早期心肌缺血猝死患者心肌干細(xì)胞及高遷移率族蛋白1、miRNA-206表達(dá)的變化

謝佳 張雷

·論著·

早期心肌缺血猝死患者心肌干細(xì)胞及高遷移率族蛋白1、miRNA-206表達(dá)的變化

謝佳 張雷

目的 探討早期心肌缺血猝死患者心肌干細(xì)胞及高遷移率族蛋白1（HMGB1）、miRNA-206表達(dá)的變化。方法 收集中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年10月至2015年10月的100例尸檢標(biāo)本，早期心肌缺血猝死組（n = 40），心肌梗死組（n = 30），正常心肌組（n = 30），運(yùn)用免疫組織化學(xué)二步法染色，采用卡方檢驗(yàn)比較分析早期心肌缺血組、心肌梗死猝死組、正常心肌組中心肌干細(xì)胞、HMGB1及miRNA-206的表達(dá)情況，并采用Spearman相關(guān)系數(shù)法分析早期心肌缺血組中HMGB1與miRNA-206表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 早期心肌缺血猝死組中HMGB1的陽性表達(dá)率為97.50﹪（39/40）與心肌梗死猝死組100﹪（30/30）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.761，P = 0.383），但二者均顯著高于正常心肌組的3.33﹪（1/30），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=273.297，P = 0.000）；早期心肌缺血猝死組中c-kit+的陽性表達(dá)率為77.50﹪（31/40）與心肌梗死猝死組86.67﹪（26/30）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.953，P = 0.329），但二者明顯高于正常心肌組的10.00﹪（3/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 2163.431，P = 0.003）；早期心肌缺血猝死組中miRNA-206的表達(dá)為正常心肌組的3.02±0.53倍，心肌梗死猝死組中的表達(dá)是正常心肌組的4.63±0.71倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 10.870，P = 0.000）；早期心肌缺血猝死組中HMGB1的陽性表達(dá)率為97.50﹪（39/40）明顯高于c-kit+陽性表達(dá)率的77.50﹪（31/40），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.824，P = 0.031）。結(jié)論 心肌干細(xì)胞及HMGB1、miRNA-206在早期心肌缺血猝死中陽性表達(dá)率比較高，正常心肌中均為弱性表達(dá)，比較分析三者的差異性表達(dá)，可以為早期心肌缺血猝死的死因鑒定提供有效的客觀指標(biāo)。

心肌缺血； 猝死； 干細(xì)胞； 微RNAs

心肌缺血是一種常見的心血管疾病，因灌注心臟的血液量減少，造成心臟的供氧不足，心肌能量代謝障礙，心臟無法正常運(yùn)作。充足的有氧代謝是心臟正?；顒拥幕A(chǔ)，有研究報道，安靜狀態(tài)下心肌的血氧攝取率也可高達(dá)70﹪［1］。我國心肌缺血的發(fā)病率逐步上升，為中老年群體的多發(fā)病與常見病。心肌缺血的首要致病因素為冠狀動脈粥樣硬化，還可見于血壓下降、炎癥、創(chuàng)傷和栓塞等。心肌缺血后細(xì)胞容易出現(xiàn)損傷壞死，造成心肌梗死或猝死。一過性心肌缺血造成的猝死，心肌組織通常無典型的病理形態(tài)改變，因此早期心肌缺血猝死依舊是法醫(yī)病理學(xué)鑒定中的一大難題。相關(guān)研究指出早期心肌缺血造成的心肌細(xì)胞損傷能夠促進(jìn)心肌干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSCs）的分化增殖，繼而促進(jìn)受損心肌恢復(fù)［2］。CSCs可以分成多種主要類型，其中首要表達(dá)的是c-kit+細(xì)胞群。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可在心肌細(xì)胞受損初期分泌，并參與整個生物學(xué)過程。有研究報道，HMGB1是組織損傷的敏感指標(biāo)，此外HMGB1與miRNA-206的表達(dá)同CSCs的分化增殖有著密切的聯(lián)系［3］。本研究旨在探討早期心肌缺血猝死患者CSCs及HMGB1、miRNA-206表達(dá)的變化。

