多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化女貞子中環(huán)烯醚萜苷的提取工藝Δ

楊　陽，易　駿，馬　利，吳建國，吳錦忠，吳巖斌#（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州　350；.福建教育學(xué)院理科部，福州　35005）

多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化女貞子中環(huán)烯醚萜苷的提取工藝Δ

楊陽1＊，易駿2，馬利1，吳建國1，吳錦忠1，吳巖斌1#（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州350122；2.福建教育學(xué)院理科部，福州350025）

目的：優(yōu)化女貞子中環(huán)烯醚萜苷成分的提取工藝。方法：以特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的含量為考察指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)對女貞子中環(huán)烯醚萜苷類成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：4種因素對女貞子環(huán)烯醚萜苷類成分的提取量均有顯著影響，并以提取次數(shù)的影響最為顯著；最優(yōu)提取工藝為14倍量70%乙醇回流提取3次，每次2.5 h；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果中環(huán)烯醚萜苷總含量平均值為83.58 mg/g（RSD＝0.94%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、合理，可用于女貞子中環(huán)烯醚萜苷類成分的提取。

女貞子；環(huán)烯醚萜苷；正交試驗(yàn)；提取工藝；特女貞苷；橄欖苦苷；女貞苷G13

女貞子為木犀科植物女貞Ligubtrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明、內(nèi)熱消渴、骨蒸潮熱等[1]，主產(chǎn)于江蘇、河南、山西、甘肅等地[2]。研究表明，女貞子主要含有環(huán)烯醚萜、三萜、苯乙醇和黃酮類化合物，具有保肝、抗腫瘤、降血糖、抗氧化和抗骨質(zhì)疏松等多種藥理活性[3-7]。女貞子中的環(huán)烯醚萜類成分含量較高，其主要活性成分特女貞苷的定量測定也已經(jīng)納入到《中國藥典》女貞子藥材和飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，女貞子的環(huán)烯醚萜苷類成分具有抗骨質(zhì)疏松、抗病毒、抗氧化等多種生物活性[8-11]，因此，研究女貞子環(huán)烯醚萜類成分的提取工藝可為有效利用其資源提供科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)以女貞子中的3種環(huán)烯醚萜苷類成分，即特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化女貞子中環(huán)烯醚萜苷的提取工藝，為女貞子環(huán)烯醚萜苷類成分的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1　特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1　Chemical structure of specnuezhenide，oleuropein and nuezhenoside G13

1　材料

1.1儀器

LC-20A高效液相色譜（HPLC）儀-紫外檢測器（日本島津公司）；MS105DU電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；FW-135中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-S水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2藥材、對照品與試劑

中藥女貞子采自福建福州（批號：2014-12-13，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院吳錦忠教授鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實(shí)。將女貞子藥材用中草藥粉碎機(jī)粉碎并過40目篩，備用）；特女貞苷（批號：2014-03-08）、橄欖苦苷（批號：2014-04-12）和女貞苷G13（批號：2014-03-13）均為課題組自制（經(jīng)面積歸一化法測定純度在98%以上）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1環(huán)烯醚萜苷類成分含量測定方法的建立[12]

2.1.1色譜條件色譜柱為YMC-Pack-ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫（0～15 min，20%～26%乙腈；15～30 min，32%乙腈）；流速為1 ml/ min；進(jìn)樣量為20 μl；柱溫為30；紫外檢測器，檢測波長為250 nm。按上述色譜條件，取“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下各對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度均大于1.5。色譜圖見圖2。

圖2　高效液相色譜圖A.對照品混合溶液；B.供試品溶液；1.特女貞苷；2.橄欖苦苷；3.女貞苷G13Fig 2　HPLC chromatograms A.mixed control solution；B.sample solution；1.specnuezhenide；2. oleuropein；3.nuezhenoside G13

2.1.2對照品溶液的制備分別精密稱取五氧化二磷減壓干燥24 h的特女貞苷5 120 μg、橄欖苦苷4 990 μg、女貞苷G13 3 650 μg分別置于5 ml量瓶中，用20%甲醇在400 W功率下超聲30 s溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成含特女貞苷1 024 μg/ml、橄欖苦苷998 μg/ml、女貞苷G13 730 μg/ml的對照品貯備液及相應(yīng)的對照品混合溶液。

2.1.3供試品溶液的制備精密稱取女貞子藥材粉末0.2 g，置于100 ml量瓶中，加入100 ml 70%乙醇，精密稱定，在400 W功率條件下超聲提取45 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4線性關(guān)系考察精密量取“2.1.2”項(xiàng)下制備的3個對照品貯備液，用20%甲醇逐級稀釋，使特女貞苷質(zhì)量濃度分別為204.8、102.4、51.2、25.6、12.8、6.4 μg/ml，橄欖苦苷質(zhì)量濃度分別為49.9、19.96、9.98、4.99、2.495、1.248 μg/ml，女貞苷G13質(zhì)量濃度分別為365、146、73、36.5、18.25、9.125 μg/ml，搖勻，過微孔濾膜（0.22 μm）。取續(xù)濾液各20 μl進(jìn)樣，記錄各對照品的峰面積（y）。以各成分質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；以信噪比10∶1為基準(zhǔn)測得各成分的定量限，結(jié)果見表1。

