腦蛋白水解物的提取工藝優(yōu)化

黃　潔，王孝功，單　敏，田福元（.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安　70054；.西安迪賽生物藥業(yè)有限責(zé)任公司，西安　7006；.陜西萬(wàn)信醫(yī)藥采購(gòu)供應(yīng)站，陜西咸陽(yáng)　70065）

腦蛋白水解物的提取工藝優(yōu)化

黃潔1＊，王孝功2，單敏1，田福元3（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安710054；2.西安迪賽生物藥業(yè)有限責(zé)任公司，西安710016；3.陜西萬(wàn)信醫(yī)藥采購(gòu)供應(yīng)站，陜西咸陽(yáng)710065）

目的：優(yōu)化腦蛋白水解物的提取工藝。方法：以pH約為9的堿性提取液進(jìn)行提取；以總氮含量、與腦蛋白水解物（麗珠賽樂(lè)）肽圖的相似度的綜合評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化豬腦（1 kg）水解工藝中胰蛋白酶的加入量、胃蛋白酶的加入量及水解時(shí)間，并進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為胰蛋白酶加入量8 g、胃蛋白酶加入量5 g、水解時(shí)間12 h；驗(yàn)證試驗(yàn)中所制腦蛋白水解物的總氮含量分別為5.20、5.18、5.20 mg/ml（RSD＝2.22%，n＝3），肽圖相似度分別為93%、94%、96%（RSD＝1.62%，n＝3），綜合評(píng)分分別為0.911、0.917、0.932（RSD＝1.18%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的生產(chǎn)工藝合理、提取效率高，產(chǎn)物肽圖相似度高。

腦蛋白水解物；提取工藝；正交試驗(yàn)；總氮含量；肽圖相似度

腦蛋白水解物注射液是一種豬腦蛋白水解提取物，為多種游離氨基酸和低分子肽的混合注射液，是一種神經(jīng)保護(hù)劑。其具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)的類(lèi)似神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用[1]，主要用于治療顱腦外傷及腦血管病等引起的記憶力減退及注意力集中障礙，輔助治療腦功能不全，也用于治療神經(jīng)衰弱、蛋白質(zhì)缺乏及蛋白質(zhì)消化吸收障礙等[2]。本文以總氮含量和與腦蛋白水解物（麗珠賽樂(lè)）肽圖的相似度為指標(biāo)，優(yōu)化了從豬腦中提取腦蛋白水解物的工藝，以期建立一種重現(xiàn)性好、腦蛋白水解物活性更高的生產(chǎn)工藝。

1　材料

1.1儀器

1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；DK-S420型電熱恒溫水箱（上海慕航儀器設(shè)備有限公司）；Pall minimate超濾系統(tǒng)（美國(guó)Pall公司）；L-600型離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司，離心半徑：16 cm）；DS-1型組織粉碎機(jī)（上海比朗儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑

腦蛋白水解物注射液（商品名：麗珠賽樂(lè)，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠(chǎng)，批號(hào)：20140809321，規(guī)格：5 ml/支）；胰蛋白酶（批號(hào)：141043，活性：＞2 500 U/mg）、胃蛋白酶（批號(hào)：140821，活性：＞3 800 U/mg）均購(gòu)自四川德博爾制藥有限公司；乙腈為色譜純；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、三氟乙酸均為分析純。

1.3其他

豬腦（方欣肉聯(lián)廠(chǎng)）。

2　方法與結(jié)果

2.1滴定法測(cè)定總氮含量

參照注射用腦蛋白水解物征求意見(jiàn)稿[3]，取腦蛋白水解物，加水稀釋至適宜濃度，作為供試品溶液，依法測(cè)定[4]。精密量取供試品溶液約2 ml，置于燒瓶中，加入硫酸銅試液2滴，再加入濃硫酸5 ml，小火消化4 h，放冷。全部轉(zhuǎn)移至蒸餾瓶中，加入40%氫氧化鈉溶液10 ml。取2%硼酸溶液10 ml，置于100 ml錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴，將冷凝管尖端插入液面下，加熱，進(jìn)行蒸汽蒸餾，至硼酸溶液開(kāi)始由酒紅色變?yōu)樗{(lán)綠色時(shí)起，繼續(xù)蒸餾約10 min后，將冷凝管尖端提出液面，使蒸汽繼續(xù)沖洗約1 min，用水淋洗尖端后停止蒸餾。餾出液用硫酸滴定液（0.005 mol/L）滴定至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙?，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 ml硫酸滴定液（0.005mol/L）相當(dāng)于0.1401mg的氮。

