誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化的研究進(jìn)展

易寰王萱鐘秀風(fēng)彭福華

·綜述·

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化的研究進(jìn)展

易寰1王萱1鐘秀風(fēng)2彭福華1

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）是通過向已分化成熟的成體細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源特定的基因重編程而得到的一種類似于胚胎干細(xì)胞（ESC）的多潛能干細(xì)胞。iPSC克服了ESC臨床應(yīng)用中帶來的免疫排斥及倫理問題而具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。iPSC在適當(dāng)條件下可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)分化，其體外定向分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的研究取得了一定進(jìn)展。本文就運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育、iPSC向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)分化條件、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元鑒定，臨床應(yīng)用及還存在的問題予以綜述。

多能干細(xì)胞； 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元； 細(xì)胞分化

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，使已分化的體細(xì)胞重編程為類似于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）的多潛能細(xì)胞。2006年，Yamanaka和Takahashi的研究團(tuán)隊(duì)［1］在逆轉(zhuǎn)錄病毒的介導(dǎo)下將轉(zhuǎn)化因子octamer3/4（oct3/4）、SRY box-containing gene2（Sox2）、c-Myc、Kruppel-like（Klf4）的基因組合導(dǎo)入小鼠胚胎纖維母細(xì)胞（mouse embryo fibroblast，MEF）中，并成功獲得小鼠iPSC。2007年，他們又將完全相同的人類轉(zhuǎn)化因子組合導(dǎo)入人類真皮成纖維細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了人類細(xì)胞的重編程［2］。iPSC不僅具備多種分化潛能，并且繞開了人類ESC研究中備受爭議的倫理問題。同時(shí)，從患者特異的自體細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的iPSC又可以有效解決移植過程中的免疫排斥問題。種種優(yōu)點(diǎn)使iPSC在疾病建模、機(jī)制研究、藥物篩選和替代醫(yī)學(xué)等方面展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢［3］。

近年來研究表明，在適當(dāng)?shù)臈l件下iPSC可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)分化［4］，其定向分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（motor neuron，MN）為治療和研究MN損傷疾病例如肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、脊髓肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）等提供了可能性。ALS是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。╩otor neuron disease，MND）最常見的一種，是一組病因未明的選擇性侵犯脊髓前腳、腦干、皮質(zhì)MN的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，以上、下MN損害為最主要的臨床特征，目前尚無有效治療方式。SMA是一種因SMN1基因突變導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病，主要表現(xiàn)為MN退化、肌萎縮，肌無力，最終多死于呼吸衰竭。本文就iPSC向MN分化的研究進(jìn)展及其對于MN相關(guān)疾病的治療前景綜述如下。

一、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生及MN發(fā)育過程

在胚胎發(fā)育過程中，胚盤逐漸形成內(nèi)、中、外三胚層結(jié)構(gòu)，神經(jīng)分化開始于神經(jīng)外胚層形成時(shí)，神經(jīng)外胚層首先形成盤狀結(jié)構(gòu)稱為神經(jīng)盤，神經(jīng)干細(xì)胞位于其中。后神經(jīng)盤兩側(cè)向上卷起于中線融合，形成管樣結(jié)構(gòu)稱為神經(jīng)管。神經(jīng)管內(nèi)細(xì)胞即為神經(jīng)前體細(xì)胞（neural precursor cells，NPC），它們先后經(jīng)歷了前后軸（rostrocaudal axis）、內(nèi)外軸（mediolateral axis）、背腹軸（dorsoventral axis）神經(jīng)誘導(dǎo)（見圖1），最后分化為區(qū)域化的神經(jīng)元［5］。其中，MN位于脊髓前角，其發(fā)生發(fā)育先涉及神經(jīng)化（neuralization）、隨后為形成脊髓神經(jīng)元而非大腦神經(jīng)元需實(shí)現(xiàn)尾端化（caudalization）、最后為背腹軸的腹側(cè)化（ventralization）［6］（圖2）。體外誘導(dǎo)MN也是通過上述三步，神經(jīng)化主要通過抑制骨形成發(fā)生蛋白（bone morphogen protein，BMP）和生長轉(zhuǎn)化因子（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路來實(shí)現(xiàn)［7］，既往多用Noggin抑制BMP和TGF-β通路，現(xiàn)也有人用LDN193189、SB431542實(shí)現(xiàn)［8］。尾端化主要由RA（retinoic acid）調(diào)控，另外Wnt和FGF通路也促進(jìn)神經(jīng)元尾端化［9-10］。而同時(shí)Wnt和FGF通路也促進(jìn)神經(jīng)元背側(cè)化，在脊髓發(fā)育中表現(xiàn)為中間神經(jīng)元（interneurons）的形成，而非MN，故主要介導(dǎo)腹側(cè)化的音猥因子（sonic hedgehog homolog，Shh）信號通路在MN的形成中顯得尤為重要［11］。

