3 種名優(yōu)綠茶的特征滋味成分研究及種類判別

王淑慧，龍立梅，宋沙沙，曹學(xué)麗

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

3 種名優(yōu)綠茶的特征滋味成分研究及種類判別

王淑慧，龍立梅，宋沙沙，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

采用高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜相結(jié)合的方法對(duì)西湖龍井、黃山毛峰和信陽(yáng)毛尖3 種名優(yōu)綠茶茶湯中的共有特征滋味成分進(jìn)行研究，并據(jù)此進(jìn)行種類判別分析。通過研究，確定了以表沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡因、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素等為主的15 種共有特征滋味成分，并建立了其相應(yīng)的特征指紋圖譜。利用15 種共有特征成分峰的相對(duì)峰面積，建立了多元化典型判別函數(shù)，采用逐步判別分析技術(shù)對(duì)31 個(gè)綠茶樣品進(jìn)行了很好的種類判別，判別正確率為100%。

高效液相色譜；高分辨質(zhì)譜；綠茶；滋味成分；指紋圖譜；種類判別

茶葉為山茶科植物茶（Camellia sinensis Kuntze）的芽葉，經(jīng)加工而成，其飲用歷史悠久，藥用價(jià)值顯著[1]。茶葉中的主要化學(xué)成分有多酚、咖啡堿、茶多糖、茶氨酸、碳水化合物和維生素等[2]。研究[3-4]顯示綠茶中的兒茶素含量相對(duì)較高，對(duì)心血管疾病和幾種類型癌癥的預(yù)防有重要作用，尤其是兒茶素類中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）能降低人類被HIV病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)等。適量攝入咖啡因可刺激中樞神經(jīng)興奮，有提神醒腦之功效[5]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整、對(duì)健康狀況、食品安全的日益重視，其對(duì)茶葉品質(zhì)的要求也越來越高。中國(guó)是茶葉的發(fā)源地，栽培歷史悠久，種植幅員遼闊，種類繁多，制法工藝不斷推陳出新，經(jīng)過上千年的傳承發(fā)展成就了今天中國(guó)茶葉種類的紛繁復(fù)雜、琳瑯滿目[6-7]，因此對(duì)中國(guó)茶葉的分類也出現(xiàn)百家爭(zhēng)鳴的現(xiàn)象，有些分類甚至出現(xiàn)互相矛盾的結(jié)果，目前還沒有較為統(tǒng)一的茶葉分類方法，使茶葉市場(chǎng)出現(xiàn)了魚目混珠、以次充好的現(xiàn)象。

由于受產(chǎn)地、環(huán)境、生長(zhǎng)周期、生產(chǎn)工藝等因素的影響，不同品種的茶葉滋味組成有所差異[8-11]，對(duì)茶葉的品質(zhì)評(píng)定影響也較大，因此能夠快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)不同品種綠茶之間滋味成分的差異對(duì)地理標(biāo)志產(chǎn)品的保護(hù)、名優(yōu)綠茶的真?zhèn)舞b別具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜技術(shù)對(duì)西湖龍井、黃山毛峰和信陽(yáng)毛尖3 種名優(yōu)綠茶31 個(gè)樣品的茶湯特征滋味成分進(jìn)行了分析，并利用逐步判別分析技術(shù)對(duì)不同綠茶種類進(jìn)行了判別分析，為名優(yōu)綠茶的品質(zhì)評(píng)定和種類判別提供依據(jù)[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試茶樣為2013年4—5月的春茶，分別為黃山毛峰2 種工藝3～4 個(gè)等級(jí)7 個(gè)樣品由安徽謝裕大茶葉股份有限公司提供；西湖龍井御牌、貢牌和獅牌3 個(gè)品牌4 個(gè)等級(jí)12 個(gè)樣品由杭州西湖區(qū)茶葉有限公司提供；信陽(yáng)毛尖3 批4 個(gè)等級(jí)12 個(gè)樣品由信陽(yáng)市文新茶葉有限責(zé)任公司提供。樣品用復(fù)合鋁箔袋密封，保存于4 ℃冰箱冷藏，及時(shí)進(jìn)行分析。

乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher科學(xué)公司；磷酸（色譜級(jí)） 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度均大于98%） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品網(wǎng)（表1）。

表1 11種標(biāo)準(zhǔn)樣品Table 1 Eleven tea polyphenol standards

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Chem Station色譜工作站等）、ZORBAX SB-C18色譜柱（50 mm×4.6 mm i.d.，1.8 μm） 美國(guó)Agilent公司；Diamonsil C18（2）（200 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）色譜柱 北京迪馬科技有限公司；UPLCXevo G2 QTOF HPLC聯(lián)用儀、Atlantis T3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm） 美國(guó)Waters公司；150 mL景德鎮(zhèn)陶瓷專業(yè)茶葉評(píng)審杯。

1.3 方法

1.3.1 茶湯制備

茶湯的制備按照GB/T 23776—2009《茶葉感官審評(píng)方法》[14]沖泡綠茶的程序進(jìn)行：稱量3 g綠茶樣品于150 mL評(píng)查杯中，倒入150 mL沸水，蓋上杯蓋沖泡5 min后，將茶湯濾出，待茶湯的溫度降低后，取一定量的茶湯過0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.2 HPLC分析條件

