腫瘤壞死因子-α增強(qiáng)血管緊張素Ⅱ?qū)θ顺衫w維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的作用及機(jī)制

羅學(xué)霞，嚴(yán)尚學(xué)，王 穎，吳華勛，陳鏡宇，魏 偉

腫瘤壞死因子-α增強(qiáng)血管緊張素Ⅱ?qū)θ顺衫w維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的作用及機(jī)制

羅學(xué)霞，嚴(yán)尚學(xué)，王 穎，吳華勛，陳鏡宇，魏 偉

目的 明確腫瘤壞死因子（TNF-α）增強(qiáng)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）對人成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）增殖、遷移與侵襲的作用及其部分機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)正常人FLS，用AngⅡ（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）、TNF-α（20 ng/ml）單用或聯(lián)合使用，刺激48 h后，采用CCK8試劑盒檢測FLS增殖功能；Transwell小室法檢測遷移與侵襲功能；激光共聚焦、免疫熒光或蛋白免疫印跡法檢測AngⅡ受體及G蛋白偶聯(lián)受體激酶2（GRK2）的表達(dá)。結(jié)果 AngⅡ（10-7、10-6、10-5mol/L）能促進(jìn)人FLS的增殖 （P＜0.05），最適濃度為10-7mol/L；TNF-α（20 ng/ml）能顯著增強(qiáng) FLS的增殖 （P＜0.05）；AngⅡ（10-7mol/L）與TNF-α（20 ng/ml）聯(lián)合使用可進(jìn)一步促進(jìn)FLS增殖（P＜0.05）；單用AngⅡ（10-7mol/L）、TNF-α（20 ng/ml）或者聯(lián)合使用都能顯著促進(jìn)FLS的遷移（P＜0.01）與侵襲能力（P＜0.05）；單用AngⅡ可顯著升高FLS血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）的表達(dá)水平（P＜0.05），GRK2水平有上升趨勢（P＞0.05）；單用TNF-α可顯著升高FLS的 AT1R和 GRK2的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）；AngⅡ與TNF-α聯(lián)合使用，AT1R與GRK2的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；GRK2抑制劑可以下調(diào)AngⅡ與TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)的FLS遷移、侵襲功能（P＜0.01）。結(jié)論 AngⅡ促進(jìn)FLS增殖、遷移和侵襲，TNF-α可以促進(jìn)AngⅡ介導(dǎo)的FLS增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與上調(diào)FLS的AT1R和GRK2表達(dá)有關(guān)。

血管緊張素Ⅱ；腫瘤壞死因子；滑膜細(xì)胞；遷移；侵襲

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種嚴(yán)重危害人類健康的進(jìn)展性、慢性自身免疫性疾?。?］。RA的成纖維樣滑膜細(xì)胞（RA fibroblast-like synoviocyte，RA-FLS）在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。RA-FLS與免疫細(xì)胞共同作用，通過分泌炎性因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α）、促血管生成因子或基質(zhì)金屬蛋白酶進(jìn)入滑膜液中，導(dǎo)致炎癥加劇、血管翳形成、基質(zhì)降解，并最終引起關(guān)節(jié)骨與軟骨破壞［3］，抑制RA-FLS的增殖、侵襲和遷移是RA治療的重要策略。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的重要組成部分，有兩型受體包括1型受體（angiotensinⅡtype 1 receptors，AT1R）和2型受體（angiotensinⅡtype 2 receptors，AT2R），二者均為G蛋白偶聯(lián)受體。AngⅡ與AT1R作用后，可以刺激血管生成，抑制FLS凋亡［4］、膠原蛋白合成和生長因子的表達(dá)。研究［5］表明，RA患者的外周血單個核細(xì)胞和炎癥滑膜組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、AngⅡ和AT1R表達(dá)升高，提示AngⅡ及其受體參與了RA疾病進(jìn)程。該研究將觀察TNF-α對AngⅡ促進(jìn)人FLS增殖、遷移與侵襲能力的影響，并初步探討其部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 AngⅡ、TNF-α（美國Sigma公司）；G蛋白偶聯(lián)受體激酶2（G-protein-coupled receptor kinases 2，GRK2）抑制劑（C12H9NO6，美國Santa Cruz公司）；兔來源抗人AT1R抗體、AT2R抗體（美國Abcam公司）；兔來源抗GRK2抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；MH7A細(xì)胞株（FLS，廣州吉妮歐生物科技有限公司）；BioTek Elx× 808酶標(biāo)儀（美國 BioTek公司）；ImageQuant Las 4000mini化學(xué)發(fā)光成像分析儀（武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司）；Sp8激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司）；2306-2型CO2培養(yǎng)箱（美國 SHELLAB公司）；IX-70熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）

