褪黑素對大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其對TGF-β1表達(dá)的影響

汪玉榮，洪汝濤，謝園園

褪黑素對大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其對TGF-β1表達(dá)的影響

汪玉榮，洪汝濤，謝園園

目的 探討褪黑素對大鼠肝纖維的保護(hù)作用及其對轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）表達(dá)的影響。方法 選擇60只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、褪黑素低劑量組及褪黑素高劑量組，每組15只。采用連續(xù)6周皮下注射CCl4方法制備肝纖維化大鼠模型。生化法測定大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性及白蛋白（ALB）含量。分光光度計(jì)法測定肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量；HE染色及Van Gieson（VG）染色方法評價(jià)肝臟病理改變；免疫組化法測定肝組織中TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，褪黑素處理組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），褪黑素高劑量組大鼠血清ALB含量明顯升高（P＜0.05）；褪黑素處理組大鼠肝組織Hyp含量較模型組明顯降低（P＜0.01）；褪黑素高劑量組大鼠纖維病理評分明顯低于模型組（P＜0.05）；TGF-β1在褪黑素處理組大鼠肝臟中的表達(dá)較模型組明顯較少（P＜0.01）。結(jié)論 褪黑素對大鼠肝纖維化有保護(hù)作用，其可能的作用機(jī)制為抑制TGF-β1的表達(dá)。

褪黑素；肝纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子β1

肝纖維化為慢性肝病的共同病理特征，最終可發(fā)展為肝硬化甚至原發(fā)性肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。研究［1］證明肝纖維化為一動(dòng)態(tài)過程，可逆轉(zhuǎn)。但是目前臨床尚無治療肝纖維化很有效的藥物。褪黑素作為松果腺體分泌的一種重要激素，對肝纖維化具有保護(hù)作用，且機(jī)制與其強(qiáng)大的抗氧化作用有關(guān)［2］。但是褪黑素抗纖維化的作用機(jī)制尚不完全清楚。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作為肝纖維化氧化應(yīng)激過程產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，抑制TGF-β1的表達(dá)可改善肝纖維化［3］。該研究探討褪黑素對CCl4致大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其對TGF-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只普通級SD雄性大鼠，180～220 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，提供正常飲食。

1.2 主要試劑及儀器 褪黑素購于美國Sigma公司，溶解于酒精及0.9%生理鹽水中（酒精含量≤1%）；CCl4購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑合肥有限公司；Van Gieson（VG）染色試劑盒購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司；組織蛋白及羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；兔多克隆抗體TGF-β1抗體購于美國Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗試劑盒及DAB試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；瑞士Roche Modular DPP全自動(dòng)生化分析儀購于瑞士羅氏公司；752 N分光光度計(jì)購于上海綠宇生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡及倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.3 動(dòng)物處理 SD大鼠被隨機(jī)分為正常組、模型組、褪黑素低劑量組及褪黑素高劑量組，每組15只。將CCl4與精制花生油以2∶3的體積比制成40% CCl4。模型組及褪黑素處理組給予40%CCl43 ml/ kg，正常組給予等體積花生油，皮下注射，每周2次，連續(xù)6周。自皮下注射CCl4之日起，腹腔注射褪黑素：褪黑素低劑量組5.0 mg/kg，褪黑素高劑量組10.0 mg/kg，正常組及模型組給予等體積1%乙醇溶液（乙醇+生理鹽水），每天1次，連續(xù)6周。每周稱大鼠體重1次，根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。6周末，所有動(dòng)物禁食12 h后以10%水合氯醛麻醉處死，腹主動(dòng)脈取血，4℃、5 000 r/min離心15 min，收集血清標(biāo)本，并取新鮮肝臟同一部位用10%中性甲醛固定，以備石蠟包埋行病理及免疫組化檢查，其余肝臟組織放入液氮中備用。

1.4 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及白蛋白（ALB）含量的測定 大鼠血清ALT、AST 及ALB水平采用瑞士Roche Modular DPP全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測定。

1.5 肝組織Hyp含量測定 精確稱取新鮮肝臟組織100 mg，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，采用分光光度計(jì)測定吸光度值，計(jì)算大鼠肝組織Hyp的含量。采用考馬斯亮藍(lán)法測定肝組織蛋白含量。

1.6 病理學(xué)檢查 取同一部位肝臟組織行10%中性甲醛固定、石蠟包埋并5 μm連續(xù)切片。按常規(guī)步驟行HE染色，按試劑盒說明書步驟行VG染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理結(jié)果。按Metavir半定量評分系統(tǒng)［4］進(jìn)行肝纖維化病理評分，0：正常肝臟；1：匯管區(qū)纖維化，無纖維間隔；2：匯管區(qū)纖維化，少量纖維間隔；3：匯管區(qū)纖維化，纖維間隔很多，無肝硬化；4：肝硬化。