在HPLC分析中，色譜柱的種類、流動(dòng)相的組成、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速等操作條件都會(huì)對(duì)分析產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[15-18]，采用基于C18色譜柱和乙腈溶液為流動(dòng)相，通過對(duì)流動(dòng)相中酸性添加劑的種類和濃度、不同性能的C18色譜柱及檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化，確立了綠茶茶湯滋味成分的HPLC分析方法。色譜柱：Waters-C18（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：0.04%磷酸（A）-乙腈（B）溶液；洗脫時(shí)間60 min；洗脫方式：梯度洗脫（0～60 min，4% B→25% B）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.3 3 種綠茶茶湯成分的定性分析

對(duì)茶湯特征成分的定性分析采用與標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間比對(duì)和HPLC-高分辨質(zhì)譜相結(jié)合的方式進(jìn)行。

分別稱量貢牌西湖龍井、信陽(yáng)毛尖和黃山毛峰樣品，按照1.3.1節(jié)中的方法制備茶湯，將得到的茶湯樣品分別進(jìn)行HPLC分析和HPLC-高分辯質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜條件：離子源電壓3.00 kV；離子源溫度120 ℃；電離溫度280 ℃；電離模式為正負(fù)2 種模式。

液相色譜條件：Waters-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）溶液；洗脫時(shí)間60 min；洗脫方式：梯度洗脫（0～60 min，4% B→25% B）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 指紋圖譜建立的方法學(xué)考察

1.3.4.1 穩(wěn)定性考察

精確稱量3 g龍井茶1 份，150 mL沸水，加蓋浸泡5 min，濾出茶湯，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算綠茶茶湯在24 h內(nèi)共有峰的保留時(shí)間和絕對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.2 精密度考察

取11 種單標(biāo)配制而成的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算混標(biāo)中11 種物質(zhì)連續(xù)進(jìn)樣6 次后，保留時(shí)間和絕對(duì)峰面積的RSD。

精確稱量3 g龍井茶1 份，150 mL沸水，加蓋浸泡5 min，濾出茶湯，待茶湯溫度降低后連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算綠茶茶湯共有峰的保留時(shí)間和絕對(duì)峰面積的RSD。

1.3.4.3 重復(fù)性考察

稱量同一綠茶茶樣3 g黃山毛峰茶5 份，均加入150 mL沸水加蓋浸泡5 min，濾出茶湯后，進(jìn)行HPLC分析，每份連續(xù)進(jìn)樣3 次，計(jì)算5 份綠茶茶湯共有峰的保留時(shí)間和絕對(duì)峰面積的RSD。

1.3.5 3 種綠茶樣品的種類判別分析

將31 個(gè)樣品每個(gè)樣品采用相同的茶湯制備方法和HPLC分析方法平行測(cè)試3 次，生成相應(yīng)等級(jí)茶葉的對(duì)照色譜指紋圖譜，并以對(duì)照色譜指紋圖譜中峰面積最大之主峰作為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積，以此作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件，使用步進(jìn)式方法中的Wilks λ法進(jìn)行逐步判別分析，建立判別方程，并對(duì)所建立的判別方程進(jìn)行交叉驗(yàn)證分析，驗(yàn)證判別方程對(duì)初識(shí)分組的分類結(jié)果[19-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種綠茶茶湯成分的定性分析

將在同一色譜條件下得到的西湖龍井、信陽(yáng)毛尖、黃山毛峰的HPLC圖進(jìn)行比較，如圖1所示，初步確定了3 種綠茶的15 種共有成分。通過與11 種標(biāo)樣的HPLC圖進(jìn)行保留時(shí)間的比對(duì)，初步確定了其中1、3、5、6、7、8、9、11、12、13、15號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的11 種成分，而2、4、10、14號(hào)峰無(wú)法確定。

圖1 11種標(biāo)樣和3種綠茶茶湯樣品HPLC分析譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 11 tea polyphenol standards and three green tea samples

因此，又利用HPLC-高分辨質(zhì)譜對(duì)11 種已初步定性的成分進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，同時(shí)對(duì)其他4 種未知成分進(jìn)行了定性，結(jié)果如表2所示。所確定的15 個(gè)成分為茶湯的主要成分，包括氨基酸類（L-TN）、多糖類（GAQ、TGG）、兒茶素類（GA、EGCG、ECG）、生物堿類（CAF、TB）等，使綠茶滋味呈現(xiàn)出苦澀兼具收斂性、鮮爽、甘甜、苦味、醇厚的口感，綜合形成綠茶鮮醇柔和的滋味品質(zhì)[22-25]，而且具有多重的生理活性。因此，確定這15 種成分綠茶茶湯的特征共有成分。

