pH示差法測(cè)定不同品系元寶楓葉片花青苷含量

杜曉茜+豐震+楊麗娟+許超+喬謙+任紅劍+安凱

摘 要：采集秋季轉(zhuǎn)色后的元寶楓無性系葉片作為試驗(yàn)材料，采用pH示差法測(cè)定其不同品系葉片中花青苷的含量。結(jié)果顯示：用恒溫震蕩培養(yǎng)箱25 ℃震蕩提取6 h提取效果最好；pH示差法選定pH 值是1.0和4.5，提取液的平衡時(shí)間是60 min。試驗(yàn)的平均回收率是96.66%，由此可見，該方法能有效消除溶液中雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，可用于元寶楓花青苷的定量分析。在所測(cè)量的5個(gè)品系中，花青苷含量最高的品系是1-7號(hào)，含量為0.845 3 mg·g-1，5個(gè)品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。

關(guān)鍵詞：元寶楓；pH示差法；花青苷

中圖分類號(hào)：Q946.83+6 文件標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.008

Abstract： In this study， the leaves of Acer truncatum Bunge were studied， and their total anthocyanin contents in different strains were investigated by pH-differential method. The results showed that using constant temperature oscillation incubator 25 ℃ oscillation extraction 6 hours it presented the best effect， and the pH selected were 1.0 and 4.0， and the buffering time was 60 minutes. By this method， the average recovery rate was 96.66%，therefore， this method can be used to the quantitative analysis of anthocyanins in Acer， and pH-differential method could eliminated the influence of impurities. Among the five strains，the content of anthocyanin in 1-7 was the highest ，which was 0.845 3 mg·g-1； the average anthocyanin content of these five strains was 0.482 1 mg·g-1.

Key words： Acer truncatum Bunge； pH-differential method； anthocyanin

元寶楓（Acer truncatum Bunge），槭樹科（Aceraceae）槭屬（Acer.L），是北方優(yōu)良的園林綠化樹種。秋季元寶楓葉色轉(zhuǎn)為黃色、橙色或鮮紅色，花青苷含量非常豐富[1]。本試驗(yàn)通過測(cè)定不同色系元寶楓葉片中花青苷含量，探討葉色與花青苷含量的關(guān)系，為高含量花青苷品系的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

花青苷廣泛存在于大多數(shù)彩色植物體內(nèi)，是水溶性類黃酮物質(zhì)的一種，同時(shí)也是一種天然的食用色素，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如水溶性好、食用安全等，目前已普遍被消費(fèi)者所接受。此外，在健康養(yǎng)生方面花青苷也起到不可忽視的作用：能緩解視覺疲勞、增強(qiáng)記憶力，同時(shí)還能清除體內(nèi)過多的自由基[2]，可以改善血液循環(huán)、預(yù)防心血管疾病、抗癌防癌[3]。元寶楓秋色葉中花青苷含量相當(dāng)豐富，葉片中花青苷的開發(fā)利用價(jià)值潛力無限。

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)花青苷的測(cè)定一般有3種方法：高效液相色譜法、單一pH法和pH示差法。高效液相色譜法具備高效、樣品不被破壞、靈敏度高、分析速度快、易回收等優(yōu)點(diǎn)，且方法精密度高、重復(fù)性好，但在不明確樣品中的花青苷單體組成時(shí)，該方法的使用受到限制；單一pH法雖操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低； pH示差法不僅操作方法簡(jiǎn)便、設(shè)備儀器價(jià)格低廉、便于推廣，而且準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好[4]。所以，本試驗(yàn)用pH示差法測(cè)定新選育品系花青苷含量差異，以篩選出高含量品系，發(fā)掘高含量品系在食品及保健品方面的應(yīng)用潛力，為元寶楓新品系的育種推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料：本試驗(yàn)所用材料取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)田，均為嫁接繁殖的元寶楓無性系。共5個(gè)品系：1-1、1-6、1-7、6-1、6-2，前3個(gè)為秋季紅色葉品系，后2個(gè)為秋季黃色葉品系。于2015年11月至12月期間葉片轉(zhuǎn)色后采集葉片并進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)儀器：UV-1600 型紫外-可見分光光度計(jì)（ 尤尼科儀器有限公司） 、電子分析天平（ 上海越平科學(xué)儀器有限公司） 、PHSJ-4A 型酸度計(jì)（ 上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司） 、RE52CS-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （ 上海亞榮生化儀器廠）、HZ-8211K型恒溫震蕩箱。

