用小種特異分子標(biāo)記分析2015年云南小麥條銹菌的生理小種組成

浦仕獻(xiàn)+楊雅婷+張培花+李銳+馬艷+彭莞云+楊靜+李成云+劉林

摘 要：用 7個(gè)小麥條銹菌生理小種分子標(biāo)記（條中23，條中29，條中 31，條中32，條中33，，V26和水源型）分析云南省小麥主產(chǎn)區(qū)采集的1 206份小麥條銹病的樣品，進(jìn)行生理小種檢測(cè)分析。結(jié)果表明：2015年條中33號(hào)生理小種（CYR33）在云南各小麥主產(chǎn)區(qū)的檢出率都是最高的，其檢出率都在90%以上，是云南各小麥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)小種；在用近幾年新出現(xiàn)的新菌系V26新菌系檢測(cè)云南的小麥條銹菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)V26新菌系在云南小麥條銹菌中的檢出率也較高，各地的檢出率均達(dá)72.0%以上，后期有可能上升為小麥條銹菌的優(yōu)勢(shì)小種；另外，單個(gè)病斑能夠檢出1～7個(gè)不等的小麥條銹菌生理小種，而且95%以上的樣品能夠從單個(gè)病斑上檢出3個(gè)或3個(gè)以上的生理小種，這暗示著小麥條銹病存在多個(gè)小種復(fù)合侵染的情況且很普遍。

關(guān)鍵詞：小麥條銹菌；小種特異分子標(biāo)記；生理小種

中圖分類號(hào)：S435.121.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.006

Abstract： In this study， physiological races， including 1 206 samples of wheat strip rust gathered from Yunnan Province， were monitored by using 7 physiological races specified primer of PST （CYR23， CYR 29， CYR 31， CYR32， CYR33， CYRSU and V26）. The result showed that CYR33 detection rate is the highest， being above of 90%， and it is the predominant races in Yunnan Province in 2015. The race of V26， a new PST pathotype in recent years， had virulence to stripe rust resistance gene Y26 which was widely used in wheat breeding programs in China. The V26 specific marker was first used to detected physiological race of wheat stripe rust in Yunnan， and the rates was more than 72.0% among different areas， and V26 could be the dominant race. In addition， 1～7 physiological races were detected from single disease spot in all samples. And the proportion of samples， detected 3 or more than 3 physiological races from single disease spot， was above 95%. It was implied that for wheat stripe rust disease the mixed infection phenomenon is widely spread.

Key words： Puccinia striiformis West. f. sp. tritici Eriks； race-specific-molecular-markers； physiological race

小麥條銹?。≒uccinia striiformis West. f. sp. tritici Eriks.）是嚴(yán)重威脅小麥安全生產(chǎn)的重大流行性病害，其發(fā)生危害已有三千多年的歷史。在我國(guó)，小麥條銹病以其發(fā)生區(qū)域廣、致害性變異快、流行頻率高、危害損失重等特點(diǎn)成為小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要障礙。

監(jiān)測(cè)小麥條銹菌生理小種的組成情況是研究合理布局小麥品種、防治小麥條銹病發(fā)生和流行的基礎(chǔ)，并可為抗病育種提供信息。長(zhǎng)期以來，人們通過鑒別寄主進(jìn)行小麥條銹菌生理小種的鑒定。但是，小麥條銹菌為專性寄生真菌，用鑒別寄主鑒定和監(jiān)測(cè)小麥條銹菌的生理小種均需在感病品種銘賢169上進(jìn)行擴(kuò)繁后，再利用鑒別寄主進(jìn)行生理小種劃分。其方法比較繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以同時(shí)完成大量菌源的檢測(cè)，而且小麥?zhǔn)懿≡秩镜姆磻?yīng)型易受人為因素影響，如果經(jīng)驗(yàn)不豐富很容易造成人為誤差?；谝陨喜蛔阒?，人們嘗試通過小麥條銹病菌特異分子標(biāo)記檢測(cè)小麥條銹病菌生理小種。目前，已經(jīng)開發(fā)的小麥條銹菌生理小種分子標(biāo)記有： CYR23[1]，CYR29[2]，CYR31[3]，CYR32[4]，CYR33[4]，CYRSU[1]和V26[5] 共7個(gè)小麥條銹菌的生理小種分子標(biāo)記。這為小麥條銹菌生理小種的分子檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

