清胰解毒方對(duì)ERCP術(shù)后胰腺炎模型大鼠的改善作用Δ

余金鐘，黨中勤，張勤生，李　波，黨志博（.河南省中醫(yī)院肝膽脾胃病科，鄭州　45000；.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京　0009）

清胰解毒方對(duì)ERCP術(shù)后胰腺炎模型大鼠的改善作用Δ

余金鐘1＊，黨中勤1#，張勤生1，李波1，黨志博2（1.河南省中醫(yī)院肝膽脾胃病科，鄭州450002；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京100029）

目的：考察清胰解毒方對(duì)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)（ERCP）后胰腺炎大鼠的改善作用。方法：將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組（奧曲肽注射液50 μg/kg，sc）和清胰解毒方高、中、低劑量組[56.5、33.9、11.3 g（生藥）/kg，ig]，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠復(fù)制ERCP術(shù)后胰腺炎模型。成模后，各給藥組大鼠給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組大鼠ig蒸餾水。測(cè)定大鼠血清中白細(xì)胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、胃動(dòng)素和淀粉酶水平；觀察胰腺組織病理變化，并進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果：與正常組比較，模型組和各給藥組大鼠血清中淀粉酶、TNF-α水平顯著升高，胃動(dòng)素、IL-10水平顯著降低（P＜0.05）；胰腺組織發(fā)生明顯炎性病變，病理評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標(biāo)均得到顯著改善，且清胰解毒方各劑量組改善程度優(yōu)于陽性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：清胰解毒方對(duì)大鼠ERCP術(shù)后胰腺炎有一定的改善作用，能夠降低血清中淀粉酶、TNF-α水平，升高血清中胃動(dòng)素和IL-10水平。

清胰解毒方；胰腺炎；內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)；大鼠

內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)（ERCP）是目前診療膽胰疾病的關(guān)鍵手段，術(shù)后胰腺炎為常見及嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。其發(fā)病機(jī)制不明確，多認(rèn)為與乳頭插管所致膽胰壺腹括約肌痙攣、乳頭水腫引起胰液排除受阻，造成胰腺內(nèi)胰酶激活引起胰腺組織自身消化有關(guān)[2]。且造影劑的使用也是誘發(fā)ERCP術(shù)后胰腺炎的重要原因，造影劑滲透壓、離子濃度均與造影后不良反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。此外，操作者技術(shù)因素、腸道菌群失調(diào)亦與ERCP術(shù)后胰腺炎發(fā)病有關(guān)。目前，西醫(yī)方面常采用抑制胰酶分泌類藥物及生長(zhǎng)抑素藥物治療ERCP術(shù)后胰腺炎，但效果并不理想[3]。中醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)則認(rèn)為，熱毒不瀉、脾胃功能紊亂、濕熱郁結(jié)、肝膽不利、氣滯血瘀、臟腑不暢均與胰腺炎發(fā)病相關(guān)，其以腹痛為主癥，治療應(yīng)以疏肝理氣、清熱解毒、活血化瘀為主，以抗炎、抑菌、利膽為輔[4]。且中醫(yī)藥治療ERCP術(shù)后胰腺炎具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)綜合優(yōu)勢(shì)，在保護(hù)腸道屏障、下調(diào)炎癥因子表達(dá)方面有重要作用。

清胰解毒方為河南省中醫(yī)院研制而成的中藥復(fù)方制劑，由生大黃、蒲公英、厚樸、黃連、白芍、芒硝、桃仁、柴胡等8味藥材組成，具有清熱解毒、通里攻下、疏肝解郁之效，對(duì)重癥急性胰腺炎療效明顯[5]，但是尚未見其用于ERCP術(shù)后胰腺炎的研究。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬建立ERCP術(shù)后胰腺炎大鼠模型，以清胰解毒方進(jìn)行治療，采用免疫組化法、病理組織形態(tài)觀察來評(píng)價(jià)該方對(duì)大鼠ERCP術(shù)后胰腺炎的改善作用，為其臨床上用于治療ERCP術(shù)后胰腺炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

CX23光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Ventana-ES全自動(dòng)免疫組化儀（美國(guó)Ventana公司）；Q500MC圖像分析軟件（德國(guó)Leica公司）；低速臺(tái)式平衡離心機(jī)（德國(guó)西門子公司）。