表2 15種綠茶茶湯成分的特征信息Table 2 HPLC-MS data of 15 compounds in green tea infusion

2.2 指紋圖譜建立的方法學(xué)考察結(jié)果

15 種茶湯滋味成分在浸泡后的0、2、4、6、8、10、12、24 h內(nèi)所得的色譜峰的保留時(shí)間RSD小于0.3%，峰面積RSD小于5%，說明茶樣在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定；11 種單標(biāo)配制成的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣6 次所得色譜峰的保留時(shí)間RSD小于0.3%，峰面積的RSD小于3%，說明儀器的精密度良好；制備的茶湯樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次所得色譜峰保留時(shí)間RSD小于0.3%，峰面積RSD小于3%，符合指紋圖譜建立的要求；同一黃山毛峰茶樣取5 份進(jìn)行HPLC分析，所得15 個(gè)峰的保留時(shí)間RSD小于0.3%，峰面積RSD小于5%，符合指紋圖譜建立的指標(biāo)要求。

2.3 3 種綠茶的判別分析

以15 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積作為原始數(shù)據(jù)，分別設(shè)為變量X1、X2……X15，根據(jù)SPSS 20.0計(jì)算的非標(biāo)準(zhǔn)化判別函數(shù)系數(shù)（F），得到的判別方程組為：

式中：X1、X4、X8、X10、X13分別代表不同保留時(shí)間色譜峰的相對(duì)峰面積。

判別函數(shù)F1、F2的特征值分別為81.717和23.222，第1個(gè)函數(shù)解釋了所有變異的77.9%，第2個(gè)函數(shù)解釋了余下的22.1%，典型相關(guān)系數(shù)分別為0.994和0.979，Wilks’Lambda數(shù)據(jù)對(duì)判別函數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2 個(gè)判別函數(shù)（P＜0.05）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從分類結(jié)果表可知，在31 個(gè)茶樣中，該方法對(duì)初始分組樣品進(jìn)行了100%正確分類，對(duì)交叉驗(yàn)證分組樣品進(jìn)行了100%正確分類。各樣品判別函數(shù)得分值如圖2所示，判別分類效果較好。同一品種不同等級(jí)的茶葉能實(shí)現(xiàn)很好的歸類，表明采用綠茶滋味特征成分可以對(duì)綠茶的種類進(jìn)行很好地分類判別。

圖2 3種綠茶滋味特征成分的判別分析Fig.2 Discrimination and classification of characteristic flavor components of three kinds of green tea

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC及HPLC-高分辨質(zhì)譜相結(jié)合的方法對(duì)西湖龍井、黃山毛峰和信陽(yáng)毛尖3 種綠茶的滋味成分進(jìn)行了分析研究，確定了L-TN、GAQ、GA、GAQA、TB、GC、EGC、CAF、C、ST、EC、EGCG、GCG、TGG和ECG 15 種共有特征滋味成分。但是由于其品種、產(chǎn)地、加工工藝的不同，各滋味成分的相對(duì)含量有所差異，表現(xiàn)出不同的滋味特征指紋圖譜。根據(jù)3 種綠茶15 種共有特征滋味成分的含量差異，通過多元統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算很好地實(shí)現(xiàn)了不同茶葉種類的判別，其準(zhǔn)確率達(dá)到100%。這對(duì)于地理標(biāo)志產(chǎn)品的保護(hù)、名優(yōu)綠茶的真?zhèn)舞b別等具有重要意義和參考價(jià)值。

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Analysis of Characteristic Flavor Components and Cultivar Discrimination of Three Varieties of Famous Green Tea

WANG Shuhui, LONG Limei, SONG Shasha, CAO Xueli*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

High performance liquid chromatography (HPLC) in combination with high-resolution mass spectrometry (HRMS) was employed to analyze the characteristic flavor components of three kinds of famous Chinese green tea, including Xihu Longjing, Huangshan Maofeng and Xinyang Maojian, and their fingerprints were established for variety discrimination. As the results, 15 common characteristic flavor components were identified in the three kinds of green tea, which included epigallocatechin gallate (EGCG), caffine (CAF), epicatechin gallate (ECG), and epigallocatechin (EGC) etc. Based on the diversified typical discriminant functions established using the relative peak areas of 15 common characteristic flavor compounds, 31 green tea samples were discriminated into three categories with an accuracy of 100% through stepwise discriminant analysis.

high performance liquid chromatography (HPLC); high-resolution mass spectrometry (HRMS); green tea; flavor components; fingerprint; variety discrimination

10.7506/spkx1002-6630-201602022

TS272.5

A

1002-6630（2016）02-0128-04

王淑慧, 龍立梅, 宋沙沙, 等. 3 種名優(yōu)綠茶的特征滋味成分研究及種類判別[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 128-131. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602022. http://www.spkx.net.cn

WANG Shuhui, LONG Limei, SONG Shasha, et al. Analysis of characteristic flavor components and cultivar discrimination of three varieties of famous green tea[J]. Food Science, 2016, 37(2): 128-131. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602022. http://www.spkx.net.cn

2015-04-16

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310230）；北京工商大學(xué)研究生科研學(xué)術(shù)創(chuàng)新基金重點(diǎn)項(xiàng)目

王淑慧（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：journeyshu@163.com

*通信作者：曹學(xué)麗（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x和分析。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn