TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖微球的制備及其在運(yùn)載食品活性因子中的應(yīng)用

陳鈺瑩，陳小冬，史夢(mèng)璇，路美玲，趙陸海，李 媛

（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029）

TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖微球的制備及其在運(yùn)載食品活性因子中的應(yīng)用

陳鈺瑩，陳小冬，史夢(mèng)璇，路美玲，趙陸海，李 媛*

（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029）

以2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl，TEMPO）為催化劑，次氯酸鈉為氧化劑，對(duì)魔芋甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）進(jìn)行氧化，制備出氧化度為80%的TEMPO氧化魔芋多糖（ TEMPO-oxidized konjac glucomannan，OKGM）。用OKGM為原料、Fe3+為交聯(lián)劑借助雙重乳液法制備微球。內(nèi)油相中包覆β-胡蘿卜素，多糖水相吸附花色苷，實(shí)現(xiàn)親疏水活性因子的共裝載。紅外光譜顯示出KGM上羥基成功氧化為羧基；MTT法驗(yàn)證了OKGM沒(méi)有細(xì)胞毒性；采用單因素試驗(yàn)，確定制備微球的最佳工藝條件是OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、FeSO4·7H2O與OKGM質(zhì)量比1∶5、交聯(lián)時(shí)間30 min、交聯(lián)溫度35 ℃；通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法發(fā)現(xiàn)微球粒徑分布在20～40 μm之間，平均粒徑為26.8 μm；通過(guò)掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡觀察了微球的表面形貌；熒光共聚焦顯微鏡顯示微球中能夠同時(shí)分布著花色苷和β-胡蘿卜素。結(jié)果表明OKGM微球在多種活性因子的共裝載方面有良好的應(yīng)用前景。

魔芋葡甘露聚糖；微球；活性因子；分散性；穩(wěn)定性；腸靶向；緩釋；微膠囊化

食品天然產(chǎn)物活性因子往往具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化和防止多種癌癥等重要生理功能，但因食品活性因子存在穩(wěn)定性差的問(wèn)題[1]，限制了其應(yīng)用和人體營(yíng)養(yǎng)吸收。而載體可以用來(lái)保護(hù)食品活性因子，維持其穩(wěn)定性，并能提高其分散性，進(jìn)而提高生物利用度[2]。天然高分子具有可再生、生物兼容性和降解性等優(yōu)點(diǎn)，成為制備活性因子載體的最佳材料。目前運(yùn)用于裝載活性因子的天然高分子有淀粉[3]、糊精類[4]、蛋白[5]、海藻酸鈉[6]等。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）主要成分為葡萄糖和甘露糖，二者通過(guò)β-1,4-或者β-1,3-糖苷鍵連接（圖1）[7]。KGM分子質(zhì)量在500～2 000 kD之間，在水中的溶解度為1%左右，吸水膨脹后體積約為干狀態(tài)的80 倍。它具有良好的增稠性[8]、凝膠性、成膜性[9]和一些特殊的生理功能[10]，目前已被用于減肥、降脂[11]以及食品添加劑領(lǐng)域[12]。但由于KGM分子質(zhì)量高，溶解度低，溶膠黏度大以及穩(wěn)定性差，限制了KGM進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。KGM目前主要通過(guò)與其他生物大分子例如黃原膠復(fù)配的方式[13]或共價(jià)交聯(lián)的方法[14]作用于藥物緩釋領(lǐng)域。Suphat等[15]將經(jīng)過(guò)高碘酸鈉氧化的魔芋多糖與殼聚糖通過(guò)靜電作用復(fù)配制膜，用來(lái)緩釋雙氯芬酸鈉；Huang Renliang等[16]通過(guò)自組裝將魔芋多糖與Fmoc-苯丙氨酸二肽形成水凝膠，并選用紫杉醇作為模型藥，通過(guò)控制魔芋多糖的添加量、分子質(zhì)量、老化時(shí)間以及β-甘露聚糖酶用量來(lái)控制藥物釋放時(shí)間。但基于靜電復(fù)配作用形成的載體機(jī)械強(qiáng)度低，穩(wěn)定性差；共價(jià)交聯(lián)所使用的交聯(lián)劑（主要是二異氰酸鹽、環(huán)氧化合物及醛類）存在細(xì)胞毒性，降低了載體的生物相容性和安全性[17]。因此需要開(kāi)發(fā)一種穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性高的魔芋載體應(yīng)用于裝載食品活性因子。

