活血解毒方對干燥綜合征小鼠頜下腺AQP5表達(dá)的影響

李方凱，谷新怡，崔民英，王東峰，王 敏，朱躍蘭△

1北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京100078；2北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

活血解毒方對干燥綜合征小鼠頜下腺AQP5表達(dá)的影響

李方凱1，谷新怡1，崔民英2，王東峰2，王 敏2，朱躍蘭1△

1北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京100078；2北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

目的：探討活血解毒方對干燥綜合征（SS）模型小鼠頜下腺A Q P5表達(dá)的影響。方法：以BA BL/C小鼠為正常組，選取N O D小鼠為SS模型并隨機(jī)分為模型組、活血解毒方組（H X JD）和白芍總苷膠囊組（TG PC），給藥后觀察各組小鼠頜下腺形態(tài)學(xué)和分泌功能的改變，并采用SA BC法檢測各組小鼠頜下腺A Q P5表達(dá)水平的變化。結(jié)果：藥物干預(yù)8周后，模型組較正常組表達(dá)A Q P5明顯降低；與模型組比較，TG PC組和H X JD組A Q P5表達(dá)均顯著升高；TG PC組和H X JD組之間A Q P5表達(dá)無明顯差異。結(jié)論：活血解毒方可改善SS模型鼠頜下腺腺泡的分泌功能，提高其頜下腺指數(shù)，增加SS模型鼠的唾液分泌量；其作用機(jī)理與上調(diào)A Q P5的表達(dá)水平有關(guān)。

干燥綜合征；活血解毒方；A Q P5

干燥綜合征(sjogren′s syndrome，SS)是一種累及全身多系統(tǒng)的慢性炎癥性自身免疫疾病，病理特征為高度淋巴細(xì)胞浸潤，主要侵犯唾液腺和淚腺等外分泌腺，臨床癥狀主要表現(xiàn)為口眼干燥、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、皮膚黏膜干燥等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對SS病因和發(fā)病機(jī)制的研究尚未達(dá)成一致。近年相關(guān)研究結(jié)果表明［1］，水通道蛋白(aquaporins，water channel protein，AQ P)在SS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，而AQ P5是最早被確定分布在涎腺腺泡細(xì)胞的水通道蛋白，它構(gòu)成涎腺唾液分泌的通道而具有水轉(zhuǎn)運(yùn)的特性。SS的中醫(yī)病機(jī)以陰津虧虛為基礎(chǔ)，以燥毒瘀互結(jié)為病理關(guān)鍵，同時燥毒貫穿始終，運(yùn)用清燥解毒、活血化瘀法調(diào)節(jié)頜下腺AQ P5的分布，從而改善腺體的分泌功能，在改善SS患者臨床癥狀方面取得了一定療效。在此基礎(chǔ)上，本研究從腺體分泌功能變化方面探討活血解毒方對SS的干預(yù)途徑，為臨床應(yīng)用活血解毒方治療SS提供生物學(xué)依據(jù)。從腺體分泌功能變化方面著手，研究AQ P5表達(dá)在SS發(fā)病機(jī)制中的作用，初步探討活血解毒方對SS模型鼠腺體分泌功能的影響及其干預(yù)機(jī)理，測定SS模型鼠頜下腺AQ P5的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 動物 9～10周齡雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g［維通利華實(shí)驗動物技術(shù)公司，實(shí)驗動物合格證號：SCXK(京)2006-0009］；9～10周齡雌性N O D/Ltj小鼠，體質(zhì)量16～18 g［華阜康生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗動物合格證號：SCXK(京) 2009-0004］)。

1.2 藥品 活血解毒方(丹參、當(dāng)歸、川芎、雞血藤、玄參、連翹、甘草、生地黃、麥冬等由附屬醫(yī)院中草藥房提供并統(tǒng)一煎煮)；白芍總苷膠囊(帕夫林，寧波立華制藥有限公司，批號：110916)根據(jù)體表面積換算成小鼠用量并按比例配成23.4m g/m L。

1.3 試劑 Anti-AQ P5抗體(美國Abcam公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)；DAB染色試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)；蘇木素染色液(上海研域生物科技有限公司)等。