1.2 試驗(yàn)試劑

1.2.1 試驗(yàn)試劑 無水乙醇、濃鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司） 等。以上試劑均為分析純。

1.2.2 試劑的配制 1%鹽酸乙醇：濃鹽酸與無水乙醇體積比1∶99配制。1.2 mol·L-1鹽酸-70%乙醇溶液：濃鹽酸、無水乙醇與去離子水體積比是1∶7∶2。pH計(jì)緩沖液：pH計(jì)自帶的pH值為4.0和6.86的緩沖劑粉配制。

1.3 元寶楓花青苷含量的定性分析

1.3.1 最佳浸提溫度的選擇 稱取1 g植物材料迅速放入研缽中，液氮研磨成粉狀，溶于50 mL 1%鹽酸乙醇溶液中，放于4 ℃冰箱靜置過夜。另外，稱取5份1 g植物材料研磨成粉后，然后放入裝有1%鹽酸乙醇溶液50 mL的錐形瓶中，至于 160 r·min-1震蕩培養(yǎng)箱中避光震蕩提取6 h，震蕩溫度分別設(shè)置成15，25，35，45，55 ℃[5]。浸提完成后過濾，殘?jiān)?30 nm處分別測(cè)定吸光度，確定最佳浸提溫度。

1.3.2 pH值的選擇 pH示差法pH值的確定：將上述浸提液10倍稀釋后，用檸檬酸或檸檬酸鈉調(diào)節(jié)其pH值構(gòu)建pH梯度[6]，以pH值為橫坐標(biāo)繪制pH值-OD值曲線，確定測(cè)量最佳pH值及pH示差法的最適pH值。要求所選定的兩個(gè)pH 值在其左右變動(dòng)時(shí)OD值變化不大。

1.3.3 浸提液平衡時(shí)間的確定 在選定的最合適浸提溫度下浸提后，對(duì)浸提液進(jìn)行稀釋，然后在選定的兩個(gè)pH值條件下每隔10 min測(cè)1次提取液的吸光度，記錄OD值隨時(shí)間的變化。

1.3.4 回收率的計(jì)算 通過加入回收法測(cè)定本試驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 不同品系花青苷含量的測(cè)定 將浸提液靜置至反應(yīng)平衡后，在已測(cè)得的最佳 pH 值下，測(cè)量花青苷的OD值，平行測(cè)定6 次，算出花青苷含量。

花青苷含量計(jì)算公式：花青苷含量（mg·g-1） = ΔDVFM × 1 000 /（εm）[7]

式中：ΔD為 pH 值為1.0，4.5 時(shí)吸光度的差值； V為稀釋體積（單位，L）； F為稀釋倍數(shù)； M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2 g·mol-1；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900 L·（mol·cm） -1；m為樣品質(zhì)量（單位，g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳浸提溫度

相關(guān)研究表明，溫度對(duì)花青苷的穩(wěn)定性有顯著影響。當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí)，浸提液中的絕大多數(shù)的花青苷會(huì)變成查爾酮式結(jié)構(gòu)[8-9]，而浸提液的顏色也幾近無色。所以，本試驗(yàn)以溫度為變量設(shè)置溫度梯度，以溫度為橫坐標(biāo)繪制溫度-OD值柱形圖，通過OD值的測(cè)定來確定最佳浸提溫度，結(jié)果如圖1示。在溫度為25 ℃時(shí)，浸提液的OD值最高；且通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為15，25，35，45 ℃時(shí)浸提液的OD值相差不大，即浸提溫度在15～45 ℃之間浮動(dòng)時(shí)對(duì)花青苷浸提效果的影響較小；當(dāng)溫度為5 ℃時(shí)，浸提液的OD值相對(duì)較小，可見溫度太低時(shí)，葉片中的花青苷會(huì)浸提不完全；在浸提溫度為55 ℃時(shí)浸提液的OD值開始下降，即高溫造成了花青苷結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。綜上所述，25 ℃為花青苷浸提的最佳溫度。