圖1 氧化魔芋的結(jié)構(gòu)式Fig.1 TEMPO oxidation of konjac glucomannan

2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl，TEMPO）氧化法是近年來(lái)新起的一種具有高活性和高選擇性綠色環(huán)保氧化方法[18]。TEMPO是一種有機(jī)小分子催化劑。TEMPO氧化法反應(yīng)條件溫和，催化劑用量少（0.1%），可通過(guò)固載化的方法避免殘留于原料中，并可循環(huán)使用。TEMPO氧化的優(yōu)點(diǎn)是高選擇性和氧化度可控?？梢赃x擇性地氧化多糖的單糖單元（葡萄糖、甘露糖）上C-6位上的伯醇基團(tuán)為羧基，且氧化度精確可控，最高可達(dá)90%。通過(guò)TEMPO氧化處理后的魔芋葡甘聚糖（oxidized konjac glucomannan，OKGM）溶解度提高、水溶膠黏度降低、穩(wěn)定性增強(qiáng)，引入大量羧基作為功能基團(tuán)能夠與Fe3+通過(guò)配位作用交聯(lián)[7]。利用乳液聚合法，通過(guò)Fe3+交聯(lián)OKGM可制成帶有可控負(fù)電荷的微球，該微球能夠吸附正電荷活性因子。進(jìn)一步采用雙重乳液法可包埋脂溶性活性因子。

研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度條件下多因子協(xié)同作用可產(chǎn)生遠(yuǎn)大于單因子作用的抗氧化性[19]?；ㄉ兆鳛橐环N抗氧化劑，在水溶液中的穩(wěn)定性極差，易受溶液pH值和溫度影響[20-21]。β-胡蘿卜素是VA前體，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病的功效，但其難溶性和對(duì)光熱氧敏感的缺點(diǎn)也限制了其應(yīng)用[22]。因此，若能有效提高花色苷和β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性并能使兩者協(xié)同作用，將為預(yù)防心血管、癌癥起到積極作用。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)嘗試用OKGM微球提高活性因子的穩(wěn)定性和分散性，同時(shí)裝載多種活性因子，實(shí)現(xiàn)多種抗氧化劑協(xié)同作用，有效提高活性因子的生物利用率。

本研究首先對(duì)采用TEMPO氧化法制得OKGM上的羧基進(jìn)行表征，然后摸索了利用通氧乳液聚合法制備的OKGM微球的最佳條件，包括油水比、鐵與羧基的質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度。接著對(duì)所得到的OKGM微球的粒徑和表面形貌進(jìn)行表征。最后對(duì)微球包埋活性因子的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討，主要用該微球來(lái)吸附正電荷花色苷以及包埋β-胡蘿卜素，證實(shí)了氧化魔芋微球在共裝載多種活性因子方面具有廣闊的應(yīng)用前景。并且，OKGM將成為一種新型活性因子微膠囊壁材，其pH值響應(yīng)性使其具有腸靶向釋放的潛力。該研究對(duì)充分利用我國(guó)魔芋資源，提高敏感活性因子的分散性和穩(wěn)定性，使其更有效地發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)健康功效具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KGM（純度98%） 湖北一致魔芋有限公司；β-甘露聚糖酶（比活力20 IU/mg） 諾維信公司； TEMPO、SUPE R-green Ⅰ、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-2,5-diphenytetrazoliumromide，MTT） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；紫薯花色苷 湖北紫鑫生物科技有限公司；β-胡蘿卜素（純度97%） 日本TCI公司；尼羅紅等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RCT磁力攪拌器 德國(guó)艾卡公司；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；SP2共聚焦激光掃描電鏡 德國(guó)萊卡公司；Nano-ZS激光粒度儀 英國(guó)馬爾文有限公司；UB100i光學(xué)顯微鏡 重慶澳浦光技術(shù)有限公司；Dimension FastScan原子力顯微鏡 美國(guó)維易科儀器公司；S-4700掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 OKGM的制備