圖1 神經(jīng)軸向發(fā)育示意

二、iPSC體外分化為MN

（一）iPSC的建立及其向NPC分化

人類和鼠類iPSC的建立及神經(jīng)分化大致經(jīng)歷以下幾個(gè)階段：用攜帶oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4的慢病毒感染成體細(xì)胞（如人皮膚成纖維細(xì)胞、MEF）；病毒感染后出現(xiàn)ESC細(xì)胞樣克隆，表明成體細(xì)胞已經(jīng)被重編程；挑選具有典型ESC細(xì)胞樣克隆傳代培養(yǎng)并進(jìn)行AP染色和多潛能性分析，發(fā)現(xiàn)其可維持ESC細(xì)胞的生物學(xué)特性。以上標(biāo)志成功建立了iPSC細(xì)胞系［2］。有報(bào)道證明iPSC的生物特性與ESC細(xì)胞極為相似［3］。

圖2 胚胎發(fā)育流程

在諸多誘導(dǎo)方案中（表1），多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell）向神經(jīng)干細(xì)胞分化主要通過形成擬胚體（embryoidbody，EB）和神經(jīng)玫瑰花樣結(jié)構(gòu)（neural rosette）兩種方式實(shí)現(xiàn)。擬胚體即細(xì)胞在體外模擬胚胎而形成的結(jié)構(gòu)，為iPSC在低吸附培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)形成的細(xì)胞球結(jié)構(gòu)，EB培養(yǎng)基多為不添加bFGF的干細(xì)胞培養(yǎng)基，為促進(jìn)其向神經(jīng)分化，后期換為神經(jīng)分化培養(yǎng)基，輔助以BMP、TGF-β抑制因子，同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)方案加入一些其他小分子，如Y27632促進(jìn)細(xì)胞成團(tuán)［12］，F(xiàn)GF促進(jìn)細(xì)胞生長。EB形成后接種至Laminin/poly-L-lysine或matrigel包被的培養(yǎng)板繼續(xù)分化。neural rosette是由iPSC消化后直接接種至包被的培養(yǎng)板上形成的具有分化為多種神經(jīng)細(xì)胞潛能的結(jié)構(gòu)，因形似玫瑰花而命此名。培養(yǎng)基多為神經(jīng)分化培養(yǎng)基輔以B27、N2等。同樣，培養(yǎng)基中可加入BMP、TGF-β通路抑制劑促進(jìn)細(xì)胞向神經(jīng)分化。由此得到的EB或neural rosette內(nèi)的細(xì)胞即為NPC，表達(dá)SOX1、Nestin等泛神經(jīng)化的標(biāo)志物［8，13-14］。

