恩度聯(lián)合奧沙利鉑對裸鼠胃癌種植瘤的抑制作用研究

龐凌坤，蔣志慶，田小林

(1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科;2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科,廣西 桂林　541000)

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恩度聯(lián)合奧沙利鉑對裸鼠胃癌種植瘤的抑制作用研究

龐凌坤1，蔣志慶2，田小林1

(1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科;2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科,廣西 桂林541000)

目的：探討恩度聯(lián)合奧沙利鉑對裸鼠胃癌種植瘤的抑制作用。方法：將人胃癌細胞SGC-7901注射于裸鼠腋下皮下，裸鼠腋下均出現(xiàn)瘤塊即造模成功。將成模裸鼠32只隨機分空白組、奧沙利鉑組、恩度組和恩度+奧沙利鉑組，每組各8只。給藥方式均為腹腔注射，持續(xù)給藥14 d。給藥期間，每72 h稱重1次，游標卡尺測量腫塊的最長徑、最短徑，計算腫瘤相對體積。用藥完成后，處死裸鼠，取瘤組織，稱瘤重用于計算抑瘤率。對腫瘤組織和可疑淋巴結(jié)進行免疫組織化學(xué)染色，檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-C)的表達，并應(yīng)用podoplanin蛋白作為淋巴管標記物，計算各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率及微淋巴管密度(LVD)。結(jié)果：恩度和奧沙利鉑均能抑制腫瘤生長，但兩者聯(lián)合應(yīng)用的效果優(yōu)于單獨應(yīng)用；使用恩度組的淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及LVD均明顯低于空白組與奧沙利鉑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；奧沙利鉑組與空白組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；恩度組和奧沙利鉑+恩度組VEGF-C表達的光密度值顯著低于空白組和奧沙利鉑組(P<0.01)。結(jié)論：恩度聯(lián)用奧沙利鉑明顯抑制裸鼠皮下種植腫瘤的生長和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生了協(xié)同抗腫瘤作用。

胃癌;恩度;奧沙利鉑;淋巴轉(zhuǎn)移

腫瘤細胞生長和正常細胞生長一樣，需要血液提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，但是惡性腫瘤能產(chǎn)生某些物質(zhì)，促進腫瘤組織產(chǎn)生多于正常組織的新生血管，從而使腫瘤組織生長失控。因此，控制腫瘤血管生長是一種有效的治療腫瘤的手段[1-2]。單獨應(yīng)用恩度或聯(lián)合其他藥物抑制腫瘤血管新生的研究已取得很多成果[3-4]，但恩度聯(lián)合奧沙利鉑對腫瘤淋巴管的生成能否起到抑制作用，相關(guān)報道仍少見。本研究探討恩度聯(lián)合奧沙利鉑對裸鼠胃癌種植瘤的抑制作用，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及材料

人胃癌SGC-7901細胞株為桂林醫(yī)學(xué)院分子實驗室饋贈，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培育繁殖。培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，培養(yǎng)液加入濃度為100 μg/mL的青霉素及鏈霉素和5%胎牛血清。BALB/C裸鼠32只，購于湖南斯萊克景達試驗動物有限公司。鼠齡4～6周，體重20～22 g，雌性，均在桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，墊料、飼料及飲用水均經(jīng)高壓高溫消毒。恩度(國藥準字S200S0088)購于山東先聲麥得津生物制藥有限公司。奧沙利鉑購于山東齊魯制藥有限公司。鼠抗Podoplanin Protein/gp36試劑盒購于Novus公司。

1.2建立模型

將對數(shù)期貼壁生長良好的人胃癌SGC-7901細胞制備成濃度為1×107個/mL的細胞懸液，于裸鼠腋下皮下注入0.2 mL。注射后局部出現(xiàn)明顯皮丘，7 d后，32只裸鼠腋下均出現(xiàn)瘤塊，造模成功。

1.3分組與給藥

接種后11 d將成模裸鼠隨機分為4組(n=8)：空白組，生理鹽水0.2 mL，每24 h1次，奧沙利鉑組，5 mg/kg只，每48 h1次；恩度組，恩度3 mg/kg，每24 h1次；恩度+奧沙利鉑組，恩度3 mg/kg，每24 h1次，奧沙利鉑5 mg/kg，每48 h1次。給藥方式均為腹腔注射，持續(xù)給藥14 d。