稱取20 g KGM溶解到2 L沸水中。待KGM全部溶解后，向溶液中加入1 mg β-甘露聚糖酶，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為10 min。將酶解后的KGM溶液移入水浴鍋，沸水浴10 min滅酶。用乙醇析出固體后進(jìn)行真空冷凍干燥。

稱取8.2 g酶解后的KGM分散在200 mL水中，用磁力攪拌器攪拌并加入0.064 8 g TEMPO，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 10。向溶液中加入pH 10的次氯酸鈉溶液，氧化反應(yīng)開(kāi)始發(fā)生，當(dāng)溶液pH值降低時(shí)，向溶液中逐滴加入 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，使溶液pH值恒定為10。當(dāng)氫氧化鈉溶液加入量為80 mL時(shí)，加入10 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)。1 h后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 3，再調(diào)節(jié)pH值為7并保持該pH值1 h后停止攪拌。緩慢加入300 mL無(wú)水乙醇，過(guò)濾析出白色沉淀，用乙醇洗滌3 次，丙酮洗滌3 次。將沉淀出來(lái)的固體溶于50 mL水中，真空冷凍干燥后得到OKGM。

1.3.2 OKGM結(jié)構(gòu)紅外光譜表征

稱取2 mg KGM和OKGM制成KBr壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行紅外吸收掃描。

1.3.3 OKGM細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取人體肝癌細(xì)胞株HepG2和人體子宮頸癌細(xì)胞株Hela分別接種于96 孔板，每孔接種5 000 個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入OKGM，OKGM質(zhì)量濃度在0.01～1 mg/mL之間。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在490 nm波長(zhǎng)的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 OKGM微球的制備

單乳液法：稱取一定量的OKGM溶解于水中，用0.1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 3。稱取一定質(zhì)量的FeSO4·7H2O溶解于500 μL pH 3的OKGM溶液中制成水相，另稱取0.75 g司盤(pán)80溶解在20 g的液體石蠟中制成油相。將水相加入油相中，用磁力攪拌器攪拌形成W/O乳液。雙重乳液法：在上述水相中加入溶有脂溶性活性因子（例如β-胡蘿卜素）的玉米油（內(nèi)油相），形成O/W乳液，再以此為水相加入到液體石蠟中，最終形成O/W/O的復(fù)乳。向上述兩種乳液中通入空氣，可以分別制得不含內(nèi)油相和含有內(nèi)油相的氧化魔芋微球。

微球用正己烷和甲醇分別洗滌3 次，離心分離，真空干燥。采用單因素試驗(yàn)的方法，依次考察OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4 %、6.7 %、10 %）、FeSO4·7H2O與OKGM質(zhì)量比（0.45∶5、1∶5、1.95∶5）、交聯(lián)溫度（15、35、55 ℃）和交聯(lián)時(shí)間（30、40、60 min）對(duì)微球制備的影響，以選取最佳的條件，優(yōu)化制備微球的工藝。

1.3.5 微球尺寸測(cè)量及形貌觀察

在最佳的制備條件下制備微球，并對(duì)微球的尺寸和形貌進(jìn)行測(cè)量和觀察。

用馬爾文激光粒度儀測(cè)定微球的粒度分布情況。對(duì)微球表面進(jìn)行噴金處理后，用掃描電子顯微鏡掃描（測(cè)試的加速電壓為15 kV），觀察微球大小和形貌。取微球溶解于pH 3鹽酸溶液中，用滴管吸取少量含有微球的溶液滴于云母片上，在空氣中自然風(fēng)干后放于載物臺(tái)上，采用原子力顯微鏡輕敲模式觀察微球形貌。