1.2 方法

1.2.1 FLS的培養(yǎng) FLS培養(yǎng)于50 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長滿至底面90%時，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗2遍，胰蛋白酶消化。顯微鏡下觀察細(xì)胞變形后棄掉胰蛋白酶，加入含20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。根據(jù)細(xì)胞的生長情況及培養(yǎng)液的變化，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次。

1.2.2 CCK8法檢測細(xì)胞的增殖 培養(yǎng)瓶中已經(jīng)長滿的FLS經(jīng)消化、計數(shù)后，用10%FBS培養(yǎng)液稀釋成1×105/ml的細(xì)胞懸液，按每孔100 μl加入96孔板，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。顯微鏡下觀察，待全部細(xì)胞貼壁后，按分組情況每孔加用DMEM培養(yǎng)液配制的10 μl AngⅡ（終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）或TNF-α（終濃度為20 ng/ml），最終體積為110 μl或 120 μl，不足的用DMEM培養(yǎng)液補(bǔ)足液體。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前每孔加入10 μl CCK8試劑，室溫下震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h。肉眼觀察細(xì)胞孔中顏色由黃色變成深橙色，于酶標(biāo)儀中讀取波長450 nm處的吸光度值（optical density，OD）。OD值=實驗組平均OD值-空白組平均OD值，計算細(xì)胞增殖。

1.3 Transwell小室檢測FLS的遷移與侵襲功能

1.3.1 FLS的遷移 24孔板的FLS平鋪至50%時，單獨(dú)加入AngⅡ（終濃度10-7mol/L）、TNF-α（終濃度20 ng/ml）或兩者聯(lián)合加入培養(yǎng)48 h。細(xì)胞消化后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液（1×105/ml），取100 μl加入Transwell小室的上室，下室加入600 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棉簽擦去內(nèi)面未遷移的細(xì)胞，下室已遷移的細(xì)胞用20%甲醇溶液配制的結(jié)晶紫室溫下染色10 min。顯微成像系統(tǒng)鏡檢遷移細(xì)胞數(shù)，4倍鏡視野統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目。

1.3.2 FLS的侵襲 Transwell小室內(nèi)面預(yù)先鋪上20 μl已經(jīng)稀釋好的 Matrigel基質(zhì)膠，放入37℃培養(yǎng)箱中凝固1 h。取100 μl已經(jīng)用AngⅡ（終濃度10-7mol/L）、TNF-α（終濃度20 ng/ml）單獨(dú)或聯(lián)合作用48 h的濃度為1×105個/ml的FLS細(xì)胞懸液，加入已經(jīng)鋪膠的Transwell上室，下室加入600 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，棉簽擦去內(nèi)面未遷移的細(xì)胞，下室已遷移的細(xì)胞用20%甲醇配制的結(jié)晶紫室溫下染色10 min。顯微鏡檢查侵襲細(xì)胞數(shù)，4倍鏡視野統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目。

1.4 激光共聚焦或免疫熒光定位受體的表達(dá) 經(jīng)無菌處理后的載玻片放置于6孔板中，加入含10% FBS培養(yǎng)液稀釋成5×104/ml的FLS懸液1 ml。待細(xì)胞貼壁于載玻片上后，分別加入AngⅡ（終濃度10-7mol/L）、TNF-α（終濃度20 ng/ml），或聯(lián)合使用培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定、Triton打孔、牛血清白蛋白（BSA）封閉后加入兔來源抗人AT1R抗體或抗AT2R抗體，4℃過夜后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，DIPA染色后玻片固定，拍片。

1.5 Western blot法檢測受體及GRK2在FLS的表達(dá)情況 FLS加入6孔板中培養(yǎng)至90%時，分別加入AngⅡ（10-7mol/L）、TNF-α（20 ng/ml）、AngⅡ+ TNF-α、AngⅡ+TNF-α+GRK2抑制劑（終濃度50 μmol/L）后培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，用裂解液裂解FLS并提取細(xì)胞中的總蛋白。蛋白定量后，每孔30 μg蛋白加入10%SDS-PAGE凝膠電泳孔中按操作步驟電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫封閉2 h，加入抗AT1R抗體、抗AT2R抗體、抗GRK2抗體或β-actin抗體4℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h后在化學(xué)發(fā)光成像分析儀中顯影。Image分析軟件分析條帶灰度值，β-actin抗體的條帶灰度值作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以表示，多組樣本間兩兩比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ和TNF-α對FLS增殖的影響 圖1顯示，AngⅡ（10-7、10-6、10-5mol/L）作用于FLS 48 h后可顯著促進(jìn)FLS增殖（F=2.545，P＜0.05）；TNF-α （20 ng/ml）也可明顯促進(jìn)FLS的增殖（F=8.491，P＜0.05），且TNF-α和AngⅡ（10-7、10-6、10-5mol/L）聯(lián)合使用較TNF-α單一刺激更能促進(jìn)FLS增殖（P＜0.05）。根據(jù)增殖實驗結(jié)果，在后述實驗中選定10-7mol/L作為AngⅡ的體外刺激最適濃度。