2.2高效液相色譜法測(cè)定腦蛋白水解物的條件

參照注射用腦蛋白水解物征求意見(jiàn)稿[3]，精密取麗珠賽樂(lè)適量，加水溶解并稀釋制成每1 ml中約含總氮6 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。色譜條件：C18（250 mm×4 mm，5 μm），以0.1%三氟醋酸溶液為流動(dòng)相A，0.085%三氟醋酸乙腈溶液-0.1%三氟醋酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，進(jìn)樣量為20 μl。精密量取供試品或?qū)φ掌啡芤焊?0 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)[4]考察其相似度。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Conditions of gradient elution

2.3以總氮含量和肽圖相似度為指標(biāo)篩選腦蛋白水解物提取試劑

按照豬腦-提取試劑1∶3的比例向豬腦中分別加入pH約為3～4的鹽酸溶液（酸性提取試劑）、pH近中性的純化水（中性提取試劑）及pH約為9的氫氧化鈉溶液（堿性提取試劑），于37水浴孵化30 min，4 000 r/min（離心半徑為16 cm）離心20 min，取上清液。

2.3.1總氮含量按“2.1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定經(jīng)酸性、中性、堿性提取試劑提取后的上清液中的總氮含量。結(jié)果分別為1.16、4.98、5.21 mg/ml，表明堿性提取試劑提取的上清液中總氮含量最高。

2.3.2肽圖相似度按“2.2”項(xiàng)下方法分別測(cè)定酸性、中性、堿性提取試劑提取后的上清液和麗珠賽樂(lè)的高效液相色譜圖，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatograms

經(jīng)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)，酸性、中性、堿性提取試劑提取后的上清液與麗珠賽樂(lè)的相似度分別為8%、9%、13%，表明堿性條件下相似度最高。最終確定提取試劑為pH約為9的氫氧化鈉溶液。

2.4正交試驗(yàn)優(yōu)化腦蛋白水解物提取工藝

2.4.1因素與水平的確定為了進(jìn)一步提高提取后上清液中總氮含量，將提取后上清液分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶水解一定時(shí)間。取提取后的上清液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為8.5～9.5，加入胰蛋白酶水解t1時(shí)間，再用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～2，加入胃蛋白酶水解t2時(shí)間。胰蛋白酶和胃蛋白酶水解總時(shí)間（t1+ t2）即水解時(shí)間，t1∶t2＝3∶1。采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化豬腦（1 kg）水解工藝中胰蛋白酶的加入量（A，g）、胃蛋白酶的加入量（B，g）及水解時(shí)間（C，h），因素與水平見(jiàn)表2。

表2　因素與水平Tab 2　Factors and levels

2.4.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果根據(jù)“2.4.1”項(xiàng)下因素與水平，以總氮含量與麗珠賽樂(lè)肽圖的相似度的綜合評(píng)分為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝，其中總氮含量權(quán)重占30%，相似度權(quán)重占70%。將含總氮6 mg/ml作為1，測(cè)定出的總氮含量按此標(biāo)準(zhǔn)換算并乘以權(quán)重占有比例即為總氮的分值。將肽圖輸入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，給出的相似度作為肽圖的分值，乘以權(quán)重占有比例即為肽圖的分值。2項(xiàng)分值之和即為綜合評(píng)分結(jié)果。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3　Orthogonal design and results

表4　方差分析結(jié)果Tab 4　Result of variance analysis

由表3和表4可知，3因素對(duì)綜合評(píng)分影響的強(qiáng)弱依次為A＞B＞C，其中A和B對(duì)綜合評(píng)分有顯著影響（P＜0.05）。綜合考慮，最優(yōu)提取工藝為A3B2C3，即豬腦（1 kg）水解工藝中胰蛋白酶加入8g、胃蛋白酶加入5g、水解時(shí)間12h。

2.4.3驗(yàn)證試驗(yàn)按照最優(yōu)提取工藝提取豬腦蛋白水解物，重復(fù)試驗(yàn)3次，分別測(cè)定提取液中總氮含量，比較與麗珠賽樂(lè)肽圖的相似度，計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果平均總氮含量為5.19 mg/ml（RSD＝2.22%，n＝3），平均肽圖相似度為94.33%（RSD＝1.62%，n＝3），平均綜合評(píng)分為0.92（RSD＝1.18%，n＝3）。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5純化工藝

腦蛋白水解物提取液首先采用5 kDa超濾膜包超濾，收集透過(guò)液后進(jìn)一步層析柱純化。首先采用反相色譜，C8柱（250 mm×21.2 mm，10 μm），以0.1%三氟醋酸溶液為流動(dòng)相A，0.085%三氟醋酸乙醇溶液-0.1%三氟醋酸溶液（85∶15）為流動(dòng)相B（先以B相流洗2個(gè)柱體積，再以A相平衡5個(gè)柱體積，上樣，A相流洗約2個(gè)柱體積，12%B洗脫約1.5個(gè)柱體積，洗脫峰丟棄，35%B相洗脫約2個(gè)柱體積，收集洗脫峰），流速為100 ml/min。收集的洗脫液繼續(xù)采用G25層析柱進(jìn)行脫鹽，先用流動(dòng)相注射用水平衡色譜柱約10個(gè)柱體積，上樣，繼續(xù)用注射用水流洗，收集色譜峰，即為腦蛋白水解物提取液樣品。測(cè)定其總氮含量并與麗珠賽樂(lè)肽圖進(jìn)行比較，結(jié)果，總氮含量為10.52 mg/ml（RSD＝1.1%，n＝3），肽圖相似度均大于95%。

表5　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 5　Results of verification test

2.6腦蛋白水解物活力的比較

參照注射用腦蛋白水解物征求意見(jiàn)稿[3]進(jìn)行測(cè)定。比較麗珠賽樂(lè)與按本文方法制備的3批腦蛋白水解物的活力，結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，上述腦蛋白水解物的活力分別為（57.96±4.44）%、（95.77±7.09）%、（97.23±8.08）%、（92.51± 6.74）%，與麗珠賽樂(lè)比較的P均小于0.05，表明本文方法制備的腦蛋白水解物的活力更高。

3　討論

腦蛋白水解物注射液是以新鮮的豬腦為原料，經(jīng)過(guò)提取、酶解、超濾等過(guò)程制成的無(wú)菌制劑，主要成分為腦神經(jīng)肽、各種氨基酸，臨床上主要用于顱腦損傷、腦血管后遺癥狀的改善等，療效確切，臨床應(yīng)用廣泛[5-6]。原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2008年12月15日發(fā)布的《關(guān)于加強(qiáng)腦蛋白水解物注射液監(jiān)督檢查的通知》（國(guó)食藥監(jiān)辦〔2008〕734號(hào)）[7]指出在全國(guó)開(kāi)展的注射劑類(lèi)藥品生產(chǎn)工藝和處方核查工作中發(fā)現(xiàn)，腦蛋白水解物注射劑在藥品標(biāo)準(zhǔn)和執(zhí)行工藝處方等方面存在著較為突出的問(wèn)題，主要是企業(yè)選用豬腦原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善；企業(yè)之間現(xiàn)行生產(chǎn)工藝差別較大；豬腦水解所用的蛋白酶種類(lèi)、酶量及水解溫度、時(shí)間等不一致，甚至有補(bǔ)加氨基酸的行為。這些行為大大降低了腦蛋白水解物注射液的療效，同時(shí)導(dǎo)致不良反應(yīng)大大增加[8]。本研究以麗珠賽樂(lè)作為對(duì)照品，以肽圖相似度、總氮含量為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)提取試劑的選取、水解工藝的優(yōu)化，結(jié)合層析工藝，生產(chǎn)出了比麗珠賽樂(lè)總氮含量更高、活力更強(qiáng)的腦蛋白水解物。連續(xù)3次的中試生產(chǎn)表明，本工藝穩(wěn)定可控，可以用于腦蛋白水解物的生產(chǎn)。