云南大部分地區(qū)氣候溫和，四季如春，夏無酷暑，冬無嚴(yán)寒，復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境及氣候類型，以及四季有麥種的生產(chǎn)方式，為條銹菌的周年循環(huán)提供了天然的綠色橋梁，是我國(guó)小麥條銹菌主要的越夏菌源地之一。云南具有我國(guó)小麥條銹病越夏菌源地的重要特征及遠(yuǎn)距離傳播的充要條件，在明確云南小麥條銹菌與其它流行區(qū)的關(guān)系之前，系統(tǒng)認(rèn)識(shí)其群體結(jié)構(gòu)十分重要，這有助于揭示條銹菌的起源、進(jìn)化及傳播。

長(zhǎng)期以來，研究者們對(duì)云南小麥條銹菌生理小種的檢測(cè)多也采用鑒別寄主法，但他們用于云南小麥條銹菌生理小種檢測(cè)的樣品量較少，有的地區(qū)僅用了幾份樣品進(jìn)行分析[7-9]，這不足以代表云南小麥條銹菌群體的生理小種組成。另外，本研究小組利用前人發(fā)表的小麥條銹菌生理小種檢測(cè)的分子標(biāo)記，分析了2009—2011年云南小麥主產(chǎn)區(qū)的小麥條銹菌生理小種，其檢測(cè)結(jié)果與這幾年云南省主要流行的生理小種基本一致[10-11]。因此，用這些生理小種分子標(biāo)記監(jiān)測(cè)云南省小麥條銹菌的生理小種組成是基本可行的。

本研究利用已報(bào)道的7對(duì)小麥條銹菌生理小種分子標(biāo)記，檢測(cè)了2015年云南省曲靖、玉溪、大理、昭通和德宏、昆明等6個(gè)地區(qū)的1 206份小麥條銹菌樣品的生理小種組成情況，并在此基礎(chǔ)上分析了各地小麥條銹菌群體之間的關(guān)系，以為來年預(yù)測(cè)小麥條銹菌的生理小種組成提供依據(jù)，同時(shí)也為通過合理布局抗病品種預(yù)防小麥條銹菌的發(fā)生與流行奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 小麥條銹菌樣品 用于本試驗(yàn)的小麥條銹菌樣品為采集自云南玉溪、大理、德宏、曲靖、昆明、昭通、楚雄、臨滄和文山9個(gè)地區(qū)的小麥條銹菌樣品。樣品采集時(shí)均選擇葉面比較干凈，小麥條銹菌孢子飽滿，病斑單一或界限比較明顯的小麥條銹病樣品進(jìn)行采集。每個(gè)樣品采集后用自制的樣品采集袋對(duì)小麥條銹菌樣品進(jìn)行獨(dú)立包裝和干燥，防止小麥條銹菌樣品發(fā)生霉變和樣品間的病菌交叉污染，以便后期提取單個(gè)病斑上小麥條銹菌的DNA。小麥條銹菌樣品采集的詳細(xì)信息見表1。

1.1.2 引 物 用于本試驗(yàn)小麥條銹菌生理小種檢測(cè)的CYR23SP、CYR29SP、CYR31SP、CYR32SP、CYR33SP、V26和CYRSU 7個(gè)生理小種特異引物均選自目前已正式發(fā)表的論文，其引物的詳細(xì)信息如表2所示。

1.1.3 試驗(yàn)所用的儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、烘干箱、電子天平、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、Microfuge18離心機(jī)、藍(lán)盾522可見光凝膠電泳透射儀、PCR儀、78HW-1恒溫加熱磁力攪拌器、GeneQuant pro蛋白核酸分析儀、lmagequant300 膠凝成像系統(tǒng)。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 用本課題組研發(fā)的Chelex-100法[12]：用200 μL的移液槍移取150 μL的20% Chelex-100（1/3肉眼可見的透明小珠子；20%的Chelex：20 g的Chelex加80 mL ddH2O（滅菌））溶液到1.5 mL的無菌離心管內(nèi)，用10 μL的移液槍吸取5 μL的Chelex-100的上清液到單孢菌斑（約0.5 mm2）的小麥條銹病菌的小麥葉片上，用上清液反復(fù)沖洗病菌的孢子直到能明顯看見黃色的孢子為止。把試管放在沸水中水浴2 min，并在漩渦儀上振蕩20 s，再水浴5 min。離心上清液即為所提取的DNA，將所提取的DNA保存于-20 ℃下備用。