1.2藥品與試劑

清胰解毒方[生大黃30 g、蒲公英30 g、厚樸25 g、黃連25 g、白芍15 g、芒硝15 g、桃仁12 g、柴胡10 g，由河南省中醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：0309147，規(guī)格：1 g（生藥）/ml]；奧曲肽注射液（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：090602，規(guī)格：1 ml∶0.1 mg）；泛影葡胺注射液（西安力邦制藥有限公司，批號(hào)：88604，規(guī)格：1 ml∶0.3 g）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海美軒生物科技有限公司，批號(hào)：MHT056）；白細(xì)胞介素10（IL-10）ELISA試劑盒（上海依科賽生物科技有限公司，批號(hào)：ER004）；胃動(dòng)素試劑盒（上海樊克生物科技有限公司，批號(hào)：FK-NB1505）；淀粉酶試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司，批號(hào)：JKSJ2381）；其余試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠，60只，♀♂各半，體質(zhì)量（185±15）g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限有限公司[使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2004-0012]。

2　方法

2.1分組、造模與給藥

2.1.1分組所有大鼠均在20℃環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組與清胰解毒方低、中、高劑量組，每組10只。

2.1.2造模除正常組外，其余各組大鼠均采用3%異戊巴比妥鈉麻醉，消毒，劍突兩橫指處開腹10 mm，游離胃幽門部，自十二指腸上段定位主胰管，進(jìn)入十二指腸，剪開對(duì)側(cè)腸壁2 mm，暴露主胰管開口處乳頭括約肌，逆行灌注泛影葡胺（0.5 ml/kg），壓力為50 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）。5 min后若胰腺出現(xiàn)片狀充血、水腫則為建模成功[6]。然后用絲線結(jié)扎主胰管遠(yuǎn)端，關(guān)腹。

2.1.3給藥正常組和模型組大鼠ig蒸餾水（7.5 ml/kg）；陽性對(duì)照組大鼠sc奧曲肽（50 μg/kg，人臨床等效劑量）；清胰解毒方低、中、高劑量組大鼠分別ig清胰解毒方11.3、33.9、56.5 g（生藥）/kg（根據(jù)體表面積法換算，分別為人臨床用量的10、20、30倍劑量）。每6h給藥1次，共給藥4次。

2.2標(biāo)本采集

末次給藥24 h后，采用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定于鼠板，腹部正中切口，顯露腹腔，分離腹主動(dòng)脈，針管穿刺，抽取血液6 ml。血樣置于37℃恒溫箱中水浴30 min，離心，取上層血清，用于血清中TNF-α、IL-10、胃動(dòng)素和淀粉酶水平的檢測(cè)。同時(shí)采集胰腺組織，用于病理觀察。

2.3指標(biāo)測(cè)定

2.3.1血清中胃動(dòng)素和淀粉酶水平采用放射免疫法，按照試劑盒說明書測(cè)定各組大鼠血清中胃動(dòng)素和淀粉酶水平。

2.3.2血清中TNF-α、IL-10水平采用ELISA法，按照相應(yīng)試劑盒說明書測(cè)定血清中TNF-α、IL-10水平。

2.3.3組織病理學(xué)檢查取大鼠胰腺組織，置于10%福爾馬林溶液中固定12 h，常規(guī)方法制備石蠟切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。參考文獻(xiàn)[7]采用4級(jí)評(píng)分法對(duì)大鼠胰腺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脂肪壞死和實(shí)質(zhì)壞死4項(xiàng)內(nèi)容分別進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)評(píng)分均為1～4分：1分為正常，2分為輕度病變，3分中度病變，4分為重度病變。計(jì)算4項(xiàng)合計(jì)總分，得分越高表示大鼠胰腺組織病變?cè)絿?yán)重。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1各組大鼠血清中淀粉酶、胃動(dòng)素、TNF-α和IL-10水平測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組和各給藥組大鼠血清中淀粉酶和TNF-α水平明顯升高，胃動(dòng)素和IL-10水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中淀粉酶和TNF-α水平明顯降低，胃動(dòng)素和IL-10水平明顯升高，且清胰解毒方各劑量組作用均強(qiáng)于陽性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠血清中淀粉酶、胃動(dòng)素、TNF-α和IL-10水平測(cè)定結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠血清中淀粉酶、胃動(dòng)素、TNF-α和IL-10水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1　Serum levels of amylase，motilin，TNF-α and IL-10 of rats in each group（±s，n＝10）