1.4觀察指標

每24 h觀察裸鼠的日?；顒?、飲食和排便等。每72 h稱重一次，用游標卡尺測量腫塊的最長徑、最短徑。計算相對腫瘤體積(RTV)。根據(jù)用藥前后體積的差異來評價各組藥物對腫瘤生長的抑制作用。用藥完成后處死裸鼠，剝離腫瘤組織稱重。可疑轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進行免疫組織化學(xué)染色，淋巴管的標記采用淋巴內(nèi)皮標記物podoplanin單克隆抗體進行免疫組織化學(xué)染色。光鏡下觀察，淋巴管內(nèi)皮細胞podoplanin染色陽性，細胞膜、細胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，任何被染成棕黃或棕褐色的、分界清楚的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞團簇，均作為一個淋巴管計數(shù)。淋巴管密度計數(shù)標準：先在低倍光鏡(×100)下全面觀察切片，確定淋巴管密度(LVD)最高處，再于高倍光鏡下(×200)計數(shù)podoplanin陽性的淋巴管數(shù)目。應(yīng)用多功能病理圖像分析儀計數(shù)每個標本4個視野內(nèi)的淋巴管數(shù)，其總值即為該標本的LVD。采用德國LEICA公司病理圖像分析儀進行圖像分析，測定其陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值。陽性細胞為胞漿呈棕色或棕褐色的組織細胞，取其平均值作為VEGF-C蛋白表達的相對含量。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1治療后各組移植瘤質(zhì)量及相應(yīng)抑瘤率比較

用藥組的瘤重均小于空白組，其中聯(lián)合用藥組的瘤重最?。挥盟幗M中，恩度組與奧沙利鉑組的抑瘤率無明顯差異(P>0.05)；聯(lián)合用藥組的抑瘤率顯著高于單一用藥組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

表1　治療后各組移植瘤重量及相應(yīng)抑瘤率(n=8)

*P<0.05，與奧沙利鉑組、恩度組比較。

2.2各組移植瘤生長曲線比較

各給藥組的皮下移植瘤生長速度均低于空白組。恩度與奧沙利鉑聯(lián)合后抑制腫瘤生長的效果明顯優(yōu)于兩者單獨使用。見圖2。

2.3各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、轉(zhuǎn)移陽性率及LVD比較 移植瘤生長天數(shù)(d) 移植瘤體積(cm3)

恩度組與奧沙利鉑+恩度組的淋巴轉(zhuǎn)移陽性率、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及LVD顯著低于空白組與奧沙利鉑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；奧沙利鉑組與空白組之間，恩度組與奧沙利鉑+恩度組之間，各數(shù)值差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表2。

表2　各組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、陽性率及LVD(n=8)

組別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)/枚陽性率/%LVD空白3.40±0.551.00±0.019.29±0.19奧沙利鉑3.50±1.490.98±0.019.16±0.39恩度0.41±0.92*0.44±0.01*4.43±0.30*恩度+奧沙利鉑0.39±0.47*0.43±0.01*4.54±0.28*

*P<0.01，恩度組與空白組、奧沙利鉑組比較。

2.4各組移植瘤VEGF-C光密度值比較

空白組、奧沙利鉑組、恩度組和奧沙利鉑+恩度組的光密度值分別為0.87±0.10，0.85±0.14，0.45±0.09和0.39±0.13。VEGF-C蛋白陽性染色見于細胞漿內(nèi)，呈棕色或棕褐色顆粒狀?？瞻捉M和奧沙利鉑組陽性表達分布廣泛，染色較強；恩度組和奧沙利鉑+恩度組的陽性表達明顯受到抑制，陽性染色細胞數(shù)目減少。恩度組與空白組、奧沙利鉑組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；奧沙利鉑+恩度組與空白組、奧沙利鉑之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3　討論

腫瘤組織主要通過微血管的形成來營養(yǎng)汲取。因此，減少腫瘤內(nèi)部血管生成可以成功抑制腫瘤組織生長甚至消滅腫瘤細胞。隨著研究不斷深入，內(nèi)源性血管生成抑制因子相繼被發(fā)現(xiàn)[5-6]。內(nèi)皮抑素(ES)抑制腫瘤血管新生的效果最為顯著[7]。ES是從小鼠血管內(nèi)皮細胞瘤的體外培養(yǎng)液中提取出的一種蛋白，分子大小為20 KD，由184個氨基酸片段構(gòu)成。改進研發(fā)的重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度，YH-16)相比于傳統(tǒng)血管內(nèi)皮抑素在穩(wěn)定性和生物活性方面明顯加強，同時保持了ES耐藥性低，不良反應(yīng)少等優(yōu)點[8-9]。淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移主要方式之一，是造成胃癌患者高死亡率的最主要原因[10]。多數(shù)胃癌患者確診前淋巴結(jié)已經(jīng)轉(zhuǎn)移[11]。早期，人們認為腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移主要通過原發(fā)灶周圍既有的淋巴管實現(xiàn)，近年，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織自身能夠促進淋巴管的新生從而實現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究中，恩度聯(lián)合奧沙利鉑對人胃癌SGC-7901裸鼠模型進行藥物干擾，探討其對淋巴管新生的抑制作用。由于裸鼠自身的特異性，能夠最大程度降低自身免疫系統(tǒng)對受試藥物的干擾，且造模成功率高，效果明顯。