1.7 免疫組化法測定肝組織中TGF-β1表達(dá) 石蠟包埋組織塊，5 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，0.5%～1.0%過碘酸30 s滅活內(nèi)源性過氧化物酶，放入微波爐中檸檬酸鹽抗原修復(fù)（1次2 min，循環(huán)5次），予以正常山羊血清行抗原封閉，加入一抗TGF-β1（1∶450），4℃孵育過夜，按試劑盒說明書步驟加二抗，加DAB鏡下顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。每批實(shí)驗(yàn)均以PBS液代替一抗設(shè)置陰性對照。有明顯黃色/棕黃色/褐色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)的視野（×400），用O-lympus倒置顯微鏡攝片，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定光密度（optical density，OD）值，計(jì)算平均OD值作為該切片的OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，LSD法進(jìn)行兩組間比較。等級資料采用Ridit檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝功能測定結(jié)果 模型組大鼠死亡2只，其余3組大鼠均未見死亡。與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST活性明顯升高，ALB含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素低劑量組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），血清ALB含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），褪黑素高劑量組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），ALB含量明顯升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 大鼠肝組織Hyp含量測定結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠肝組織Hyp含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝組織Hyp含量明顯降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織Hyp的含量

2.3 大鼠肝臟病理檢查結(jié)果 HE及VG染色結(jié)果顯示：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，幾乎無膠原纖維沉積；模型組大鼠肝臟肝細(xì)胞腫大、脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤明顯，且肝小葉尤其匯管區(qū)膠原蛋白沉積明顯，纖維間隔顯著；褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝小葉肝細(xì)胞脂肪變性明顯，炎性細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積程度較模型組明顯減少。見圖2、3。與正常組相比，模型組大鼠纖維化病理分級評分明顯升高（U＞2.58，P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素高劑量組大鼠纖維化病理分級評分明顯降低（U＞1.96，P＜0.05）。褪黑素低劑量組與模型組纖維化病理分級評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U＜1.96，P＞0.05）。見表2。

圖2 各組大鼠肝臟病理HE染色 ×200

2.4 大鼠肝臟TGF-β1表達(dá)結(jié)果 TGF-β1主要表達(dá)于肝臟組織中肝星狀細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞及纖維化附近的炎癥細(xì)胞胞質(zhì)中。正常組大鼠肝臟組織中未見棕黃色、褐色陽性顆粒，TGF-β1幾乎無

表1 褪黑素對CCl4肝纖維化大鼠肝功能的影響（）

表1 褪黑素對CCl4肝纖維化大鼠肝功能的影響（）

與正常組比較：＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 數(shù)量 ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L）正常 15 48.00±13.37 157.27±16.18 33.49±3.00模型 13 336.92±26.48＊＊ 438.15±26.79＊＊ 28.43±3.28＊＊褪黑素低劑量 15 222.27±28.43## 313.80±21.23## 30.83±4.07褪黑素高劑量 15 202.20±27.09## 281.53±25.57## 31.04±3.11#

圖3 各組大鼠肝臟病理VG染色 ×200

表2 褪黑素對大鼠肝組織肝纖維化病理分級評分的影響

模型組大鼠肝臟組織中可見明顯的棕黃色及褐色顆粒，且主要位于匯管區(qū)纖維組織中，TGF-β1表達(dá)較正常組明顯增加。褪黑素低劑量及高劑量組大鼠肝臟組織中可見棕黃色陽性顆粒，且主要位于匯管區(qū)，但是陽性顆粒較模型組明顯減少，TGF-β1表達(dá)量較模型組明顯減少。見圖4。與正常組相比，模型組大鼠肝臟TGF-β1表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝臟TGF-β1表達(dá)量明顯減少（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種致病因素持續(xù)或反復(fù)損傷的一種慢性修復(fù)反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維的過度沉積為特征［5］。Hyp主要存在于膠原蛋白中，其他蛋白中含量極少或不存在，故其含量的測定可用于反映纖維化嚴(yán)重程度［6］。本研究采用連續(xù)6周皮下注射CCl4制備大鼠肝纖維化模型。與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST活性明顯升高，血清ALB含量明顯降低，肝組織Hyp含量明顯增加，肝臟組織肝細(xì)胞變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤明顯，匯管區(qū)纖維沉積及肝小葉纖維間隔明顯增加，肝臟纖維化病理分級評分明顯增加，說明CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型制備成功。與模型組相比，褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝功能明顯改善，肝組織Hyp含量明顯減少，且肝臟炎癥壞死及纖維沉積程度均明顯降低，可見褪黑素對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有明顯的保護(hù)作用。