表1 多能干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化概況

圖 3 干細(xì)胞逐步誘導(dǎo)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的模式

（二）NPC定向分化為MN

上述NPC形成后，向培養(yǎng)基中添加不同誘導(dǎo)因子可以促其進(jìn)一步分化得到特定神經(jīng)功能細(xì)胞。如前所述，促進(jìn)已神經(jīng)化的干細(xì)胞向MN分化主要依賴RA的尾端化和SHH的腹側(cè)化。NPC在RA作用下傾向于分化為脊髓祖細(xì)胞，接著SHH使脊髓祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為表達(dá)Olig2的腹側(cè)MN前體。2002年Wichterie等［6］聯(lián)合應(yīng)用RA和SHH已成功地將ESC誘導(dǎo)為MN。Karumbayaram等［15］報(bào)道應(yīng)用RA和SHH，同樣將hiPSC分化為MN，其分化效率與ESC相似。但是，有研究指出，僅應(yīng)用RA和SHH卻很難促進(jìn)iPSC向MN轉(zhuǎn)化［16］，應(yīng)用SHH的同時(shí)需要抑制acticin/ nodal信號通路才可以有效促進(jìn)MN形成［19］。雖然各實(shí)驗(yàn)方案所加細(xì)胞因子各異，但普遍都應(yīng)用SHH/purmorphamine和RA，再輔以其他BDNF、GDNF、IGF、cAMP等營養(yǎng)因子實(shí)現(xiàn)體外MN誘導(dǎo)［6，8，13-14］（圖3）。國內(nèi)也已有人通過這種方法成功在體外將iPSC誘導(dǎo)形成MN［20］。各實(shí)驗(yàn)方案所用劑量各異，RA從1 nmonl/L ～ 1 μmonl/L不等，Shh從50 ～ 500 ng/ml不等［21］。但近期Calder等［22］報(bào)道，早期神經(jīng)化過程中應(yīng)用模式分子（patterning molecules）處理的干細(xì)胞，在向MN分化過程中不加入Shh/purmorphamine也可成功誘導(dǎo)分化成MN，且分化效率同RA+Shh方案。

除了應(yīng)用動(dòng)物和正常人來源的iPSC，也有學(xué)者將從ALS患者身上獲得的成纖維細(xì)胞重編程為iPSC，并將其誘導(dǎo)分化為EB，在特定神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下進(jìn)一步分化為MN［23-25］。這為建立體外ALS模型、研究ALS致病機(jī)制、干細(xì)胞移植治療提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

三、MN的鑒定標(biāo)志

在MN發(fā)育過程中會(huì)表達(dá)多種標(biāo)志物，體外分化過程中也利用這些標(biāo)志物顯示分化效率。當(dāng)干細(xì)胞向神經(jīng)分化即形成神經(jīng)干細(xì)胞，會(huì)表達(dá)諸多神經(jīng)標(biāo)志物，常用于檢測的有：SOX1、SOX2、Nestin等。當(dāng)加入RA及Shh調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向MN前體細(xì)胞（motor neuron progenitors，MNP）分化時(shí)，會(huì)表達(dá)PAX6、Nkx6、olig2、Islt1，其中PAX6和Nkx6在脊髓中間神經(jīng)元前體細(xì)胞也會(huì)表達(dá)，而Olig2和Islt1則只在MNP中表達(dá)［26］，同時(shí)該階段的神經(jīng)細(xì)胞也會(huì)開始表達(dá)β-Tublin、MAP2等泛神經(jīng)標(biāo)志物［27］。隨著MNP向MN分化，細(xì)胞會(huì)表達(dá)HB9、SMI-32，表達(dá)HB9意味著細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后（post-mitotic）階段，此階段細(xì)胞不再增殖，只能向著成熟MN分化［6］。成熟的MN會(huì)表達(dá)ChAT、VACHT、CHT1等膽堿能標(biāo)志物［6，8］，其中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）是催化乙酰膽堿合成的酶，ChAT的活性變化可以直接影響乙酰膽堿的合成，故認(rèn)為是較重要的MN標(biāo)志物，大多數(shù)體外分化方案都以其作為成熟MN的標(biāo)志物［13，16］。MN如果與肌肉細(xì)胞共培養(yǎng)，形成突觸，則會(huì)表達(dá)SV2、Synaptophysin等突觸標(biāo)志物，并誘導(dǎo)肌肉表達(dá)乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR），該受體可用α-bungarotoxin標(biāo)記［28］。利用這些標(biāo)志物，在體外分化MN時(shí)，可在各階段行免疫熒光染色以證明。

四、MN的功能檢測

定向分化而來的MN鑒定除了上述檢測特異性分子標(biāo)志以外，仍需要進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能的檢測。功能檢測包括體外功能檢測及移植入體內(nèi)后的功能檢測。

1.分化MN體外功能檢測：干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成MN，除了通過標(biāo)志物證實(shí)，還需要利用膜片鉗證明其如正常神經(jīng)細(xì)胞有電生理活動(dòng)。2004年，Miles等［29］將ESC源的MN和C2C12肌小管共培養(yǎng)形成神經(jīng)肌肉接頭后用膜片鉗測試到MN能產(chǎn)生動(dòng)作電位，且分別加入谷氨酸、河豚毒素后檢測到興奮后的或抑制后的電位。2015年，Jeremy等［30］用iPSC源的MN和雞的肌纖維共培養(yǎng)形成神經(jīng)肌肉接頭，通過膜片鉗檢測到類似結(jié)果。對MN進(jìn)行電生理檢測已經(jīng)成為體外誘導(dǎo)分化MN常用的功能學(xué)檢測手段。