表1　各組大鼠血清中淀粉酶、胃動(dòng)素、TNF-α和IL-10水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1　Serum levels of amylase，motilin，TNF-α and IL-10 of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. positive control group，ΔP＜0.05

IL-10，pg/ml 288.74±88.71 169.68±49.86＊184.94±27.49＊#230.93±38.18＊#Δ235.46±42.26＊#Δ241.78±50.36＊#Δ組別正常組模型組陽性對(duì)照組清胰解毒方低劑量組清胰解毒方中劑量組清胰解毒方高劑量組淀粉酶，U/L 1 382.87±198.54 6 152.51±131.11＊4 206.87±131.14＊#3 646.47±139.24＊#Δ3 549.14±150.18＊#Δ3 464.79±178.98＊#Δ胃動(dòng)素，pg/ml 82.95±3.42 45.87±2.86＊63.92±0.79＊#72.82±4.32＊#Δ72.37±5.61＊#Δ71.89±4.68＊#ΔTNF-α，pg/ml 20.51±8.63 44.32±10.12＊34.71±10.29＊#24.48±6.47#Δ23.57±5.76#Δ22.98±7.36#Δ

3.2病理觀察結(jié)果

與正常組[總分為（1.43±1.24）分]比較，模型組、陽性對(duì)照組和清胰解毒方高、中、低劑量組大鼠胰腺組織病理評(píng)分[分別為（11.63±3.11）、（9.61±1.05）、（7.98±1.20）、（7.69±1.55）、（7.31±1.76）分]均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠在給藥后胰腺組織炎性病變均顯著改善，總評(píng)分顯著降低（P＜0.05），且清胰解毒方各劑量組較陽性對(duì)照組降低更為明顯（P＜0.05）。各組大鼠胰腺組織病理切片圖見圖1。

4　討論

在中醫(yī)學(xué)上尚無ERCP術(shù)后胰腺炎的確切病名，根據(jù)癥狀將其納入“脾心痛”范疇?！秲?nèi)經(jīng)》指出：“脾熱病，煩心顏青，腹?jié)M瀉?！薄鹅`柩》載：“腹脹胸滿，心痛甚者，胃心痛……若椎針刺其心，脾心痛也”，其認(rèn)為胰腺在生理上與脾胃、肝膽關(guān)系甚密，功能與臟腑類似，與濕熱邪毒侵襲、濕邪不去、濕性黏滯、腑氣不通有關(guān)，主張“利濕為要，祛邪為先[8]”。清胰解毒方由生大黃、蒲公英、厚樸等8味藥材構(gòu)成，方中大黃主“通”，瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)，可促進(jìn)臟腑排毒、解除腹腔感染、降解消化道內(nèi)毒素；柴胡和解表里、疏肝解郁、解少陽，可恢復(fù)肝臟分泌功能、促進(jìn)膽汁排泄；蒲公英則清熱解毒、利尿散結(jié)；厚樸燥濕消痰、除滿下氣；黃連清熱燥濕、瀉火解毒；白芍則養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、平抑肝陽、緩急止痛；芒硝瀉氣通便、清火消腫；桃仁則活血祛瘀、潤(rùn)腸通便；諸藥同用可共奏活血化瘀、清熱解毒之效。故ERCP術(shù)后早期應(yīng)用清胰解毒方可充分體現(xiàn)中醫(yī)“治未病”思想和“異病同治”的觀點(diǎn)。且現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，柴胡可減少或消除胰酶的自激活作用，避免胰酶分泌受阻所引起的胰腺炎；大黃可抑菌、抑酶，改善胰腺微循環(huán)，下調(diào)TNF-α炎癥介質(zhì)；白芍則可助于膽汁、胰液排泄，阻滯胰酶激活，減輕胰腺腺泡受損，減少ERCP術(shù)后胰腺炎發(fā)生，且其對(duì)ERCP術(shù)后早期TNF-α升高有顯著的抑制作用，可阻斷其觸發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，避免胰腺炎級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，同時(shí)給藥后還可快速促進(jìn)胃動(dòng)素分泌，改善胃腸道蠕動(dòng)功能[9]。Hu W等[10]發(fā)現(xiàn)，中藥治療大鼠ERCP術(shù)后胰腺炎起效時(shí)間快，且給藥時(shí)間越早，越利于ERCP術(shù)后胰腺炎恢復(fù)。