圖1 AngⅡ與TNF-α誘導(dǎo)FLS的增殖（，n=3）

2.2 AngⅡ和TNF-α對FLS遷移和侵襲能力的影響

與正常組相比，AngⅡ（10-7mol/L）、TNF-α（20 ng/ ml）單用或者聯(lián)合使用都可以增加FLS的遷移能力（F=147.973，P＜0.01）和侵襲能力（F=59.320，P＜0.05）。但單用TNF-α明顯比單用AngⅡ更能促進(jìn)FLS的遷移與侵襲，AngⅡ和TNF-α對FLS的遷移與侵襲能力存在顯著性差異（P＜0.05）。與單用相比，AngⅡ和TNF-α聯(lián)合使用可顯著增加FLS遷移與侵襲的細(xì)胞數(shù)量，GRK2抑制劑（50 μmol/L）可顯著抑制AngⅡ和TNF-α誘導(dǎo)的FLS遷移與侵襲能力。見圖2、3。

圖2 Transwell小室檢測AngⅡ和TNF-α對FLS遷移的影響（，n=3） ×10

2.3 AngⅡ和TNF-α對FLS AngⅡ受體表達(dá)的影響 AT1R主要表達(dá)于FLS的胞膜和胞質(zhì)，部分表達(dá)于胞核；免疫熒光結(jié)果也顯示，AT2R主要表達(dá)于FLS的胞膜、胞質(zhì)，部分表達(dá)在核內(nèi)。見圖4。AngⅡ（10-7mol/L）、TNF-α（20 ng/ml）均可明顯增加FLS上AT1R的蛋白表達(dá)水平，二者聯(lián)合使用可顯著增高AngⅡ誘導(dǎo)的AT1R蛋白水平（F=7.315，P ＜0.05）。單用AngⅡ（10-7mol/L）、TNF-α（20 ng/ ml）對FLS上AT2R的蛋白表達(dá)有上升趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，二者聯(lián)合使用可顯著升高FLS上AT2R的表達(dá)（F=6.036，P＜0.05）。GRK2抑制劑（50 μmol/L）可顯著抑制AngⅡ和 TNF-α刺激的FLS上AT1R和AT2R的表達(dá)（P＜0.05）。見圖5。

圖3 Transwell小室檢測AngⅡ和TNF-α對FLS侵襲的影響（，n=3） ×10

圖4 激光共聚焦（上兩排）和免疫熒光（下兩排）定位FLS上的血管緊張素受體 ×10

2.4 AngⅡ和TNF-α對FLS的GRK2表達(dá)水平的影響 AngⅡ（10-7mol/L）刺激對FLS上GRK2的蛋白表達(dá)水平無明顯影響，TNF-α（20 ng/ml）則可明顯增加FLS上 GRK2的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），AngⅡ與 TNF-α聯(lián)合使用也能顯著升高GRK2的蛋白表達(dá) （P＜0.05），但與TNF-α單一刺激相比差異無顯著性。GRK2抑制劑（50 μmol/L）可顯著抑制AngⅡ和TNF-α誘導(dǎo)的FLS上GRK2蛋白的表達(dá)（F=4.383，P＜0.05）。見圖6。

3 討論

圖5 AngⅡ和TNF-α對FLS上血管緊張素受體表達(dá)的影響（，n=3）

圖6 AngⅡ和TNF-α對FLS上GRK2表達(dá)的影響（，n=3）

RA-FLS是一類有“類腫瘤細(xì)胞樣”侵襲的生物學(xué)特性的細(xì)胞［6］，在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞及其分泌的炎癥因子作用下活化，位于滑膜襯里層的FLS移動到軟骨表面，通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶類和組織蛋白酶的產(chǎn)生，對軟骨造成破壞并遷移到骨，活化破骨細(xì)胞，增強(qiáng)骨質(zhì)侵蝕和破壞［6-8］。FLS侵襲的機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。一般認(rèn)為RA關(guān)節(jié)局部低氧環(huán)境中，F(xiàn)LS與大量浸潤的炎性細(xì)胞及其分泌的炎癥因子相互接觸、相互作用構(gòu)成了一個錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，激活炎癥信號通路并調(diào)控侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，這可能是FLS侵襲的重要機(jī)制之一［9］。