1.2.2 小麥條銹菌生理小種的特異分子標(biāo)記檢測(cè) 檢測(cè)小麥條銹菌時(shí)的PCR反應(yīng)體積為10 μL，其中包括：Buffer 1 μL，引物（10 ng·μL-1）0.8 μL（前引物與后引物各0.8 μL），dNTP 0.8 μL，TaqE 0.08 μL，模板DNA（25 ng·μL-1） 1 μL，ddH2O 6.92 μL。每次反應(yīng)均設(shè)立ddH2O陰性對(duì)照。擴(kuò)增在ABI PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 45 s，35～57 ℃ 45 s（溫度由引物來決定，具體溫度如表2所示），72 ℃ 1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，一個(gè)循環(huán)；20 ℃保存，待PCR結(jié)束后。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4 μL的含有花青素的Loading-buffer并充分混勻，經(jīng)1.2%～2.0%（具體濃度由引物來決定）的瓊脂糖凝膠在200 V下電泳45 min，并用膠凝成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照及帶型分析。

2 結(jié)果與分析

利用小麥條銹菌生理小種特異引物檢測(cè)了采集自云南的1 206份小麥條銹病菌DNA樣品，條中23（CYR23），條中29（CYR29），條中31（CYR31），條中32（CYR32），條中33（CYR33），V26和水源型（CYRSU）等7個(gè)云南主要流行小種的情況，對(duì)所有樣品的PCR擴(kuò)增情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，條中33號(hào)生理小種（CYR33）在2015年云南各小麥主產(chǎn)區(qū)的檢出率最高，其檢出率均在90.0%以上，為各地2015年的優(yōu)勢(shì)小種，條中31號(hào)生理小種（CYR31）在各地的檢出率均最低，甚至在大理（漾濞和彌渡）、德宏、昆明、楚雄、文山（丘北和廣南）均未檢測(cè)出該生理小種，其余各地的檢出率也未超過50.0%。2015年首次使用小麥條銹菌新菌系V26的SCAR分子標(biāo)記分析云南小麥各主產(chǎn)區(qū)V26新菌系的分布情況，從結(jié)果可以看出，小麥條銹菌新菌系V26在云南各小麥主產(chǎn)區(qū)的檢出率都比較高，其檢出率僅次于條中33號(hào)優(yōu)勢(shì)小種（大理漾濞除外，其檢出率低于CYR29， CYR32， CYR33和CYRSU水源型小種）。另外，其余4生理小種（CYR23、CYR29、CYR32、CYRSU）的檢出率在各小麥主產(chǎn)區(qū)的檢出率均不相同，其檢出率在50.0%至85.0%之間。從整體上看，2015年云南小麥主產(chǎn)區(qū)小麥條銹菌各生理小種的檢出率從高到低依次為：CYR33>V26> CYRSU> CYR32> CYR29> CYR23> CYR31。

本試驗(yàn)對(duì)各地采集的1 206份小麥條銹菌樣品單個(gè)病斑上的小麥條銹菌生理小種的檢測(cè)情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)用現(xiàn)有的7個(gè)小麥條銹菌生理小種特異引物檢測(cè)所采集的小麥條銹菌樣品，在單個(gè)病斑上能夠同時(shí)檢測(cè)出生理小種數(shù)最多的為7個(gè)生理小種，其樣品主要來自玉溪易門縣、昭通、臨滄、曲靖麒麟?yún)^(qū)和沾益縣，而來自于大理漾濞、大理彌渡、德宏、昆明、楚雄、文山丘北和廣南地區(qū)的小麥條銹菌樣品單個(gè)病斑上能最多能檢測(cè)出6個(gè)生理小種，且所有參試樣品中最少也能在單個(gè)病斑上檢測(cè)出1個(gè)生理小種，其樣品主要來自玉溪易門縣、大理漾濞、大理彌渡、德宏、臨滄和曲靖麒麟?yún)^(qū)（表4）。從表4中還可以看出，在所有的樣品中，單個(gè)病斑檢測(cè)出4個(gè)或4個(gè)以上生理小種的概率（其檢出概率均在77.0%以上）明顯多于同時(shí)檢出3個(gè)及3個(gè)以下生理小種的概率。雖然各地單個(gè)病斑上同時(shí)檢出多個(gè)生理小種的概率不同，但從總體來看，單個(gè)病斑在7個(gè)生理小種中檢出5個(gè)生理小種的概率最高，達(dá)到29.9%，其次為6個(gè)（27.5%）和4個(gè)（27.5%）的比例；檢出了一個(gè)生理小種的樣品的比例最少，只有1%。由此可以看出，單個(gè)病斑上小麥條銹菌生理小種的組成非常復(fù)雜。