資料與方法

一、一般資料

收集中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年10月至2015年10月的100例尸檢標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：（1）病史資料保存完整；（2）解剖前尸體冰凍保存良好；（3）心肌組織均經(jīng)10﹪的福爾馬林溶液固定，行常規(guī)脫水，石蠟包埋。排除標(biāo)準(zhǔn)：死因尚未明確。

早期心肌缺血猝死組40例，均為首次發(fā)病，起病時間急，生存時間短，無中毒癥狀或者其他系統(tǒng)性疾病，組織學(xué)上無心肌梗死變化，冠狀動脈主要為支管腔Ⅱ至Ⅳ級狹窄；男性有35例，女性有5例，年齡41 ～ 65歲，生存期0.5 ～ 4 h，死后至解剖時間為8 ～ 24 h。心肌梗死猝死組30例，冠狀動脈主要為支管腔Ⅲ至Ⅳ級狹窄，可見心肌梗死的典型改變與陳舊性瘢痕，男性有26例，女性有4例，年齡43 ～ 66歲，生存期0.5 ～ 5h，死后至解剖時間為8 ～ 25h。正常心肌組30例，冠狀動脈無狹窄，心臟無病變，為非心源性死亡；男性有23例，女性有7例，年齡39 ～ 62歲，生存期0.5 ～ 4 h，死后至解剖時間為8 ～ 23 h（表1）。

二、方法

1.檢測心肌組織中HMGB1及CSCs的表達(dá)情況：運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法，心肌組織切片脫蠟至水，切片置入0.3﹪的H2O2浸泡15 min，流水洗凈，抗原修復(fù)，PBS沖洗1 min，共3次。滴入血清放置10 min，流水洗凈，滴入一抗（HMGB1為1：50，c-kit+為1：200）孵育30 min，PBS沖洗2 min，共3次，滴入二抗，孵育30 min，PBS沖洗2 min，共3次，滴入SP復(fù)合物放置20 min，PBS沖洗2 min，共3次，滴入DAB顯色液放置5 min，流水洗凈，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核5 min，水洗，分化，藍(lán)化，脫水，樹膠封片最后鏡檢。

2.檢測心肌組織中miRNA-206的表達(dá)情況：組織切片后置于離心管中，添加1 ml二甲苯，搖晃均勻后采用低溫離心機(jī)，離心半徑3 cm，12 000 r/min的速度，離心2 min，去除上清液，添加1 ml脫水乙醇，搖晃均勻后以12 000 r/min的速度，離心半徑3 cm，離心2 min再去除上清液，室溫內(nèi)放置10 min，添加蛋白酶K溶液10 μl與PTL溶液250 μl，搖晃均勻后，60℃環(huán)境內(nèi)放置10 min，再置于80℃環(huán)境內(nèi)15 min，添加裂解液700 μl，搖晃均勻，室溫放置2 min，添加0.2 ml氯仿，充分混合后放置室溫內(nèi)3 min，以10 000 r/min的速度，離心半徑3 cm，離心10 min后，取出600 μl溶液于新燒杯內(nèi)，添加300 μl 70﹪乙醇，搖晃均勻后放置于吸附柱RA內(nèi)，離心半徑3 cm，12 000 r/min的速度，離心30 s。收集300 μl的miRNA下濾液，添加150 μl的脫水乙醇，充分混合后置于吸附柱RB內(nèi)，以12 000 r/min的速度，離心半徑3 cm，離心30 s后去掉上濾液，添加漂洗液PW 600 μl，離心60 s后去掉上濾液，滴入漂洗液PW 500 μl，離心半徑3 cm，10 000 r/min的速度，離心60 s后去掉上濾液，以10 000 r/min的速度，離心半徑3 cm，離心2 min，吸附柱RB移至RNsse free離心管內(nèi)，滴入RNsse free water 30 μl，室溫放置2 min后，離心半徑3 cm，12 000 r/min的速度，離心60 s，收集純凈的miRNA置于恒溫，20℃中，逆轉(zhuǎn)錄后，cDNA置于恒溫，20℃中，定量PCR反應(yīng)，并測定miRNA-206值。