圖4 各組大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)情況 ×400

圖5 各組大鼠肝組織TGF-β1的表達(dá)

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧色氨酸）是松果腺體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，有強(qiáng)大的自由基清除能力，是一種很強(qiáng)的抗氧化劑。褪黑素除清除自由基直接抗氧化作用外，還能提高機(jī)體抗氧化酶活性間接增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能［7］。研究［8-9］證明褪黑素能減輕多種原因?qū)е碌母卫w維化，且作用機(jī)制與抗氧化作用相關(guān)。

氧化應(yīng)激促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，大量細(xì)胞因子得以產(chǎn)生并釋放，加速肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，其中TGF-β1是最重要的促纖維化細(xì)胞因子［10］。TGF-β1主要通過活化肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化的形成：肝臟接受各種病理刺激時(shí)，肝內(nèi)庫普弗細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞及血小板釋放TGF-β1，激活靜止?fàn)顟B(tài)的肝星狀細(xì)胞，活化的肝星狀細(xì)胞釋放更多的TGF-β1并進(jìn)一步促進(jìn)自身的增殖及活化，活化的肝星狀細(xì)胞合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)并沉積于肝臟內(nèi)。TGF-β1除直接激活肝星狀細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)外，其還能通過抑制組織金屬蛋白酶并促進(jìn)組織金屬蛋白酶抑制劑而減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而間接促進(jìn)肝纖維化［11］。研究［12-13］表明減少 TGF-β1表達(dá)可抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。目前未見有關(guān)褪黑素對纖維化肝臟TGF-β1表達(dá)影響的報(bào)道。故本研究探討褪黑素對肝纖維化大鼠的保護(hù)作用及其對TGF-β1表達(dá)的影響。

免疫組化方法結(jié)果顯示：TGF-β1在正常組大鼠肝臟組織中幾乎無表達(dá)；模型組大鼠肝臟組織TGF-β1表達(dá)量明顯增加；褪黑素低劑量及高劑量組大鼠肝臟組織TGF-β1表達(dá)量明顯低于模型組。結(jié)果說明褪黑素對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1的表達(dá)具有抑制作用。褪黑素對TGF-β1的抑制作用與其保護(hù)肝纖維化作用相一致，故考慮褪黑素抗纖維化作用機(jī)制可能與抑制肝臟TGF-β1的表達(dá)相關(guān)。

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Protective effects of melatonin on hepatic fibrosis in rats and its inhibitory effects on TGF-β1

Wang Yurong，Hong Rutao，Xie Yuanyuan
（Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，
Key Laboratory of Disease of Anhui Province，Hefei 230022）

Objective To investigate the protective effects of melatonin on hepaticfibrosis in rats and its effects on the expression of transforming growth factor β1（TGF-β1）in liver.Methods 60 male SD rats were divided randomly into the normal group，the model group and melatonin-treated groups（5.0 mg/kg，10.0 mg/kg；n=15respectively）.The model of liver fibrosis was induced by carbon tetrachloride（CCl4）subcutaneously for 6 weeks continuously.The serum activities of aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）and the levels of albumin（ALB）were detected by an autoanalyzer.The levels of hydroxyproline（Hyp）in liver were measured by spectrophotometry.Changes in liver pathology were examined by hematoxylin and eosin（HE）staining and Van Gieson（VG）staining.The expression of TGF-β1 in liver tissue was evaluated by immunohistochemistry.Results Compared with the model group，serumactivities of ALT and AST were decreased significantly in melatonintreated groups（P＜0.01）.The levels of serum ALB were increased significantly in melatonin-treated group（10.0 mg/kg）compared with the model group（P＜0.05）.In comparison with the model group，the levels of Hyp in liver were decreased significantly in melatonin-treated groups（P＜0.01）.Pathologic grading score of melatonin-treated group（10.0 mg/kg）was much lower than that of the model group（P＜0.05）.The expression of TGF-β1 in liver was decreased remarkably in melatonin-treated groups compared with the model group（P＜0.01）.Conclusion Melatonin protects liver fibrosis，one mechanism of which may be related to the inhibition of TGF-β1 expression in liver.

melatonin；liver fibrosis；transforming growth factor β1

R 575.2

A

1000-1492（2016）09-1248-05

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.008.html

2016-04-16接收

安徽高校省級科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：KJ2013A155）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

汪玉榮，女，碩士研究生；洪汝濤，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hongrutao@163.com