1.3.6 單乳液法制備的微球吸附花青素

稱取一定量的微球溶解在pH 3的鹽酸溶液中，加入花色苷，用磁力攪拌器攪拌1.5 h，用pH 3的鹽酸溶液洗滌，離心，移去未被吸附的花色苷。利用花色苷自發(fā)熒光的特性，在共聚焦激光掃描電鏡下（激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm），觀測(cè)花色苷的吸附情況。

1.3.7 雙重乳液法制備的微球吸附β-胡蘿卜素和花色苷

稱取一定量的OKGM溶于500 μL pH 3的鹽酸溶液中，用磁力攪拌器攪拌溶解后，加入15 mg吐溫20制成水相。另稱取β-胡蘿卜素溶解在玉米油中制成油相，將水相加入油相中，制成初乳。向初乳中加入FeSO4·7H2O，用磁力攪拌器攪拌均勻。稱取0.5 g司盤(pán)80加入到50 mL液體石蠟中，制成外油相。將初乳緩慢滴加到外油相中，連續(xù)攪拌，制成雙重乳液。向乳液中通入空氣，并不斷攪拌。含有β-胡蘿卜素的微球用正己烷和甲醇分別洗滌3 次，離心分離，真空干燥。稱取一定量的微球溶解在pH 3的鹽酸溶液中，加入花色苷，用磁力攪拌器攪拌一段時(shí)間后，用pH 3的鹽酸溶液洗滌，離心，移去未被吸附的花色苷。

為了觀測(cè)利用雙重乳液法制備的微球共裝載親疏水物質(zhì)的可行性，本實(shí)驗(yàn)用尼羅紅代表疏水性活性分子，SUPER-greenⅠ代表親水性活性因子。將尼羅紅溶到內(nèi)油相中，之后加入正電荷染料SUPER-greenⅠ通過(guò)靜電作用結(jié)合到含有多糖的水相中。洗去未被吸附的染料之后，用共聚焦激光掃描電鏡觀察雙染色的微球。尼羅紅激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為561 nm和636 nm。SUPER-greenⅠ的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是488 nm和520 nm。利用兩種染料在不同波段發(fā)射而顯示出不同顏色，可以同時(shí)觀察到水溶性和油溶性分子在微球中的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 OKGM的制備及體外毒性分析

圖2 氧化魔芋的紅外表征Fig.2 FT-IR spectra of TEMPO-oxidized konjac glucomannan

如圖2所示，1 600～1 650 cm-1是多糖羧基的特征峰位置，KGM經(jīng)過(guò)氧化后，1 620 cm-1附近的羧基吸收峰顯著增強(qiáng)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)TEMPO氧化后，KGM上羥基成功氧化為羧基。且由之前的研究可知，羧基量和氧化度呈正比，氧化度精確可控[23]。

圖3 OKGM體外毒性實(shí)驗(yàn)Fig.3 In vitro cytotoxicity of DO80% OKGM polymers

由于細(xì)胞吞噬微米級(jí)魔芋微球的能力有限，因此本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證了TEMPO氧化KGM的細(xì)胞毒性。通過(guò)利用MTT法，將OKGM和細(xì)胞共孵育24 h，細(xì)胞毒性結(jié)果如圖3所示，當(dāng)OKGM質(zhì)量濃度從0.01 mg/mL增加到1 mg/mL時(shí)，發(fā)現(xiàn)人體肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞存活率在90%以上，人體子宮頸癌細(xì)胞Hela的細(xì)胞存活率在80%以上，由此可見(jiàn)OKGM的細(xì)胞毒性可以忽略。若需要驗(yàn)證鐵交聯(lián)后的OKGM微球毒性，可通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證明。