3 結(jié)論與討論

小麥條銹病是嚴(yán)重影響我國(guó)小麥安全生產(chǎn)的主要生物限制因子。長(zhǎng)期以來，人們一直通過抗病品種的利用和化學(xué)農(nóng)藥防治的方法防治小麥條銹病的發(fā)生和發(fā)展。小麥條銹菌毒性變異頻繁，幾乎平均3～5年便會(huì)有小麥條銹菌新小種的產(chǎn)生，例如：1958年發(fā)現(xiàn)了條中2號(hào)（CYR2）和條中8號(hào)（CYR8），1960年發(fā)現(xiàn)了條中10號(hào)（CYR10），甚至在1972—1977年短短5年的時(shí)間中先后發(fā)現(xiàn)了條中18號(hào)（CYR18）、條中19號(hào)（CYR19）、條中20號(hào)（CYR20）、條中23號(hào)（CYR23）、條中21號(hào)（CYR21）、條中24號(hào)（CYR24）、條中22號(hào)（CYR22）條中26號(hào)（CYR26）9個(gè)生理小種[13]，新小種如此頻繁的產(chǎn)生給利用抗病品種防治小麥條銹病帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。因此，有不少植保工作者常年置身于小麥條銹菌生理小種的監(jiān)測(cè)和小麥條銹病流行的研究，希望通過對(duì)小麥條銹菌生理小種的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)與小麥品種的合理布局實(shí)現(xiàn)有效地防治小麥條銹病的發(fā)生和流行。有資料表明，云南省、四川省和西藏地區(qū)的小麥條銹菌有著菌源交流[14]。因此，長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)云南地區(qū)小麥條銹菌的生理小種組成有助于了解四川、西藏等周邊地區(qū)小麥條銹菌生理小種的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，為云南及周邊地區(qū)合理布局抗病品種，防治小麥條銹病的流行提供依據(jù)。

小麥條銹菌生理小種的監(jiān)測(cè)，長(zhǎng)期以來一直使用傳統(tǒng)的鑒別寄主法開展。傳統(tǒng)的鑒別寄主法首先需要通過感病品種對(duì)專性寄生真菌——小麥條銹菌進(jìn)行擴(kuò)繁，然后再用鑒別寄主進(jìn)行鑒定，這不但對(duì)小麥條銹菌生理小種鑒定期間的環(huán)境條件要求非常嚴(yán)格，必須控制好銹菌孢子的濃度，接種時(shí)的溫度、濕度、光照等各種因素，而且還要求生理小種鑒定的人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，以免產(chǎn)生人為的誤差。因此，用目前已經(jīng)開發(fā)的小麥條銹菌生理小種分子標(biāo)記監(jiān)測(cè)小麥條銹菌生理小種組成的動(dòng)態(tài)變化，能夠有效地避免上述缺點(diǎn)的產(chǎn)生，而且能夠有效彌補(bǔ)鑒別寄主法難以監(jiān)測(cè)多個(gè)小種同時(shí)侵染小麥引起小麥條銹病的不足。通過人工接種的結(jié)果表明，小麥能夠被多個(gè)小種復(fù)合侵染[15]。通過生理小種檢測(cè)單個(gè)病斑小麥條銹菌生理小種組成的結(jié)果也表明，多個(gè)小種能夠共存于一個(gè)病斑上[10-11]。本研究的結(jié)果也表明，一個(gè)病斑上能夠監(jiān)測(cè)到多個(gè)生理小種存在，而且用7個(gè)生理小種分子標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果表明，7個(gè)小種可以同時(shí)存在于1個(gè)病斑上。因此，無論是從表型還是基因型方面都表明，自然界中的小麥條銹病是小麥條銹菌群體侵染引起的病害。

致謝：作者浦仕獻(xiàn)和楊雅婷主要完成了本文的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)本文貢獻(xiàn)等同，劉林和李成云對(duì)文章撰寫的思路和修改進(jìn)行了把關(guān)，貢獻(xiàn)等同；另外感謝曲靖市農(nóng)業(yè)科學(xué)院唐永生、玉溪易門縣植保植檢站、大理漾濞縣植保植檢站和彌渡縣植保植檢站、文山廣南植保植檢站和丘北植保植檢站在樣品采集過程中給予的幫助。

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