表1 三組患者的基本資料

三、觀察指標(biāo)

觀察早期心肌缺血猝死組、心肌梗死猝死組與心肌正常組中HMGB1、c-kit+與miRNA-206的表達(dá)，并分析早期心肌缺血組中HMGB1與miRNA-206表達(dá)的相關(guān)性。

HMGB1結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［5］：依據(jù)心肌組織切片中陽性表達(dá)細(xì)胞的染色程度可分為：0分不顯色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，HMGB1在心肌細(xì)胞胞漿呈棕色即為陽性表達(dá)；依據(jù)陽性表達(dá)細(xì)胞的百分比可分為：0分為陰性，1分為≤10﹪，2分為11﹪～ 50﹪，3分為51﹪～ 75﹪，4分為＞ 75﹪。結(jié)果為兩項(xiàng)指標(biāo)總得分：0至2分即為（-），3至4分即為（+），6至8分即為（++），9至12分即為（+++）。

CSCs結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［6］：依據(jù)c-kit+陽性細(xì)胞表達(dá)可分為：陰性0分，0至3分（-），4至5分（+），6至7分（++），≥8分為（+++）。CSCs在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中呈棕色即為陽性。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，三組性別、年齡、生存期等一般資料相比較，采用卡方檢驗(yàn)和單因素方差分析。年齡、生存期、死后至解剖時間、miRNA-206表達(dá)等計量資料表示用± s，組間比較使用獨(dú)立t檢驗(yàn)，HMGB1、c-kit+用［（n）﹪］表示，組間比較則使用χ2檢驗(yàn)。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、分析比較三組HMGB1在心肌組織中的表達(dá)

早期心肌缺血猝死組及心肌梗死猝死組HMGB1陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），但二者HMGB1陽性表達(dá)率均顯著高于心肌正常組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）。

二、比較分析三組c-kit+在心肌組織中的表達(dá)

早期心肌缺血猝死組及心肌梗死猝死組c-kit+陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），但二者c-kit+陽性表達(dá)率顯著高于心肌正常組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表3）。

三、比較分析HMGB1與c-kit+在早期心肌猝死組中的表達(dá)

早期心肌猝死組HMGB1陽性表達(dá)率顯著高于c-kit+，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表4）。

表2 比較三組HMGB1在心肌組織中的表達(dá)［（n）﹪］

表3 比較三組c-kit+在心肌組織中的表達(dá)［（n）﹪］

表4 分析HMGB1與c-kit+在早期心肌猝死組中的表達(dá)（例）

四、比較分析三組miRNA-206表達(dá)

miRNA-206在早期心肌缺血猝死組中的表達(dá)是正常心肌組的3.02±0.53倍，miRNA-206在心肌梗死猝死組中的表達(dá)是正常心肌組的4.63±0.71倍，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 10.870，P = 0.000）。

討 論

目前，心肌缺血的發(fā)病率及病死率逐步上升，嚴(yán)重危害患者的健康。由于生活水平的快速提高，心肌缺血呈現(xiàn)年輕化趨勢。心肌急性缺血容易出現(xiàn)局部組織的電生理失常，造成短暫的室顫，甚至猝死。早期心肌缺血猝死依舊為法醫(yī)病理學(xué)鑒定中的一大難題。相關(guān)文獻(xiàn)指出，miRNA-206能夠調(diào)控HMGB1促進(jìn)CSCs的增殖分化［7］。