1.4 儀器 EP214C電子分析天平(O H AUS，美國)；圖像分析系統(tǒng)Im age Pro Pl us5.0；正置顯微鏡BX51(O l ym pus，日本)等。

1.5 分組與給藥 正常組為BALB/c小鼠6只，將N O D/Ltj小鼠18只按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、白芍總苷組(TGPC)、活血解毒方組(H XJ D)各6只；各組用藥量根據(jù)人與小鼠體表面積比計算等效劑量，小鼠灌胃體積為10m L/kg。

1.6 標(biāo)本收集 各組均在第1周起給藥，每天1次至第8周；8周后，小鼠摘眼球放血并解剖摘取頜下腺進(jìn)行指標(biāo)檢測；取一側(cè)新鮮頜下腺組織，10%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片。

1.7 指標(biāo)測定

1.7.1 小鼠一般狀態(tài) 進(jìn)食量的測定：每日測定各組小鼠24小時的飼料重量之差，計為進(jìn)食量；飲水量的測定：每日測定各組小鼠24小時的水瓶重量之差，計為飲水量。

1.7.2 小鼠頜下腺功能變化觀察 頜下腺指數(shù)：藥物干預(yù)8周后取一側(cè)頜下腺稱重，頜下腺指數(shù)=頜下腺重量(m g)/小鼠體質(zhì)量(g)；唾液分泌量：給藥后動態(tài)測定小鼠唾液分泌量，將干棉球放入口頰內(nèi)3分鐘后取出稱濕重，唾液分泌量(m g)=濕重(m g)-干重(m g)。

1.7.3 小鼠頜下腺A Q P5表達(dá)測定 運(yùn)用免疫組化SABC法進(jìn)行AQ P5表達(dá)染色：標(biāo)本常規(guī)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，PBS洗5分鐘；滴加兔血清封閉液，室溫20分鐘；滴加一抗AQ P5抗體，室溫1小時，PBS洗3次各2分鐘；滴加二抗兔抗山羊IgG，室溫20分鐘，PBS洗3次各2分鐘；滴加SABC試劑，室溫20分鐘，PBS洗4次各5分鐘；DAB試劑盒染色，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染2分鐘；脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以(±s)表示，組間多重比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則用Gam es-H ow el l檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量 正常組小鼠體質(zhì)量隨時間穩(wěn)定增加，與模型組比較在第4周起體質(zhì)量低于正常組(P＜0.05)。第8周時，模型組、H XJ D組及TGPC組體質(zhì)量低于正常組(P＜0.05)；與模型組相比，H XJ D組體質(zhì)量升高(P＜0.05)；而TGPC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；H XJ D組和TGPC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 小鼠體質(zhì)量變化情況（±s） g

表1 小鼠體質(zhì)量變化情況（±s） g

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與對照組比較，P＜0.05。

2 4 6 8

2.2 小鼠頜下腺指數(shù) 與正常組比較，對照組、TGPC組、H XJ D組小鼠頜下腺萎縮(P＜0.01)，而TGPC組、H XJ D組頜下腺指數(shù)高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組小鼠頜下腺指數(shù)比較（±s） m g/g

表2 各組小鼠頜下腺指數(shù)比較（±s） m g/g

注：*表示與正常組比較，P＜0.01。

組別 只數(shù) 頜下腺指數(shù)正常組 6 7.75±1.52模型組 6 4.43±0.99*TG PC組 6 4.90±0.76*H X JD組 6 5.78±0.90*

2.3 小鼠唾液分泌量變化 正常組唾液分泌量一直保持穩(wěn)定；從實(shí)驗開始至結(jié)束時，與正常組相比，對照組、TGPC組、H XJ D組唾液分泌量均降低(P＜0.01)；3組組間比較，在6周時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但到第8周時，與對照組相比，TGPC組和H XJ D組唾液分泌量有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；TGPC組和H XJ D組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組不同時間點(diǎn)唾液流量比較(±s) m g/m i n