2.2 微球制備工藝的優(yōu)化

OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)、交聯(lián)度、交聯(lián)溫度和時(shí)間都是影響微球制備的關(guān)鍵因素。將不同條件下制得的微球在顯微鏡下觀察，探討通過(guò)O/W/O復(fù)乳法制備含有內(nèi)油相的氧化魔芋微球的最優(yōu)條件。由圖4A可以看出，當(dāng)OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，顯然OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低造成微球結(jié)構(gòu)脆弱，發(fā)生破裂。而6.7%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然無(wú)法制備出結(jié)構(gòu)堅(jiān)固的微球。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，微球穩(wěn)固存在，且內(nèi)油相均勻分布于微球中，形成的微球形狀規(guī)則。因此初步確定10%為制備微球的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。氧化魔芋微球的交聯(lián)原理是OKGM上的羧基和三價(jià)鐵離子發(fā)生了配位反應(yīng)。利用空氣中的氧氣能使預(yù)交聯(lián)劑Fe2+氧化為交聯(lián)劑Fe3+，F(xiàn)e3+將OKGM交聯(lián)使其在水相中固化，最終制得氧化魔芋微球。因此鐵離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接決定了微球的交聯(lián)度。由圖4B可以看出，當(dāng)FeSO4·7H2O與OKGM質(zhì)量比為0.45∶5時(shí)，交聯(lián)度過(guò)低，不能很好地形成微球。當(dāng)質(zhì)量比為1.95∶5時(shí)，形成的微球發(fā)生團(tuán)聚，這是由于過(guò)量的Fe2+中和了羧基的負(fù)電荷，減弱了微球之間的排斥力，引起團(tuán)聚。質(zhì)量比1∶5時(shí)，形成的微球形狀規(guī)則，分散性較好。所以1∶5確定為最佳的交聯(lián)比例。溫度可以影響Fe2+氧化為Fe3+的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，也因此影響到微球形成的動(dòng)力學(xué)。如圖5C所示，當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)，微球呈透明狀，說(shuō)明交聯(lián)度較弱。當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，反應(yīng)過(guò)快，引起微球團(tuán)聚。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，微球交聯(lián)密度提高且分散性較好。從圖4D可以看出，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為30 min時(shí)，OKGM微球形成，且形狀規(guī)則，分散性好。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，微球開(kāi)始團(tuán)聚，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，團(tuán)聚現(xiàn)象加重。因此選擇30 min作為最適合的反應(yīng)時(shí)間。

圖4 各因素對(duì)微球制備的影響Fig.4 Effects of polysaccharide concentration (A), cross-linker concentration (B), temperature (C) and reaction time (D) on (O/W) OKGM microsphere formation by the double emulsion method

綜上所述，形成微球的最佳條件是：OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、預(yù)交聯(lián)劑FeSO4·7H2O與OKGM質(zhì)量比1∶5、交聯(lián)時(shí)間30 min、交聯(lián)溫度35 ℃。

2.3 微球尺寸測(cè)量及形貌觀察

圖5 微球的粒徑分布Fig.5 Size distribution of microspheres

如圖5所示，微球粒徑主要集中在20～40 μm之間，平均粒徑為26.8 μm。

圖6 掃描電鏡下微球的形態(tài)Fig.6 Morphology of mirospheres under SEM

如圖6所示，微球呈光滑球形，大小在幾微米到幾十微米之間，和圖5 的粒徑分布結(jié)果相符。

圖7 原子力顯微鏡下微球的形態(tài)Fig.7 Morphology of microspheres under AFM

原子力顯微鏡可以進(jìn)一步觀察到納米尺度的微球表面細(xì)微結(jié)構(gòu)，圖7B顯示的是微球表面褶皺，褶皺的平均厚度約3 nm，這可能是由多糖和鐵在微球表面的交聯(lián)反應(yīng)不均一造成的。

2.4 單乳液法制備的微球吸附花色苷

圖8 熒光分光光度計(jì)下微球吸附花色苷?qǐng)DFig.8 CLSM images of anthocyanin s encapsulated in OKGM micr ospheres