2.2 pH值的選擇

花青苷是極性化合物，易溶于水等非極性有機(jī)溶劑，在pH值不同的溶劑中由于分子結(jié)構(gòu)的不同會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色。在pH值小于或等于3的酸性條件下可以穩(wěn)定存在，其顏色也隨pH值的變化而變化，pH<7時(shí)為穩(wěn)定存在的紅色，pH>7時(shí)不能穩(wěn)定存在[10]，所以，本試驗(yàn)在酸性介質(zhì)中測(cè)定。以pH值為變量繪制的pH值-OD值曲線如圖2所示。由此圖可以得出：在pH值等于1的時(shí)候，花青苷含量最高即在pH值等于1時(shí)花青苷最穩(wěn)定；且pH值在0.5～1.5、4.0～5.0之間變動(dòng)時(shí)OD值上下變動(dòng)幅度不大，花青苷存在相對(duì)穩(wěn)定，符合pH示差法的試驗(yàn)要求?？梢缘贸鼋Y(jié)論：本試驗(yàn)中示差法選定的pH值為1.0，4.5。

2.3 浸提液平衡時(shí)間

花青苷在不同pH 值的溶液中存在狀態(tài)不一樣[11]，在加入不同pH值的緩沖液后，必須靜置一段時(shí)間，使溶液達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，再進(jìn)行吸光度的測(cè)定。通過對(duì)浸提液稀釋后吸光度的測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，樣品稀釋60 min后OD值不再變化，因此，本試驗(yàn)選擇的平衡時(shí)間為60 min。

2.4 回收率計(jì)算

將浸提液10倍稀釋后取兩份等體積的溶液（標(biāo)號(hào)A、B）放入干燥器內(nèi)50 ℃以下干燥。材料A完全干燥后一份加入之前一樣體積的浸提液；另一份加入等體積的1.2 mol·L-1鹽酸-70%乙醇溶液，測(cè)得量為加標(biāo)量；將材料A測(cè)得的花青苷含量減去原花青苷浸提液中的含量計(jì)為實(shí)際測(cè)得量，重復(fù)測(cè)定3次。測(cè)定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：樣品最高回收率是97.14%，最低回收率是96.39%，平均回收率為96.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.42%；回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合試驗(yàn)要求，所以用本方法測(cè)定花青苷含量準(zhǔn)確可靠。

2.5 不同無性系花青苷含量的測(cè)定

通過pH示差法測(cè)得的元寶楓各個(gè)品系的花青苷含量如表3所示。可以看出：花青苷含量最高的是1-7，含量為0.845 3 mg·g-1；花青苷含量最低的是6-1，含量為0.134 8 mg·g-1；5個(gè)品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。紅色品系（1-1、1-6、1-7）花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1，黃色品系（6-1、6-2）的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1，紅色品系中花青苷平均含量是黃色品系平均含量的4倍。由此可知：本試驗(yàn)田所培育的無性系元寶楓葉片中花青苷的含量非常豐富，尤其是紅色品系中的1-7號(hào)，高含量的花青苷使其在花青苷的提取應(yīng)用方面起到不容忽視的作用，如加工成食品及保健產(chǎn)品。同時(shí)，高含量的花青苷使其葉色更鮮紅，在秋季表現(xiàn)出優(yōu)良的觀賞特性，在同類型的秋季觀葉樹種中更具有園林應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)[12-14]。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)田選擇了5個(gè)不同品系的元寶楓，3個(gè)紅色品系，2個(gè)黃色品系，通過pH示差法對(duì)其花青苷含量進(jìn)行測(cè)定比較，同時(shí)對(duì)其浸提條件也進(jìn)行了比較優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示：浸提溫度和pH值對(duì)花青苷含量的測(cè)定有很大的影響，在溫度為25 ℃和pH值為1的條件下浸提效果最佳；花青苷含量最高的是無性系1-7號(hào)，含量為0.845 3 mg·g-1；5個(gè)品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1，紅色品系（1-1、1-6、1-7）花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1，黃色品系（6-1、6-2）的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1，紅色品系中花青苷平均含量是黃色品系平均含量的4倍。因此，高含量的花青苷使本試驗(yàn)田中的紅色品系在提取色素和秋季葉顯色方面都有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

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