圖1　各組大鼠胰腺組織病理切片圖（HE染色，×400）Fig 1　Pathological section images of pancreatic tissues of rats in each group（HE staining，×400）

近年，隨著ERCP術(shù)應(yīng)用于越來越多的患者，其術(shù)后并發(fā)癥特別是術(shù)后胰腺炎引起了臨床研究者的關(guān)注[11]。徐特等[12]認(rèn)為，炎癥因子在胰腺炎發(fā)病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，胰腺炎患者多伴TNF-α水平升高、IL-10水平降低的現(xiàn)象。且ERCP術(shù)后胰腺炎的發(fā)病及其預(yù)后不易預(yù)測(cè)，病變表現(xiàn)輕重不一，部分可能存在輕型淀粉酶升高，或伴水腫；部分則可能并發(fā)重癥出血性、壞死性胰腺炎，預(yù)后差，甚至可能導(dǎo)致死亡[13]。奧曲肽為合成類生長(zhǎng)抑素類似物，屬胰腺外分泌物抑制劑，其治療急性胰腺炎的價(jià)值已在臨床應(yīng)用中得到肯定[14]；并且其對(duì)ERCP術(shù)后胰腺炎有較好的預(yù)防作用，可通過誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡來減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，降低ERCP術(shù)后胰腺損傷，減輕其病變程度[15]，故在本研究選取其為陽性對(duì)照藥。本研究結(jié)果顯示，清胰解毒方可降低ERCP術(shù)后胰腺炎大鼠血清中TNF-α水平、升高IL-10水平，降低淀粉酶、提升胃動(dòng)素水平，改善病理組織癥狀，且作用強(qiáng)于奧曲肽，有較好的應(yīng)用價(jià)值。但ERCP術(shù)后胰腺炎的發(fā)病與多種機(jī)制有關(guān)，而本研究尚未開展清胰解毒方對(duì)ERCP術(shù)后胰腺炎免疫因子及腸道菌群的影響的分析，是本研究的局限，有待進(jìn)一步探索。

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（編輯：林靜）

Effects of Qingyi Jiedu Decoction on Pancreatitis Model Rats after ERCP

YU Jinzhong1，DANG Zhongqin1，ZHANG Qinsheng1，LI Bo1，DANG Zhibo2（1.Dept.of Liver and Gallbladder，Spleen and Stomach，Henan Provincial Hospital of TCM，Zhengzhou 450002，China；2.The First Clinical College，Beijing University of TCM，Beijing 100029，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of Qingyi jiedu decoction on pancreatitis rats after endoscopic retrograde cholangiopancreatography（ERCP）.METHODS：60 rats were randomly divided into normal group，model group，positive control group（Octreotide injection 50 μg/kg，sc）and Qingyi jiedu decoction high-dose，medium-dose and low-dose groups[56.5，33.9，11.3 g（crude drug）/kg，ig]with 10 rats in each group.Except for normal group，post-ERCP pancreatitis model was induced in those groups.After modeling，treatment groups were given relevant medicine，and normal group and model group were given distilled water intragastrically.The serum levels of IL-10，TNF-α，motilin and amylase were determined.The pathological changes of pancreatic tissues were observed and scored.RESULTS：Compared with normal group，the serum levels of amylase and TNF-α in model group and treatment groups were increased significantly，while the levels of motilin and IL-10 were significantly decreased（P＜0.05）；obvious inflammation was found in pancreatic tissues，and pathological score increased significantly（P＜0.05）.Compared with model group，above indexes of treatment groups were improved significantly，and Qingyi jiedu decoction groups were better than positive control group，with statistical significance（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Qingyi jiedu decoction can improve pancreatitis after ERCP of rats，reduce the serum levels of amylase and TNF-α，and increase the serum levels of motilin and IL-10.

Qingyi jiedu decoction；Pancreatitis；Endoscopic retrograde cholangiopancreatography；Rats

R285

A

1001-0408（2016）28-3918-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.09

河南省中醫(yī)院院級(jí)科研項(xiàng)目

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治消化系統(tǒng)疾病。電話：0371-60905540。E-mail：13837125120@139.com

主任醫(yī)師，碩士。研究方向：中醫(yī)藥防治肝膽疾病。電話：0371-60908997。E-mail：dzhqn@126.com

（2016-05-12

2016-08-05）