研究［3-5］表明，AngⅡ及TNF-α都參與了RA疾病的病理進(jìn)程。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)AngⅡ（10-7mol/L）和TNF-α（20 ng/ml）處理后的FLS的增殖、遷移與侵襲能力顯著增強(qiáng)，且AngⅡ和TNF-α聯(lián)合作用后FLS的增殖、遷移與侵襲能力比單獨(dú)作用更強(qiáng)。提示AngⅡ、TNF-α均可以促進(jìn)FLS的增殖、遷移與侵襲，且TNF-α可以促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的FLS增殖、遷移與侵襲。

進(jìn)一步研究表明，AngⅡ和TNF-α均可顯著提高FLS的AT1R表達(dá)水平，聯(lián)合使用進(jìn)一步提升了AT1R的表達(dá)，但AngⅡ和TNF-α單一作用對AT2R的表達(dá)無明顯作用，聯(lián)合使用也沒有增高AngⅡ誘導(dǎo)的AT2R蛋白水平；AngⅡ不能促進(jìn)FLS的GRK2表達(dá)，但TNF-α可顯著升高FLS的GRK2表達(dá)水平；抑制GRK2活性可顯著抑制FLS的增殖、遷移與侵襲能力。有研究［10-12］表明，TNF-α可以通過其相應(yīng)受體招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）活化NF-κB從而增強(qiáng)RA-FLS的侵襲性；AngⅡ也可通過AT1R激活NF-κB信號途徑，激活下游絲裂原激活的蛋白激酶家族成員，抑制體外培養(yǎng)的FLS凋亡，促進(jìn)其對關(guān)節(jié)軟骨的破壞［5］以及RA-FLS的遷移與侵襲［13］。GRK是一組與GPCR磷酸化脫敏相關(guān)的激酶，活化后可以磷酸化受體，使受體與 β-arrestins形成復(fù)合體與G蛋白解偶聯(lián)，從而使受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)消失或降低，GRK2也可與TRAF2相互作用調(diào)節(jié)cAMP-PKA通路和ERK信號影響FLS的功能［14-15］。以上結(jié)果提示，TNF-α可以增強(qiáng)AngⅡ誘導(dǎo)的FLS增殖、遷移與侵襲能力，而GRK2可能是其作用的關(guān)鍵分子。

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Tumor necrosis factor α enhances human fibroblast-like synoviocyte proliferation，migration，and invasion induced by angiotensinⅡ and the mechanisms

Luo Xuexia，Yan Shangxue，Wang Ying，et al
（Institute of Clinical Pharmacology of Anhui Medical University，Hefei230032）

Objective To identify the effects and mechanisms of tumor necrosis factor α（TNF-α）enhances human fibroblast-like synoviocyte（FLS）proliferation，migration，and invasion induced by angiotensinⅡ（AngⅡ）. Methods FLS was stimulated by different concentrations of AngⅡ（10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol/L）combined with or without TNF-α（20 ng/ml）for 48 h，and then CCK8 assay and Transwell chamber were used to test FLS proliferation，migration and invasion.The expressions of AngⅡ receptors（AT1R and AT2R）and GRK2 were measured by immunofluorescence，laser confocal or Western blot.Results AngⅡ（10-7，10-6，10-5mol/L）could promote the proliferation of FLS（P＜0.05），10-7mol/L was the optimum concentration.TNF-α（20 ng/ml）significantly enhanced the proliferation of FLS（P＜0.05）.AngⅡ（10-7mol/L）combined with TNF-α（20 ng/ ml）had a further promotion on FLS proliferation（P＜0.05）.The migration and invasion of FLS were significantly increased by AngⅡ，TNF-α or their combination（migration：P＜0.01，and invasion：P＜0.05）.The expression of AT1R was increased（P＜0.05），but the expression of GRK2 only had a rising trend induced by AngⅡ（P＞0.05）.The expressions of AT1R and GRK2 on FLS were increased significantly induced by TNF-α（P＜0.05）and their combination group（P＜0.05）.GRK2 inhibitor could down-regulate the combination group effects on FLS such as migration and invasion（P＜0.01）.Conclusion AngⅡ promotes FLS proliferation，migration and invasion. TNF-α could promote FLS proliferation，migration and invasion induced by AngⅡthrough up-regulating the expressions of AT1R and GRK2 on FLS.

AngiotensinⅡ；TNF-α；synovial fibroblasts；migration；invasion

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.004.html

R 977.6

A

1000-1492（2016）09-1238-06

2016-05-04接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81503084、81330081、81302784）

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，合肥 230032

羅學(xué)霞，女，碩士研究生； 魏 偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei@ ahmu.edu.cn