酵母細(xì)胞壁β-D-葡聚糖定量測定方法的比較分析

田曉麗，楊 萍，姜文俠

（1.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

酵母細(xì)胞壁β-D-葡聚糖定量測定方法的比較分析

田曉麗1,2，楊 萍1,*，姜文俠1,*

（1.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

通過對酵母胞壁不溶性β-D-葡聚糖的幾種定量測定方法的比較分析，表明經(jīng)酸水解法處理后得到的測定結(jié)果偏高，經(jīng)酸-酶水解法處理后的測定結(jié)果更準(zhǔn)確；對水解后產(chǎn)生的葡萄糖采用生物傳感儀法定量，結(jié)果穩(wěn)定，操作時間短，更適合在生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制中使用；待測樣品中的α-葡聚糖對測定結(jié)果有明顯的干擾，β-D-葡聚糖含量應(yīng)為總葡聚糖含量與α-葡聚糖含量之差。

β-D-葡聚糖；酵母細(xì)胞壁；水解方法；定量測定；生物傳感儀法

不溶性β-D-葡聚糖是構(gòu)成酵母細(xì)胞壁的主要成分之一，作為難以被消化的膳食纖維，它在機(jī)體內(nèi)具有抗癌、抗菌、抗病毒、降血脂及增強(qiáng)動物免疫活性等重要的生理活性功能[1-6]。這種葡聚糖不溶于水、酸、堿及醇和醚等有機(jī)溶劑，而且沒有標(biāo)準(zhǔn)品，因而難以準(zhǔn)確地定量檢測，這個問題已經(jīng)影響到β-D-葡聚糖的研究、生產(chǎn)及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

目前的β-D-葡聚糖定量測定方法，一般采用酸水解法直接將其水解為葡萄糖[7-9]，再用苯酚硫酸法[10]、二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid method，DNS）法[11]、葡萄糖氧化酶-過氧化物酶雙酶（glucose oxidaseperoxidase method，GOPOD）法[12]或高效液相色譜（high performance liquid chromatography method，HPLC）法[13-15]等定量方法測定葡萄糖含量，再計(jì)算得到葡聚糖含量。但苯酚-硫酸法測定的是總糖含量[16]，DNS法測定的是還原糖含量[17]，GOPOD法和HPLC法對葡萄糖專一性較強(qiáng)。很多學(xué)者[18-19]對上述檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，以便更準(zhǔn)確地反映β-D-葡聚糖含量。本研究對常用的幾種水解方法及專一性較強(qiáng)的葡萄糖定量檢測方法進(jìn)行對比分析，以求優(yōu)選出一種測定準(zhǔn)確、操作簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1# β-D-葡聚糖樣品（標(biāo)注含量為70%）、2# β-D-葡聚糖樣品（標(biāo)注含量為90%）、3# β-D-葡聚糖樣品（標(biāo)注含量為58.5%） 市購；4# β-D-葡聚糖樣品（含量為80%） 本實(shí)驗(yàn)室制備；凝膠多糖（純度≥99%）、K-YBGL β-葡聚糖（酵母和蘑菇）檢測試劑盒（外切-1,3-β-葡聚糖酶（20 U/mL）與葡糖苷酶（4 U/mL）的混合酶液、淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶（1 630 U/mL）均為檢測試劑盒中的酶制劑） 愛爾蘭Megazyme公司；硫酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204- S分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；1260型HPLC儀 美國安捷倫公司；JN-10C高壓細(xì)胞破碎儀 廣州聚能生物科技有限公司；Sorvall Evolution RC冷凍大容量離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的水解

1.3.1.1 酸水解法[20]

稱取約0.5 g待測樣品（或凝膠多糖），精確到0.001 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)72%的H2SO4溶液5 mL，混勻，室溫水解3 h；加25 mL蒸餾水使H2SO4稀釋至2 mol/L，封管，沸水水浴2 h；冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)pH值至6.5～7.0，用蒸餾水定容至100 mL，3 570×g離心10 min，上清液為樣品的酸水解液。