與采用超濾工藝的常規(guī)腦蛋白水解物的生產(chǎn)工藝相比，本研究在超濾工藝的基礎(chǔ)上增加了層析工藝。層析工藝一般多用于基因工程產(chǎn)品，如蛋白質(zhì)及多肽、疫苗等的純化，用于去除雜質(zhì)、內(nèi)毒素、病毒等，具有操作條件溫和、效率高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。常用的層析工藝包括離子離子交換色譜（IEC）、反相液相色譜、親和色譜（Affinity chromatography）、凝膠過(guò)濾色譜（Gel filtration chromatography）等。生化藥大多來(lái)源于新鮮的動(dòng)物臟器，有效成分復(fù)雜。根據(jù)生化藥的這個(gè)特點(diǎn)，結(jié)合腦蛋白注射液的質(zhì)量研究標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿，本研究?jī)?yōu)選采用反相液相色譜和凝膠過(guò)濾色譜。根據(jù)多肽、氨基酸等的疏水性，以C8（250 mm×21.2 mm，10 μm）制備色譜柱首先純化出具有生物活性的腦蛋白產(chǎn)品，然后進(jìn)一步采用G25進(jìn)行凝膠層析，不但可以去除反相液相色譜中引入的有機(jī)試劑，同時(shí)也去除了原料及前述操作過(guò)程中可能引入的內(nèi)毒素等物質(zhì)，進(jìn)一步提升了產(chǎn)品的安全性。相比生化藥生產(chǎn)常用的超濾過(guò)程，本操作雖然具有使用成本高的缺點(diǎn)，但其生產(chǎn)的產(chǎn)品具有均一性好、各成分相對(duì)恒定的特點(diǎn)，為腦蛋白水解物的質(zhì)量控制及有效性的進(jìn)一步研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為規(guī)范腦蛋白水解物注射液的生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。

[1]于秀軍，楯林義孝，郭力.腦蛋白水解物注射液對(duì)NG2蛋白聚糖陽(yáng)性神經(jīng)祖細(xì)胞分化的影響[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2010，18（1）：21.

[2]鄧鋒，梁蔚陽(yáng).氨基酸分析法測(cè)定腦蛋白水解物注射液中肽的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：2001.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).關(guān)于注射用腦蛋白水解物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的公示[ED/OL].（2015-11-26）[2016-01-04].http：//www. chp.org.cn/view/ff80808150c920700151427525de75ef?a= BZHXYP.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：59-61，88-89.

[5]Ubhi K，Rockenstein E，Vazquez-roque R，et al.Cerebrolysin modulates pronerve growth factor/nerve growth factor ratio and ameliorates the cholinergic deficit in a transgenic model of Alzheimer’s disease[J].J Neurosci Res，2013，91（2）：167.

[6]Panisset M，Gauthie RS，Moessle RH，et al.Cerebrolysin in Alzheimer’s disease：a randomized，double-blind，placebocontrolled trial with a neurotrophic agent[J].J Neural Transm，2002，109（7/8）：1089.

[7]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于加強(qiáng)腦蛋白水解物注射液監(jiān)督檢查的通知[S].2008-12.

[8]楊彥彪，張志葉，魏春華.腦蛋白水解物制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及不良反應(yīng)[J].中國(guó)藥房，2012，23（1）：82.

（編輯：鄒麗娟）

Optimization of the Extraction Technology of Cerebroprotein Hydrolyzate

HUANG Jie1，WANG Xiaogong2，SHAN Min1，TIAN Fuyuan3（1.Xi’an Institute for Food and Drug Control，Xi’an 710054，China；2.Xi’an Disai Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xi’an 710016，China；3.Shaanxi Wanxin Medicine Procurement and Supply Station，Shaanxi Xianyang 710065，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of cerebroprotein hydrolyzate.METHODS：It was extracted by alkaline extraction solution with pH approximately 9；using the comprehensive score of similarities of total nitrogen content and peptide map of cerebroprotein hydrolyzate（cerebrolisin）as index，L9（34）orthogonal test was conducted to optimize the addition amounts of trypsin and pepsin，and hydrolysis time in pig brain（1 kg）hydrolysis technology，and the optimized technology was verified.RESULTS：Optimized extraction technology was as follows as trypsin adding 8 g，pepsin adding 5 g，hydrolysis time 12 h；the total nitrogen contents of obtained cerebroprotein hydrolyzate were 5.20，5.18，5.20 mg/ml（RSD＝2.22%，n＝3），peptide figure similarities were 93%，94%，96%（RSD＝1.62%，n＝3），comprehensive scores were 0.911，0.917，0.932（RSD＝1.18%，n＝3），respectively.CONCLUSIONS：The optimized technology is rational with high extraction rate and peptide map similarity.

Cerebroprotein hydrolyzate；Extraction technology；Orthogonal test；Total nitrogen content；Peptide map similarity

R977.4；R943

A

1001-0408（2016）28-3985-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.30

＊主管藥師，碩士。研究方向：化學(xué)藥物分析。電話(huà)：029-85533639。E-mail：hj810726@126.com

（2016-02-06

2016-05-20）