采用W/O單乳液法可制備不含內(nèi)油相的氧化魔芋微球。負(fù)電荷氧化微球可用來(lái)吸附正電荷的活性因子?；ㄉ找蛟趐H 3的條件下帶正電荷，能夠通過(guò)靜電作用吸附于OKGM微球中?；ㄉ找彩且环N天然熒光劑，可以被488 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)發(fā)射產(chǎn)生熒光。共聚焦激光掃描顯微鏡可以聚焦到樣品中心的微米級(jí)薄厚，因此利用此手段，能夠觀察到花色苷在微球中心薄層中的分布。如圖8所示，花色苷均勻地分散在微球內(nèi)部，這表明OKGM微球能夠成功吸附花色苷。前期研究表明TEMPO氧化淀粉水凝膠同樣可以吸附花色苷，并且吸附受鹽質(zhì)量濃度以及溶液的pH值影響[24]。該結(jié)果表明OKGM可以成功地吸附正電荷的活性小分子。

2.5 雙重乳液法制備的微球共裝載親疏水性小分子

圖9 熒光分光光度計(jì)下微球 同時(shí)吸附脂溶性、水溶性藥物圖Fig.9 CLSM images of co-delivery of hydrophobic and hydrophilic drugs in OKGM microspheres

如果利用O/W/O雙重乳液法，可制備出含有內(nèi)油相的OKGM微球，在內(nèi)油相中溶有疏水性活性因子，例如β-胡蘿卜素，可解決難溶性活性因子的水溶性和穩(wěn)定性問(wèn)題。如果再通過(guò)靜電吸附作用吸附正電荷親水小分子，可使OKGM微球同時(shí)遞送疏水和親水性活性分子，協(xié)同發(fā)揮作用，抗氧化能力更強(qiáng)。為了驗(yàn)證該想法的可行性，用熒光染料尼羅紅和SUPER-greenⅠ分別代表疏水性和親水性小分子，兩者激發(fā)后可以在不同波段發(fā)射出不同顏色的熒光，這樣便可借助熒光分光光度計(jì)觀察和區(qū)分兩者在微球中的分布。如圖9所示，紅色的內(nèi)油相和綠色的水相表明微球可以成功地包埋和吸附疏水性和親水性分子。實(shí)驗(yàn)表明該微球可以同時(shí)吸附β-胡蘿卜素和花色苷。由于三價(jià)鐵在酸性條件下穩(wěn)定而在堿性條件下易和水反應(yīng)生成鐵的氧化物。因此OKGM微球在胃酸條件下穩(wěn)定，在腸中性環(huán)境下破裂釋放出被包埋物質(zhì)，因此，pH值相應(yīng)的OKGM微球也具有腸靶向釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能[25]。

3 結(jié) 論

以TEMPO氧化得到的OKGM為原料，鐵離子為交聯(lián)劑，通過(guò)物理交聯(lián)的方式制得了氧化魔芋微球。通過(guò)雙重乳液交聯(lián)法制得含有內(nèi)油相的氧化魔芋微球，可實(shí)現(xiàn)親疏水活性因子的共裝載。采用單因素試驗(yàn)，確定制備微球的最佳工藝條件是OKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、FeSO4·7H2O與OKGM質(zhì)量比1∶5、交聯(lián)時(shí)間30 min、交聯(lián)溫度35 ℃。

本研究提供了一種以氧化KGM為新材料制備微球?qū)崿F(xiàn)活性因子穩(wěn)態(tài)化的新策略，該微球可提高難溶性和敏感活性因子的分散性和穩(wěn)定性，并同時(shí)裝載多種活性因子，在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。

[1] BOON C S, MCCLEMENTS D J, WEISS J, et al. Factors influencing the chemical stability of carotenoids in foods[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2010, 50: 515-532. DOI:10.1080/10408390802565889.

[2] ACOSTA E. Bioavailability of nanoparticles in nutrient and nutraceutical delivery[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Science, 2009, 14: 3-15. DOI:10.1016/j.cocis.2008.01.002.

[3] LI Y, RENKO D V, TED S, et al. Preparation and characterization of oxidized starch polymer microgels for encapsulation and controlled release of functional ingredients[J]. Biomacromolecules, 2009, 10: 1931-1938. DOI:10.1021/bm900337n.

[4] TIAN X N. Inclusion interactions and molecular microcapsule of Salvia sclarea L. essential oil with β-cyclodextrin derivatives[J]. European Food Research and Technology, 2008, 227(4): 1001-1007. DOI:10.1007/s00217-007-0813-7.