以凝膠多糖作為對照品，按照上述水解條件對酸水解進(jìn)行校正。校正系數(shù)F通過式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：C’為凝膠多糖的純度/%；A為凝膠多糖的含水量/%；m為凝膠多糖的質(zhì)量/g；C為凝膠多糖水解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/（g/mL）；V為凝膠多糖水解液的定容體積，100 mL；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的系數(shù)。

經(jīng)酸水解后，待測樣品中β-D-葡聚糖含量通過式（2）進(jìn)行計(jì)算：

式中：X為β-D-葡聚糖含量/%；C為樣品水解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/（g/mL）；V為樣品水解液的定容體積，100 mL；m為待測樣品的質(zhì)量/g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的系數(shù)。

1.3.1.2 酸-酶水解法

稱取約0.1 g待測樣品至比色管中，精確到0.001 g，加入1.5 mL濃鹽酸，30 ℃水解45 min，然后加入10 mL蒸餾水，封管，沸水浴2 h，冷卻至室溫，用KOH溶液調(diào)pH 6.5～7.0，以0.2 mol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖溶液定容至200 mL，1 500×g離心10 min。取0.1 mL上清液，加入0.1 mL外切-1,3-β-葡聚糖酶和葡糖苷酶的混合酶液，40 ℃水浴1 h使之充分酶解為葡萄糖，即得到樣品的酸-酶水解液。

經(jīng)酸-酶水解后，待測樣品中β-D-葡聚糖含量通過式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：X為β-D-葡聚糖含量/%；C為樣品水解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/（g/mL）；V為樣品水解液的定容體積，200 mL；m為待測樣品的質(zhì)量/g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的系數(shù)。

1.3.2 葡萄糖的定量檢測

1.3.2.1 GOPOD法

采用張惟杰[21]所述的方法測定。

1.3.2.2 生物傳感儀法

將適當(dāng)稀釋后的水解液，取25 μL用SBA-40D生物傳感分析儀測定葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.3.2.3 HPLC法[22]

色譜柱：美國Bio-Rad公司Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱，300 mm×7.8 mm；柱溫65 ℃；示差檢測器溫度40 ℃；流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 α-葡聚糖含量的檢測

稱取約0.1 g待測樣品，精確到0.001 g，加入2 mL的2 mol/L KOH溶液，冰水浴20 min，然后加入8 mL的1.2 mol/L pH 3.8醋酸鈉緩沖液和0.2 mL淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶，40 ℃水浴30 min，1 500×g離心10 min。上清液中的葡萄糖含量用GOPOD法進(jìn)行測定。α-葡聚糖含量按式（4）計(jì)算：

式中：Xα為α-葡聚糖含量/%；C為上清液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/（g/mL）；V為最終總體積，10.3 mL；m為待測樣品的質(zhì)量/g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19軟件（2010，美國IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)法和方差分析法。3 次實(shí)驗(yàn)取平均值得到測定結(jié)果，當(dāng)P＜0.05時，結(jié)果差異顯著。結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品水解方法的比較分析

定量測定β-D-葡聚糖，必須先將葡聚糖水解為葡萄糖，再通過檢測葡萄糖對β-D-葡聚糖進(jìn)行定量。為考察水解方法對結(jié)果的影響，本研究對比了酸水解法和酸-酶水解法。

酸水解法通常先使用高濃度的酸，短時間低溫水解，然后再用低濃度酸進(jìn)行沸水浴水解。劉曉永[23]比較了高濃度酸預(yù)處理和沒有預(yù)處理的水解效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高濃度酸預(yù)處理后的回收率顯著提高。因此，本實(shí)驗(yàn)先用高濃度酸處理后再用低濃度酸對各β-D-葡聚糖樣品進(jìn)行水解。而酸-酶水解法先采用酸將不溶性β-D-葡聚糖初步降解成可溶性的物質(zhì)，再通過外切-1,3-β-葡聚糖酶和葡糖苷酶進(jìn)行專一性酶切。通過對酶解產(chǎn)物的測定來定量β-D-葡聚糖。

2.1.1 水解方法對葡萄糖穩(wěn)定性的影響

由于β-D-葡聚糖的測定是依據(jù)水解后得到的葡萄糖含量來進(jìn)行定量的，如果在水解過程中破壞了葡萄糖，則會影響β-D-葡聚糖的定量結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)將葡萄糖分別用不同的水解方法處理，考察水解方法對葡萄糖的影響。