2.分化MN移植到動(dòng)物體后功能檢測：2002年，Wichterie等［6］首次將ESC分化至MN的同時(shí)即將HB9陽性的MN植入到MN發(fā)育期的雞胚細(xì)胞中，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)植入的MN可以長出突起，并與肌肉聯(lián)系。Harper等［31］將ESC分化而來的MN植入MN損傷的成年大鼠的脊髓中，觀察到植入的MN可以向白質(zhì)中長出突起。依據(jù)ESC早期的研究基礎(chǔ)，2013年Amoroso等［8］將iPSC來源的MN移植入雞胚中，并觀察到移植的細(xì)胞存活。以上研究證明將MN植入處于發(fā)育期或者成體脊髓中，MN可以與肌肉建立聯(lián)系，也說明體外分化MN在很大程度上同動(dòng)物體內(nèi)MN類似。這些嘗試為干細(xì)胞移植治療MN疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

五、患者體細(xì)胞來源iPSC基因修飾及相關(guān)疾病治療前景

有學(xué)者證實(shí)iPSC來源的MN移植入體內(nèi)不僅可以存活，也能用于治療MN相關(guān)疾病，改善預(yù)后［32］。ALS的患者中10﹪的屬家族性，而SMA則為常染色體隱性遺傳病。故理論上，將針對某種遺傳病進(jìn)行基因修飾的iPSC分化為MN，再移植入有該遺傳缺陷的患者體內(nèi)，能夠治療疾病。2012年就有學(xué)者將SMA患者的皮膚細(xì)胞重編程為iPSC，并向?qū)υ搃PSC進(jìn)行基因修飾，使得SMN1表達(dá)量上調(diào)。分別將正常體細(xì)胞來源的iPSC（WT-iPSC）、SMA患者來源的iPSC（SMA-iPSC）、基因修飾的iPSC（TR-iPSC）在體外分化為MN，并移植入SMA疾病模型小鼠體內(nèi)，證明移植TR-iPSC來源的MN的小鼠中位生存期與移植WT-iPSC來源的MN類似（21 d），但移植SMA-iPSC來源MN的小鼠中位生存期則更短（19 d），未移植的SMA小鼠生存期最短（13 d）［18］。同樣，也有學(xué)者將ALS患者體細(xì)胞重編程為iPSC，經(jīng)過SOD基因修飾后SOD的表達(dá)量上調(diào)，結(jié)果證實(shí)，ALS來源且未經(jīng)基因修飾的MN易神經(jīng)絲纏結(jié)、軸突退行性變、神經(jīng)興奮性高，而經(jīng)過SOD基因修飾的MN則不易有上述表現(xiàn)，這與ALS患者的病理及神經(jīng)電生理表現(xiàn)一致［33］。這些都說明，應(yīng)用iPSC來源的MN移植入體內(nèi)不僅可以存活，也能用于治療MN相關(guān)疾病，而針對不同疾病的突變基因進(jìn)行基因修飾的iPSC則是治療遺傳類MN疾病的更好選擇。

六、存在的問題與展望

從2002年Wichterie首次利用ESC分化為MN，體外利用干細(xì)胞向MN誘導(dǎo)分化已經(jīng)有十多年歷史，各國學(xué)者在分化時(shí)間、效率、干細(xì)胞來源等方面尋求突破，分化時(shí)間從早期＞40 d縮短至最快14 d可成功誘導(dǎo)成MN［34］，且早期分化方案最終得到的MN純度大多在20﹪～ 40﹪［6，14］，但到2015年有學(xué)者使誘導(dǎo)效率達(dá)到90﹪［13］。這些進(jìn)步為體外獲得的MN進(jìn)行進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了便利。干細(xì)胞來源也從最初備受道德爭議的ESC拓展到iPSC，且諸多誘導(dǎo)方案應(yīng)用ALS等患者的iPSC誘導(dǎo)成功［24-25］。這不僅為MND研究提供了體外模型，也為該病藥物篩選提供更可靠依據(jù)。