[5] HEBRARD G, BLANQUET S, BEYSSAC E, et al. Use of whey protein beads as a new carrier system for recombinant yeasts in human digestive tract[J]. Journal of Technology, 2006, 127(1): 151-167. DOI:10.1016/j.jbiotec.2006.06.012.

[6 ] LEE K Y, HEO T R. Survival of Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginate beads in simulated gastric juices and bile salt solution[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(2): 869-873. DOI:10.1128/AEM.66.2.869-873.2000.

[7] CHEN X D, WANG S S, LU M L, et al. Formation and characterization of light-responsive TEMPO-oxidized konjac glucomannan microspheres[J]. Biomacromolecules, 2014, 15: 2166-2171. DOI:10.1128/AEM.66.2.869-873.2000.

[8] CHUA M, BALDWIN T C, HOCKING T J, et al. Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K Koch ex N. E. Br.[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 128: 268-278. DOI:10.1016/j.jep.2010.01.021.

[9] FANG W X, WU P W. Variations of konjac glucomannan (KGM) from Amorphophallus konjac and its refined powder in China[J]. Food Hydrocolloids, 2004, 18: 167-170. DOI:10.1016/S0268-005X(03)00044-4.

[10] 尚曉婭, 欽傳光, 牛衛(wèi)寧, 等. 新型功能材料魔芋葡甘聚糖的研究與應(yīng)用[J]. 材料導(dǎo)報(bào), 2009(19): 32-36. DOI:10.3321/j.issn:1005-023X.2009.19.008.

[11] 席曉莉, 吳道澄, 吳紅. 魔芋超細(xì)粉末的減肥作用[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 19: 1812-1814. DOI:10.3321/ j.issn:1000-2790.2003.19.025.

[12] 黃來(lái)發(fā). 食品增稠劑[M]. 2版. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2009: 1-5.

[13] FELIPE A M, KEVIN B, STEFAAN C D, et al. Characterization of diffusion of macromolecules in konjac glucomannan solutions and gels by fluorescence recovery after photobleaching technique[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2006, 316: 37-46. DOI:10.1016/j.ijpharm.2006.02.029.

[14] 羅立新, 馮長(zhǎng)根. 交聯(lián)魔芋葡甘露聚糖微球的制備與表征[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2004, 24(2): 77-79. DOI:10.3321/j.issn:0253-2417.2004.02.018.

[15] SUPHAT K, PORNPUSADEE U, NARONG P, et al. Controlled release of diclofenac from matrix polymer of chitosan and oxidized konjac glucomannan[J]. Marine Drugs, 2011, 9: 1649-1663. DOI:10.3390/md9091649.

[16] HUANG R L, QI W, FENG L B, et al. Self-assembling peptidepolysaccharide hybrid hydrogel as a potential carrier for drug delivery[J]. Soft Matter, 2011, 7: 6222-6230. DOI:10.1039/ C1SM05375B.

[17] 仰振球, 宋寶珍, 李巧霞, 等. 生物黏附性微球的制備及其評(píng)價(jià): Ⅰ.離子交聯(lián)法制備生物黏附性微球及其粒徑預(yù)測(cè)[J]. 過(guò)程工程學(xué)報(bào), 2005, 5(5): 558-562. DOI:10.3321/j.issn:1009-606X.2005.05.020.

[18] NOOY A E J D, BESEMER A C, BEKKUM H V. Highly selectively nitroxyl radical-medical-mediated oxidation of primary alcohol groups in water-soluble glucans[J]. Carbohydrate Research, 1995, 269: 89-98. DOI:10.1016/0008-6215(94)00343-E.

[19] CUI Y N, XU Q X, CHOW P K H, et al. Transferrin-conjugated magnetic silica PLGA nanoparticles loaded with doxorubicin and paclitaxel for brain glioma treatment[J]. Biomaterials, 2013, 34(33): 8511-8520. DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.07.075.

