法研究腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，腦心通促進(jìn)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），見圖3、圖4。

3.3腦心通促進(jìn)SDF-1誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞的遷移作用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1能誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞的遷移［（58.67±2.02）vs（83.80±9.19），P＜0.01，n=3］，腦心通能夠促進(jìn)SDF-1誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞CXCR4的遷移［（83.80±9.19）vs（110.93±8.97），P＜0.01，n＝3］，加入AMD3100后，可顯著抑制腦心通對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞CXCR4遷移［（110.93± 8.97）vs（65.12±9.43），P＜0.01，n=3］。見圖5。

圖3　流式鑒定腦心通對(duì)心臟干細(xì)胞CXCR4表達(dá)的影響（±s，n=6）

圖4　NXT對(duì)CSCs細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

4　討論

心臟干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)不僅改變了心臟屬于終末分化器官的傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，且為心臟疾病的治療提供了更為理想的種子細(xì)胞?，F(xiàn)階段對(duì)心臟干細(xì)胞的來源爭(zhēng)議較大，Quaini等［9］認(rèn)為心臟干細(xì)胞來源于骨髓。但是隨著研究的進(jìn)一步深入，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心臟干細(xì)胞來自心臟，心臟干細(xì)胞巢是心臟干細(xì)胞來自心臟有力的證據(jù)［10］。由于心臟干細(xì)胞能特異性分化為心系細(xì)胞，其在心臟病細(xì)胞治療方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。心臟干細(xì)胞修復(fù)心臟主要通過心臟干細(xì)胞分化潛能及其旁分泌作用［11-12］，但其具體作用機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步的研究。

圖5　腦心通對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞CXCR4遷移的影響

趨化因子是指能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的小分子細(xì)胞因子。SDF-1屬于CXC類趨化因子，又稱為CXCL12或前B刺激因子，趨化活性高于其他趨化因子，最早由Nagasawa等［13］發(fā)現(xiàn)。CXCR4屬于CXCR類趨化因子受體，是趨化因子SDF-1的特異性受體。CXCR4與SDF-1共同作用控制細(xì)胞的遷移、組織的靶向作用及歸巢，但SDF-1/CXCR4軸調(diào)控CSCs遷移、歸巢的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Tang等［14］研究發(fā)現(xiàn)CSCs細(xì)胞缺氧預(yù)處理后，能上調(diào)CXCR4的表達(dá)，并且招募至缺血心肌，減少心肌梗死面積，改善心肌梗死后的心臟功能。

本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦心通上調(diào)心臟干細(xì)胞CXCR4基因的表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot法證實(shí)了腦心通促進(jìn)心臟干細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá)，然后用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證明腦心通能通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)心臟干細(xì)胞的遷移。SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可分為G蛋白依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非G蛋白依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路兩個(gè)方面，研究發(fā)現(xiàn)非G蛋白依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p42/44MAPK信號(hào)通路和p38MAPK信號(hào)通路的活化與SDF-1誘導(dǎo)細(xì)胞的趨化、遷徙密切相關(guān)［15］，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究SDF-1/CXCR4軸調(diào)控CSCs細(xì)胞遷移的作用機(jī)制提供了思路。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)CXCR7也可以與SDF-1相結(jié)合［16］，腦心通是否能通過SDF-1/CXCR7軸促進(jìn)心臟干細(xì)胞的遷移有待進(jìn)一步的研究。

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Naoxintong extract promotes migration of cardiac stem cells through enhancing expression of CXCR4

YANG Yue1，LI Hui-ying1，ZHANG Lu-sha1，MA Ya-ke1，ZHAO Bu-chang2，JIA Li-fu2，
ZHAO Jing2，CHEN Lu1，WANG Hong1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Shanxi Buchang Pharma，Xi'an 710082，China）

［Objective］To study the effect of Naoxintong（NXT）on cardiacstem cell function and to explore its possible mechanism.［Methods］We use real-time RT-PCR array technology，Western-blot，flow cytometry and transwell methods to investigate the expression of CXCR4 on the cardiac stem/progenitor cell by NXT.［Results］The results showed that the expression of CXCR4 gene and CXCR4 protein in cardiac stem cell were both increased by NXT.［Conclusion］The migration of cardiac stem cell is promoted by NXT through the SDF-1/CXCR4 axis.

NXT；cardiac stem cells；expression of CXCR4

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0099-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173592）；新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（NCET-13-0935）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2015DFA30430）；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT1276）。

楊岳（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚?、植物雌激素類中藥研究?/p>

王虹，E-mail：wanghongsys@126.com。

（2015-11-21）