表1　3種成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1　Linear results of 3components

2.1.5精密度試驗(yàn)吸取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的峰面積，計算各峰面積的RSD，結(jié)果分別為0.90%、0.48%、0.90%（n＝6），表明本法精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的峰面積，計算各峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.00%、0.75%、1.07%（n＝6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收法，在已知含量樣品中加入定量對照品制備成供試品溶液后進(jìn)樣測定，計算特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13的平均回收率，結(jié)果分別為98.60%、98.64%、100.65%，RSD分別為1.34%、1.88%、1.67%（n＝6），表明本法準(zhǔn)確度良好。

2.1.8樣品中3種成分的含量測定取對照品及供試品溶液各20 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算峰面積，按外標(biāo)法計算特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的含量。

2.2單因素試驗(yàn)考察提取溶劑及溶劑量

由于環(huán)烯醚萜苷類是強(qiáng)極性成分，在醇水系統(tǒng)中具有較高的溶解性，故本試驗(yàn)選用常用溶劑水及不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取溶劑，并采用常用的回流提取方法對提取溶劑及溶劑倍量進(jìn)行考察。

2.2.1提取溶劑準(zhǔn)確稱取女貞子藥材粉末5 g，分別用10倍量的水以及10%、30%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇回流提取1次，每次2 h，過濾，減壓濃縮后，以20%甲醇溶解定容至100 ml，再取2 ml至50 ml量瓶中，定容。采用HPLC法測定不同提取液中3種環(huán)烯醚萜苷成分的含量并計算總含量，結(jié)果見表2。

表2　采用不同提取溶劑時各指標(biāo)成分含量（mg/g）Tab 2　The contents of each component by using different extraction solvents（mg/g）

由表2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，女貞子環(huán)烯醚萜苷類成分的提取量先增加后下降。綜合各指標(biāo)結(jié)果以60%、70%、80%乙醇提取得到指標(biāo)成分含量較高，因此選擇60%、70%、80%乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2溶劑倍量準(zhǔn)確稱取女貞子藥材粉末5 g，分別加入8、10、12、14、16、18倍的70%乙醇回流提取1次，每次2 h，過濾，合并濾液，同“2.2.1”項(xiàng)下方法操作測定，結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著溶劑倍量的增加，環(huán)烯醚萜苷類成分的提取量增加，以14、16、18溶劑倍量提取得到的指標(biāo)成分含量較高，因此選擇14、16、18溶劑倍量進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果及考慮影響提取效果的其他因素，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A，%）、溶劑倍量（B）、提取時間（C，h）、提取次數(shù)（D）為考察因素，以環(huán)烯醚萜苷類成分的提取量（總含量）為考察指標(biāo)，設(shè)計正交試驗(yàn)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。藥材取量及提取液的處理、測定同“2.2.1”項(xiàng)下方法。因素與水平見表4，正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表3　采用不同提取溶劑倍量時各指標(biāo)成分含量（mg/g）Tab 3　The contents of each component by using different folds of extraction solvents（mg/g）

表4　因素與水平Tab 4　Factors and levels

表5　正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果（±s，n＝3）Tab 5　Design and results of orthogonal test（±s，n＝3）

表5　正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果（±s，n＝3）Tab 5　Design and results of orthogonal test（±s，n＝3）

因素　指標(biāo)試驗(yàn)號B C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 D　1 2 3 3 1 2 2 3 1特女貞苷含量，mg/g 29.41±0.22 32.24±0.21 34.91±0.19 35.90±0.45 30.94±0.42 33.07±0.36 34.37±0.09 34.40±0.38 30.17±0.24女貞苷G13含量，mg/g 37.42±0.33 41.03±0.25 44.44±0.25 45.77±0.46 39.34±0.56 40.64±0.52 42.81±0.08 42.88±0.41 36.20±0.34 14 16 18 14 16 18 14 16 18 78.05 76.37 75.97 2.08總含量，mg/g 69.38±0.59 76.09±0.48 82.29±0.42 84.70±0.94 72.83±1.00 76.27±0.89 80.26±0.08 80.30±0.80 69.25±0.56 1.5 2 2.5 2 2.5 1.5 2.5 1.5 2 75.52 76.54 78.34 2.82 R K1　K2　K3 A 60 60 60 70 70 70 80 80 80 75.83 77.93 76.64 2.10橄欖苦苷含量，mg/g 2.55±0.04 2.82±0.03 2.95±0.01 3.02±0.03 2.56±0.03 2.87±0.01 3.08±0.02 3.04±0.03 2.84±0.02 70.33 77.64 82.42 12.10