[20] KONG J M, CHIA L S, GOH N K, et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry, 2003, 64(5): 923-933. DOI:10.1016/S0031-9422(03)00438-2.

[21] SUDA I, OKI T, MASUDA M, et al. Direct absorption of acylated anthocyanin in purple-fleshed sweet potato into rats[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2002, 50: 1672-1676. DOI:10.1021/ jf011162x.

[22] SHIR J, CHEN K Y, WEN Y D, et al. Genistein and beta-carotene enhance the growth-inhibitory effect of trichostatin A in A549 cells[J]. European Journal of Nutrition, 2010, 49: 19-25. DOI:10.1007/s00394-009-0044-8.

[23] LI Y, de VRIES R, KLEIGN M, et al. Lysozyme uptake by oxidized starch polymer microgels[J]. Biomacromolecules, 2009, 11(7): 1754-1762. DOI:10.1021/bm100206k.

[24] WANG Z R, LI Y, CHEN L, et al. A study of controlled uptake and release of anthocyanins by oxidized starch microgels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(24): 5880-5887. DOI:10.1021/jf400275m.

[25] WANG S S, CHEN X D, SHI M X, et al. Absorption of whey protein isolated (WPI)-stabilized β-carotene emulsions by oppositely charged oxidized starch microgels[J]. Food Research International, 2015, 67: 315-322. DOI:10.1016/j.foodres.2014.11.041.

Preparation and Application of TEMPO-Oxidized Konjac Glucomannan Micropsheres in Delivery of Food Bioactives

CHEN Yuying, CHEN Xiaodong, SHI Mengxuan, LU Meiling, ZHAO Luhai, LI Yuan*
(College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)

2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy (TEMPO) was applied to catalyze the oxidation of konjac glucomannan (KGM), which was selectively oxidized by sodium hypochloryte to 80% degree of oxidization (DO) yielding TEMPO-oxidized konjac glucomannan (OKGM). A microsphere delivery system that allowed the co-delivery of hydrophobic and hydrophilic ingredients was prepared by cross-linking the carboxyl groups of TEMPO-OKGM polymers with ferric ions through double emulsion cross-linking reaction which enabled the dissolution of β-carotene in the inner oil phase and the absorption of anthocyanins to the polymer phase. Fourier transform infrared spectroscopic (FT-IR) results proved the oxidation of the hydroxyl groups into carboxyl groups. The cell viability experiment showed that the OKGM polymer had negligible cytotoxicity. The optimum conditions for OKGM microspheres preparation were as follows: OKGM concentration, 10%; mass ratio of cross-linker FeSO47H2O to polymer, 1:5; cross-linking time, 30 minutes; and reaction temperature, 35 ℃. The size distribution of OKGM microspheres measured by dynamic light scattering was 20 to 40 μm, and the av erage diameter was 26.8 μm. The surface morphology of microspheres was observed by scanning electron microscopy and atomic force microscopy. By confocal laser scanning microscopy, the distribution of hydrophobic and hydrophilic ingredients was observed simultaneously. OKGM microspheres showed a great potential for delivering multiple nutrients.

konjac glucomannan; microspheres; bioactive ingredients; dispersibility; stability; intestine-specific; controlled release; microencapsulation

10.7506/spkx1002-6630-201602001

TS201.2

A

1002-6630（2016）02-0001-06

陳鈺瑩, 陳小冬, 史夢(mèng)璇, 等. TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖微球的制備及其在運(yùn)載食品活性因子中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602001. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yuying, CHEN Xiaodong, SHI Mengxuan, et al. Preparation and application of TEMPO-oxidized konjac glucomannan micropsheres in delivery of food bioactives[J]. Food Science, 2016, 37(2): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602001. http://www.spkx.net.cn

2015-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31471577）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31201334）

陳鈺瑩（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锎蠓肿虞d體、食品膠體科學(xué)。E-mail：chenyuxiaoying@163.com *通信作者：李媛（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)榛钚砸蜃臃€(wěn)態(tài)化、食品生物大分子載體、食品膠體科學(xué)。E-mail：liyuan@mail.buct.edu.cn