葡萄糖經(jīng)酸水解法處理后的回收率僅為（90.03±0.51）%，表明酸水解對葡萄糖的破壞顯著。因此，采用酸水解法測定不溶性β-D-葡聚糖應(yīng)該引入不溶性β-D-葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穼λ鈼l件進(jìn)行校正。但由于目前沒有該標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌罚恍┦褂盟崴夥ǖ难芯空遊24-25]采用水溶性的凝膠多糖作為對照品進(jìn)行校正，本研究的酸水解法也采用凝膠多糖為對照品，得到校正系數(shù)。

葡萄糖經(jīng)酸-酶水解法處理后的回收率為（99.37±0.60）%，該水解方法沒有破壞葡萄糖，因而不必進(jìn)行校正。

2.1.2 水解方法對樣品測定結(jié)果的影響

為比較不同水解方法對樣品測定結(jié)果的影響，本研究分別采用酸水解法和酸-酶水解法分別對1#、2#、3#和4#樣品進(jìn)行水解處理，通過HPLC法對葡聚糖樣品水解程度進(jìn)行判定并對水解液中葡萄糖含量進(jìn)行測定。

圖1 不同水解法對β-D-葡聚糖含量測定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of different hydrolysis methods on the results of determination of β-D-glucan content

上述樣品經(jīng)不同方法水解后，用HPLC測定，均未發(fā)現(xiàn)二糖和低聚糖的峰，證明兩種水解方法都已將葡聚糖樣品水解完全，不會因水解不徹底而對測定結(jié)果造成影響。通過葡萄糖含量計(jì)算得到的β-D-葡聚糖含量，如圖1所示。每種樣品經(jīng)兩種水解方法處理后得到的測定結(jié)果之間均存在顯著差異（P＜0.05），而且同一樣品，經(jīng)酸水解法處理后測定的結(jié)果均比酸-酶水解法處理后的結(jié)果高，這可能是由于酸水解破壞了部分水解得到的葡萄糖，使計(jì)算得到的校正系數(shù)F偏高，導(dǎo)致計(jì)算得到的β-D-葡聚糖含量偏高。因此，選用酸-酶水解法測定β-D-葡聚糖的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

2.2 葡萄糖定量檢測方法的比較分析

對4 種樣品進(jìn)行酸-酶水解后，分別用生物傳感儀法、GOPOD法和HPLC法測定水解液中的葡萄糖含量，得到的樣品中β-D-葡聚糖含量見表1。

表 1 葡萄糖的檢測方法對β-D-葡聚糖含量測定結(jié)果的影響Table 1 Effect of different glucose test methods on the results ofdetermination of β-D-glucan content

從表1可見，不同的葡萄糖檢測方法對β-D-葡聚糖含量測定值的影響無顯著差異，生物傳感儀法、GOPOD法和HPLC法對葡萄糖 的專一性強(qiáng)，精密度均較高（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值均小于1%），均適用于葡萄糖含量的測定。但在生產(chǎn)過程中需快速測定大量樣品時，選擇生物傳感儀法更加適宜。因?yàn)镚OPOD法的試劑價格較高，測定成本較高。HPLC法對實(shí)驗(yàn)的儀器要求較高，樣品的前處理復(fù)雜，檢測時間較長。而生物傳感儀法操作更簡便、快捷，結(jié)果重復(fù)性好（RSD=0.00）。

2.3 α-葡聚糖含量對測定結(jié)果的影響

由于樣品的制備方法和原料的差異，β-D-葡聚糖產(chǎn)品中可能不同程度地含有α-葡聚糖。為了探究α-葡聚糖含量對測定結(jié)果的影響，用β-葡聚糖（酵母和蘑菇）檢測試劑盒分別測定3#樣品、主要成分為α-葡聚糖的可溶性淀粉和添加了可溶性淀粉的3#樣品，得到其中的總葡聚糖、α-葡聚糖及β-D-葡聚糖含量見表2。添加可溶性淀粉的3#樣品，其總葡聚糖含量為3#樣品和可溶性淀粉的葡聚糖含量之和，其中的β-D-葡聚糖含量與未添加可溶性淀粉的3# 樣品相當(dāng)。該結(jié)果表明，通過對酸-酶水解后的葡萄糖定量只能得到總葡聚糖含量，不能排除樣品中α-葡聚糖的干擾，因?yàn)闃悠分笑?葡聚糖的酸水解后產(chǎn)物也是葡萄糖，對測定結(jié)果有顯著影響。因此，β-D-葡聚糖含量應(yīng)為總葡聚糖含量減去α-葡聚糖含量。