盡管多能干細(xì)胞向MN定向分化的研究取得了巨大進(jìn)展，但仍有一些問題待解決。第一、MN的發(fā)生過程已有相當(dāng)多的研究，但針對各種MN亞型的研究還非常有限。就脊髓前角處的MN而言，既有正中運(yùn)動(dòng)柱（median motor column，MMC）神經(jīng)元，也有外側(cè)運(yùn)動(dòng)柱（lateral motor column，LMC）神經(jīng)元，雖均為MN，但MMC處MN支配軀干肌，LMC處MN支配四肢肌。而MND患者肌肉萎縮常從某一類肌肉開始，故體外分化得到MN各亞型顯得頗為重要?，F(xiàn)階段雖然體外分化方案繁多，但多是通過神經(jīng)化、尾端化、腹側(cè)化實(shí)現(xiàn)，更為細(xì)化的MN亞型分化方案及分化機(jī)制仍需探索。近年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)FoxP1作為Hox輔助因子，能對各個(gè)MN種類進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而決定MN多樣性［35］，后有學(xué)者利用FoxP1作為檢驗(yàn)MN亞型的標(biāo)志物并將干細(xì)胞高效分化為LMC處的MN［8］。這些為更加精準(zhǔn)的分化提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐方案。第二、雖然現(xiàn)階段體外分化的MN可以與肌肉細(xì)胞產(chǎn)生突觸聯(lián)系，并檢測到電生理變化，但兩者形成的神經(jīng)肌肉接頭仍相當(dāng)不成熟，無論是ESC來源還是iPSC來源的MN，其形成的神經(jīng)肌肉接頭不僅非常少而且形態(tài)各異［29-30，36］。如何讓干細(xì)胞來源的MN達(dá)到正常人體中MN功能水平，是制約干細(xì)胞移植治療MND的一大瓶頸。

自2006年iPSC技術(shù)建立后，近幾年iPSC的研究得到極大的發(fā)展，將iPSC誘導(dǎo)分化成功能性的MN將會(huì)對MND等疾病的治療、機(jī)制研究提供極大的臨床價(jià)值。但MN各亞型的形成與作用仍需要進(jìn)一步研究，如何提高iPSC定向分化為MN的效率、純化MN并使其具有正常的生理功能是當(dāng)前仍需研究的問題。

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Actuality of motor neurons differentiation from induced pluripotent stem cells

Yi Huan1， Wang Xuan1， Zhong Xiufeng2， Peng Fuhua1.1Multiple Sclerosis Center， Department of Neurology， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University， Guangzhou， Guangdong 510630， China.2State Key Laboratory of Ophthalmology， Zhongshan Ophthalmic Center， Sun Yat-sen Univeristy， Guangzhou 510600， China

Peng Fuhua， Email: pfh93@163.com； Zhong Xiufeng， Email: zhongxf7@mail. sysu.edu.cn

Induced pluripoent stem cells （iPSCs）， derived from somatic cells by reprogramming with delivery of certain genes， can resemble the characteristics of embryonic stem cells （ESCs） to give rise to all the fully differentiated cells， even tissues. iPSCs avoid the immunological rejection and ethical issues when using ESCs in clinic. Under appropriate conditions，iPSCs can differentiate into nerve cells. At present， scientists have made much progress on the research of motor neurons differentiation from iPSCs. This paper is to summarize the motor neuron development in vivo， the research progress on the differentiation of iPSCs into motor neurons， the identification and function testing of hiPSC-derived motor neurons and the problems to be solved further.

Multipotent stem cells； Motor neurons； Cell differentiation

2016-04-26）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.008

國家自然科學(xué)基金（81570874）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（1563000227）；廣東省自然科學(xué)基金（2015A03013167）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020211008；2015A020212011）；中山大學(xué) “百人計(jì)劃”（PT1001010）

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1；510600 廣州，中山大學(xué)中山眼科中心2

彭福華，Email：pfh93@163.com；鐘秀風(fēng)，Email：zhongxf7@mail.sysu.edu.cn

易寰，王萱，鐘秀風(fēng)，等.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化的研究進(jìn)展［J/CD］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2016，6（3）：179-183.