CSCs位于心肌組織中，研究發(fā)現(xiàn)CSCs能夠分化增殖為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞，一旦心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷，CSCs能夠立刻轉(zhuǎn)移至損傷區(qū)域，并且分化增殖新的心肌細(xì)胞，修復(fù)梗死后的心肌組織。HMGB1是評價細(xì)胞受損程度的敏感指標(biāo)，有研究指出，HMGB1注射至心肌梗死的家兔心臟后能夠誘導(dǎo)心肌再生，且梗死部位c-kit+、miRNA表達(dá)顯著增加，同時小動脈密度與新形成細(xì)胞也有所增加［8］，證實(shí)HMGB1能夠調(diào)控miRNA-206表達(dá)，誘導(dǎo)CSCs的分化增殖。CSCs可以分成多種主要類型，其中首要表達(dá)的是c-kit+細(xì)胞群，c-kit+是一種在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)呈棕色表達(dá)的蛋白，研究指出有c-kit+表達(dá)的細(xì)胞即可視為CSCs［9］。本研究結(jié)果顯示，c-kit+在正常心肌組中為弱性表達(dá)，早期心肌缺血猝死組有很大部分的陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。正常心肌組織中存在少量棕色的圓形或者橢圓形細(xì)胞包膜或者胞質(zhì)，早期心肌缺血猝死組與心肌梗死猝死組心肌組織中棕色細(xì)胞包膜或者胞質(zhì)較多。由此可見，c-kit+在心肌組織中的表達(dá)變以對早期心肌缺血猝死的鑒定有一定的輔助價值。

HMGB1為高度保守的核蛋白，可以調(diào)節(jié)DNA的基因轉(zhuǎn)錄，同時具有釋放炎癥介質(zhì)的能力。HMGB1能夠主動分泌至胞質(zhì)或者被動釋放至細(xì)胞外。Jian等［10］報道，HMGB1在炎性細(xì)胞遭受刺激時可以主動分泌至細(xì)胞膜外部，調(diào)控組織的再生修復(fù)。細(xì)胞壞死時能夠松散HMGB1與DNA的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)HMGB1被動釋放至胞漿或者細(xì)胞外。王靜等［11］研究報道表明感染、細(xì)胞壞死或者凋亡都可以造成HMGB1水平上升。因此心肌細(xì)胞缺血造成心肌細(xì)胞壞死時，有大量HMGB1被動釋放至胞漿或者細(xì)胞外。本研究結(jié)果顯示，HMGB1在早期心肌缺血猝死組陽性表達(dá)較強(qiáng)，正常心肌組表達(dá)較弱。由于早期心肌缺血猝死的心肌組織病理學(xué)改變很小，因此HMGB1可以作為早期心肌缺血猝死診斷的輔助指標(biāo)。有學(xué)者指出，HMGB1能夠促進(jìn)CSCs的再生與分化，修復(fù)心肌組織，改善心臟功能；同時也可激活血管干細(xì)胞、內(nèi)皮肌細(xì)胞與祖細(xì)胞［12］。本研究結(jié)果中HMGB1與c-kit+在早期心肌缺血組及心肌猝死梗死組中均為高表達(dá)，心肌正常組中均為低表達(dá)，證實(shí)HMGB1能夠激活CSCs，二者呈正相關(guān)。miRNA是非編碼的小RNA，高度保守，能夠調(diào)控基因靶RNA的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)翻譯及基因表達(dá)的過程，繼而在生物反應(yīng)學(xué)中發(fā)揮作用。沈麗娟等［13］研究報道顯示，miRNA對于心血管疾病有極其關(guān)鍵的調(diào)控作用。成熟的miRNA能夠與特定的靶mRNA特異性反應(yīng)，使特定的蛋白質(zhì)水平降低。王蘊(yùn)強(qiáng)等［14］研究發(fā)現(xiàn)HMGB1增強(qiáng)心室重構(gòu)過程中能夠促進(jìn)miRNA-206的表達(dá)上調(diào)。由于心肌缺血造成心肌細(xì)胞壞死后HMGB1被動釋放后相應(yīng)的促進(jìn)miRNA-206表達(dá)上調(diào)，本研究結(jié)果顯示，miRNA-206在早期心肌缺血猝死組及心肌梗死猝死組中的表達(dá)無明顯差異，但二者均高于心肌正常組，進(jìn)一步證實(shí)HMGB1的表達(dá)和miRNA-206表達(dá)為正相關(guān)。因此miRNA-206能夠作為早期心肌缺血猝死診斷的輔助指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明CSCs、HMGB1與miRNA-206在早期心肌缺血猝死組及心肌梗死猝死組中均為高表達(dá)，正常心肌組中均為低表達(dá)，證實(shí)三者在心肌組織中的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)性。綜上所述，觀察CSCs、HMGB1與miRNA-206在心肌組織中的表達(dá)變化，可以為早期心肌缺血猝死的死因鑒定提供有效的客觀指標(biāo)。