本研究證實，恩度與奧沙利鉑都能抑制腫瘤的生長，但2者聯(lián)用后的效果明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用。奧沙利鉑為第3代鉑類抗腫瘤藥，直接對腫瘤細胞采取化學(xué)殺傷和抑制，也能影響腫瘤組織內(nèi)部血管的新生，強化恩度抗血管新生效果[15]。恩度能降低血管內(nèi)皮細胞的新生及遷移能力，使腫瘤組織內(nèi)部新生血管減少從而達到增加血管通透性的目的。更多的腫瘤細胞暴露在外細胞毒性藥中，從而增強了奧沙利鉑對腫瘤細胞的殺傷作用[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)，恩度能抑制裸鼠皮下移植瘤淋巴管的新生和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，奧沙利鉑單獨應(yīng)用未發(fā)現(xiàn)該作用。這是因為使用恩度后腫瘤周圍的淋巴管數(shù)目減少，瘤細胞侵犯淋巴管的機率也相對降低[17]，與已有的研究[18-19]結(jié)果一致。早有研究者[20]發(fā)現(xiàn)VEGF-C的高表達可促進腫瘤淋巴管生成及增加淋巴管的密度，從而促進淋巴的轉(zhuǎn)移。本研究中使用恩度組的腫瘤細胞VEGF-C的表達明顯下降，可能是恩度下調(diào)VEGF-C mRNA的轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯，進而影響VEGF-C的生成，或者恩度作用于轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中剪切或修飾系統(tǒng)使VEGF-C生成減少?？梢娨种颇[瘤細胞VEGF-C的表達可能是恩度抑制瘤周淋巴管生成及局部淋巴管轉(zhuǎn)移的途徑之一。綜上所述，恩度聯(lián)合奧沙利鉑能明顯抑制裸鼠皮下移植胃癌腫瘤生長，降低腫瘤微血管密度。此聯(lián)合治療方式在動物實驗中取得了良好效果，但其最合適藥物劑量、應(yīng)用順序及抗腫瘤作用的分子機制需進一步研究。

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(學(xué)術(shù)編輯：肖江衛(wèi))

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Study on endostar combined with oxaliplatin in inhibiting transplanted gastric tumors in naked mice

PANG Ling-kun1,JIANG Zhi-qing2,TIAN Xiao-lin1

(DepartmentofGastrointestinalSurgery1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity;2.TheAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,Guangxi,China)

Objective：To explore the effect of endostar combined with oxaliplatin in inhibiting transplanted gastric tumors in naked mice.Methods：Human gastric cancer cell SGC-7901 was injected under subcutaneous armpits of naked mice until tumors appeared under their armpits.A total of 32 naked mices models were successfully established and randomly divided into blank group,oxaliplatin group,endostar group and combined group of endostar plus oxaliplatin,8 cases for each group.All group were intraperitoneally injected with drugs for continuously 14 d.During drug administration,the mice were weighed once every 72 h.Vernier caliper was used to measure the maximum and minimum diameters of the lumps to calculate the relative sizes of tumors.The naked mice were sacrificed after drug administration was finished to collect the tumor tissues.Then,the tumor weight was measured to calculate tumor inhibiting rate.Immunohistochemical staining was conducted to tumor tissues and suspicious lymph nodes,and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF-C) was detected. Podoplanin protein was used as lymphatic duct marker so as to calculate the positive rate of lymph node metastasis and lymphatic microvessel density (LVD).Results：Both endostar and oxaliplatin could inhibit the development of tumors,but their combination was more superior than single use in clinical efficacy.Endostar group was markedly lower than blank group and oxaliplatin group in positive rate of lymph node metastasis,count of metastatic lymph nodes and LVD,and there were significant differences (P<0.01),but the differences between oxaliplatin group and blank group were not significant (P>0.05).The optical density of endostar group and oxaliplatin+endostar group was significantly lower than that in oxaliplatin group and blank group (P<0.01).Conclusion：Endostar combined with oxaliplatin can significantly inhibit the growth of subcutaneous transplanted tumors and the metastasis of lymph nodes in naked mice,with synergic anti-tumor effect obtained.

Gastric cancer;Endostar;Oxaliplatin;Lymph node metastasis

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.012

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(z2013476)

2016-06-18

龐凌坤(1963-)，男，副主任醫(yī)師。E-mail: depanglk@126.com

時間：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.024.html

1005-3697(2016)05-0666-04

R735.2

A