表2 可溶性淀粉的添加對3#樣品中葡聚糖含量的影響Table 2 Effect of addition of soluble starch on the determination ofglucan contents of 3# sample

2.4 市購樣品的測定

表3 樣品中不同葡聚糖含量Table 3 Contents of different glucans in various samples

用β-葡聚糖（酵母和蘑菇）檢測試 劑盒測定標(biāo)注含量不同的市購樣品中不溶性β-D-葡聚糖含量，結(jié)果見表3。1#樣品和2#樣品中的β-D-葡聚糖含量僅是標(biāo)注值的2/3上下，且在這兩個樣品中均含有較多的α-葡聚糖。1#樣品的標(biāo)注含量是以總葡聚糖的測定為依據(jù)，未考慮α-葡聚糖的干擾；2#樣品的標(biāo)注含量顯著高于總葡聚糖的測定結(jié)果；3#樣品中雖然含有α-葡聚糖，但標(biāo)注的β-D-葡聚糖含量與實(shí)際含量一致，表明標(biāo)注含量已排除了α-葡聚糖的影響；由于在4#樣品的制備過程中去除了其中的α-葡聚糖，因此未檢測到α-葡聚糖，總 葡聚糖與β-D-葡聚糖的測定結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究通過實(shí)驗(yàn)比較認(rèn)為，對于不溶性β-D-葡聚糖的水解，應(yīng)選用酸-酶水解法，該水解法先用酸處理，然后采用外切-1,3-β-葡聚糖酶和葡糖苷酶的定向催化水解，專一性強(qiáng)，水解徹底，條件溫和，不需要校正，測定的結(jié)果更加可信、準(zhǔn)確。在葡萄糖的幾種定量測定方法的比較中，生物傳感儀法、GOPOD法和HPLC法在測定結(jié)果上沒有顯著性差異，而生物傳感儀法操作簡便、測定時間短、成本低，更適合在生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制檢測中使用。待測樣品中α-葡聚糖含量對測定結(jié)果有顯著影響，因此，β-D-葡聚糖含量應(yīng)為總葡聚糖含量減去α-葡聚糖含量。

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Comparative Analysis of Quantitative Assay Methods for β-D-Glucan from Yeast Cell Walls

TIAN Xiaoli1,2, YANG Ping1,*, JIANG Wenxia1,*
(1. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering, Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China; 2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)

This study was conducted to compare and analyze several quantitative assay methods for insoluble β-D-glucan from yeast cell walls. It was indicated that the sample pretreatment by acid hydrolysis provided higher results for the determination of β-D-glucan, while the results obtained by acid-enzymatic hydrolysis were more precise. Among different test methods for glucose obtained after hydrolysis, the biosensor method was found to be faster, more stable and suitable for quality control in the production process. Besides, α-glucan in the samples had a significant interference effect on the results of determination. Thus β-D-glucan should be calculated by subtraction from total glucose of the glucose obtained fr om α-glucan.

β-D-glucan; yeast cell walls; hydrolysis method; quantitative determination; biosensor method

10.7506/spkx1002-6630-201602017

Q539

A

1002-6630（2016）02-0099-05

田曉麗, 楊萍, 姜文俠. 酵母細(xì)胞壁β-D-葡聚糖定量測定方法的比較分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 99-103. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602017. http://www.spkx.net.cn

TIAN Xiaoli, YANG Ping, JIANG Wenxia. Comparative analysis of quantitative assay methods for β-D-glucan from yeast cell walls[J]. Food Science, 2016, 37(2): 99-103. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602017. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA021403）

田曉麗（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：tianxiaoli83080103@126.com

*通信作者：楊萍（1978—），女，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：yang_p@tib.cas.cn

姜文俠（1964—），男，研究員，本科，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：jiang_wx@tib.cas.cn