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Variety of cardiac stem cells and high mobility group box 1 protein， miRNA-206 expression in patient of early acute myocardial ischemic

Xie Jia， Zhang Lei.Department of Emergency， The First Affiliated Hospital of Third Military Medical University， Chongqing 400038， China

Zhang Lei， Email:bachelorforever@sina.com

Objective To investigate the variety of cardiac stem cells and high mobility group box 1 protein （HMGB1）， miRNA-206 expression in patients with early acute myocardial ischemic. Methods A total number of 100 autopsy specimens from October 2012 to October 2015 were collected and divided into early myocardial ischemia sudden death group（n = 40），myocardial infarction group（n = 30）， and normal myocardium group（n = 30）. Two-step immunohistochemical staining，Chi-square test to compare analyzes the expression of early myocardial ischemia group， myocardial infarction， sudden death， and normal cardiac muscle stem cells in the center of the group， HMGB1 and miRNA-206， and the analysis of early myocardial ischemia group HMGB1 and miRNA- using Spearman correlation coefficient correlation between the expression of 206. Results The positive expression rate of HMGB1was 97.50﹪（39/40）and 100﹪（30/30）in early myocardial ischemia sudden death group and myocardial infarction group respectively with no significant difference（χ2= 0.761， P = 0.383）， but both were significantly higher than 3.33﹪（1/30）in normal myocardium group， which was statistically significant（χ2= 273.297， P = 0.000）；The expression of early myocardial ischemia and sudden death group， the rate of c-kit+77.50﹪（31/40）and myocardial infarction， sudden death group 86.67﹪（26/30）the difference was not statistically significant（χ2= 0.953， P = 0.329）， yet both of which were markedly higher than that in normal cardiac group（10.00﹪（3/30）， χ2=2163.431，P = 0.003）. miRNA-206 expression in early myocardial ischemia sudden death group and myocardial infarction group was 3.02 ± 0.53 and 4.63 ± 0.71 times as much as in normal cardiac group respectively. The difference was statistically significant（t = 10.8698，P = 0.000）. In early myocardial ischemia sudden death group， the positive expression rate of HMGB1 was 97.50﹪（39/40）， which was significantly higher than 77.50（31/40）﹪of c-kit+positive expression rate. Thus an obvious difference was shown（χ2= 0.824，P = 0.031）. Conclusion The positive expression rate of cardiac stem cells， HMGB1 and miRNA-206 in early myocardial ischemia sudden death group is relatively high， yet in normal myocardium group， it shows weak expression. Comparative analysis of the differential expression among these three groups could provide objective indicators for identification of early myocardial ischemia sudden death.

Myocardial ischemia； Sudden death； Stem cells； MicroRNAs

2016-04-01）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.004

重慶市科技傳播與普及項(xiàng)目（cstc2016kp-sfhdB0009）

400038 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院急救部

張雷，Email：bachelorforever@sina.com

謝佳， 張雷.早期心肌缺血猝死患者心肌干細(xì)胞及高遷移率族蛋白1、miRNA-206表達(dá)的變化［J/CD］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2016， 6（3）：155-159.