表6　方差分析結(jié)果Tab 6　Variance analysis results

表5結(jié)果表明，各因素對總含量的影響大小依次為D＞C＞A＞B，其中，提取次數(shù)D是最主要因素。表6結(jié)果表明，4個因素均對總含量具有顯著影響（P＝0.000）。經(jīng)綜合考慮，確定最優(yōu)提取工藝為A2B1C3D3，即14倍量70%乙醇提取3次，每次2.5h。

驗(yàn)證試驗(yàn)分別稱取女貞子藥材粉末3份，每份150 g，按最優(yōu)提取工藝進(jìn)行提取。結(jié)果指標(biāo)成分總含量的平均值為83.58 mg/g，RSD＝0.94%（n＝3），表明特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的提取量均較高，優(yōu)化后的工藝條件穩(wěn)定、合理。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果詳見表7。

表7　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（mg/g）Tab 7　Verification test results（mg/g）

3　討論

本試驗(yàn)以女貞子中3種代表性環(huán)烯醚萜苷類成分為考察指標(biāo)，進(jìn)行了女貞子提取條件的優(yōu)化。為了安排盡可能多的影響因素，采用了4因素3水平無空白列的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本文建立的提取工藝合理可行，有效成分提取量符合相關(guān)要求。以特女貞苷為例，當(dāng)以70%乙醇為溶劑時，按最優(yōu)提取工藝可從50 g女貞子藥材中提取得到1 770.5（50× 35.41）mg的特女貞苷，折合藥材含量為3.419%，超過《中國藥典》規(guī)定的女貞子藥材中特女貞苷的最低含量（《中國藥典》2010年版和2015年版規(guī)定女貞子藥材中特女貞苷的含量不得低于0.7%）。

目前雖有女貞子中環(huán)烯醚萜總苷提取工藝的文獻(xiàn)報道，但其含量測定是以女貞子中環(huán)烯醚萜苷堿水解后生成的紅景天苷為對照品，采用HPLC法測定女貞子提取物水解后紅景天苷的量，以此來計算女貞子中環(huán)烯醚萜總苷的含量[13]。該法考察指標(biāo)單一，不能全面代表環(huán)烯醚萜苷類成分的含量，且堿水解受多種因素影響，未能完全反映出女貞子中環(huán)烯醚萜苷的真實(shí)含量，也未能體現(xiàn)出女貞子中主要的環(huán)烯醚萜類化合物特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13的含量。因此，本試驗(yàn)以特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13含量為考察指標(biāo)，試驗(yàn)更全面、合理。

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（編輯：劉萍）

Optimization of Extraction Process for Iridoid Glycosides from Ligustrum lucidum by Multi-index Orthogonal Test

YANG Yang1，YI Jun2，MA Li1，WU Jianguo1，WU Jinzhong1，WU Yanbin1（1.Academy of Integrated Traditional and Western Medicine，F(xiàn)ujian University of TCM，F(xiàn)uzhou 350122，China；2.Dept.of Science，F(xiàn)ujian Institute of Education，F(xiàn)uzhou 350025，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction process for iridoid glycosides from Ligustrum lucidum.METHODS：Using the contents of specnuezhenide，oleuropein and nuezhenoside G13 as parameters，the extraction technology of iridoid glycosides from L.lucidum was optimized by orthogonal test with the concentration of ethanol，solvent volume，extraction time and extraction times as factors.The verification test was conducted.RESULTS：4 factors significantly affected the extraction amount of iridoid glycosides from L.lucidum，with the most prominent effect exerted by extraction times.The optimal extraction process was refluxing 3 times with 14-fold 70%ethanol，2.5 h each time.The validation test showed that the average total content of iridoid glycosides from L.lucidum was 83.58 mg/g（RSD＝0.94%，n＝3）.CONCLUSIONS：The optimal extraction process is stable and reasonable，and can be used for the extraction of iridoid glycosides from L.lucidum.

Ligustrum lucidum；Iridoid glycosides；Orthogonal test；Extraction process；Specnuezhenide；Oleuropein；Nuezhenoside G13

R285.2；R284.2

A

1001-0408（2016）28-3970-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.25

福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（No.2015Y0070，2014Y0049）；福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計劃項(xiàng)目（No.2014-S-w12）

＊碩士研究生。研究方向：中藥資源及品質(zhì)評價。E-mail：yyang021@163.com

助理研究員，碩士。研究方向：中藥活性成分及品質(zhì)評價。電話：0591-22861166。E-mail：wxsq1@163.com

（2016-03-23

2016-06-03）