表3 各組不同時間點(diǎn)唾液流量比較(±s) m g/m i n

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；#表示與對照組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周正常組 6 16.33±1.94 17.50±2.24 17.33±2.08 18.33±1.88 19.33±2.09模型組 6 4.17±0.75* 4.67±1.21* 7.67±1.75* 5.67±1.67* 4.83±1.59*TG PC組 6 3.83±0.98* 4.16±0.72* 5.83±1.65* 6.33±1.37* 8.17±0.98*#H X JD組 6 4.00±1.67* 4.17±1.56* 6.83±1.39* 6.50±1.74* 12.67±0.97*#

2.4 小鼠頜下腺A Q P5表達(dá)測定 使用SABC免疫組化法對頜下腺AQ P5表達(dá)進(jìn)行染色，其主要分布于腺泡的頂膜、側(cè)膜和導(dǎo)管上皮細(xì)胞等處［2］，染色結(jié)果判定以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色呈現(xiàn)淡黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，各組染色情況見圖1—4。

圖1 正常組

圖2 對照組

圖3 TG PC組

圖4 H X JD組

使用Im age Pro Pl us 5.0軟件圖像半定量分析技術(shù)，在BX51 O l ym pus正置顯微鏡下對圖片染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，測定陽性細(xì)胞染色的積分光密度值(IO D)，染色越強(qiáng)則IO D值越高，表示蛋白表達(dá)量越多，見表4—5。

表4 各組IO D值比較

表5 各組IO D值比較(±s)

表5 各組IO D值比較(±s)

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與對照組比較，P＜0.05，△表示與TG PC組比較，P＞0.05。

組別 只數(shù) IO D值正常組 6 28181.363±10196.698模型組 6 19365.931±6217.369*TG PC組 6 30216.308±7343.341#H X JD組 6 33245.671±7479.597#△

3 討論

SS的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，目前對SS發(fā)病機(jī)制的研究逐漸從引起外分泌腺組織損傷的免疫因素轉(zhuǎn)移到支配腺體的神經(jīng)受體，對后者啟動和延續(xù)因素的進(jìn)一步深入研究是徹底闡明SS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵［3］。近年來，分布在涎腺分泌細(xì)胞表面、對水分子具有高通透性的AQ P5作為自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控涎腺過程中的效應(yīng)蛋白，逐漸引起了SS發(fā)病機(jī)制研究領(lǐng)域的興趣。關(guān)于AQ P5在SS發(fā)病機(jī)制的報道最早見于M oore等［4］的研究中，此后的研究則主要集中在AQ P5在涎腺中的分布及腺泡細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)異常，應(yīng)用免疫組織化學(xué)或免疫熒光染色進(jìn)行定量分析［5-7］。據(jù)目前研究推測，AQ P5是抗Ⅲ型毒蕈堿樣膽堿能受體(m useari ni c receptor，M 3R)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)下游的效應(yīng)蛋白之一，M 3R的激活能使AQ P5蛋白上調(diào)，二者共同參與SS的發(fā)?。?］，因此作為M 3R效應(yīng)蛋白的AQ P5將成為SS病機(jī)和治療研究的主要方向。

總結(jié)近年來諸多醫(yī)家對SS的中醫(yī)病因病機(jī)的認(rèn)識，本病基于素體稟賦不足，以陰津虧虛為本，燥、毒、瘀為標(biāo)，并且后者是病情發(fā)展變化的關(guān)鍵因素［9-10］；而燥盛蓄積，日久成毒，瘀血與燥毒互結(jié)，成為本病纏綿難愈的重要原因［11］。SS之燥具有邪毒的性質(zhì)，此毒邪寓于燥邪卻猛于燥邪，更易于銷爍津液、敗壞形體，同時燥、毒、瘀三者相互結(jié)合，形成了本病紛繁復(fù)雜的病因病機(jī)。與此同時，現(xiàn)代藥理研究表明活血解毒中藥具有抑制腺體自身免疫炎癥性破壞、改善腺體局部免疫微環(huán)境、挽救和保護(hù)腺體功能的作用。因此，圍繞燥毒的核心病理環(huán)節(jié)及燥毒瘀互結(jié)的病理特點(diǎn)，在SS發(fā)病早期重視解毒清燥、活血化瘀法的運(yùn)用，配合益氣養(yǎng)陰生津等扶正之品，在改善患者臨床癥狀方面療效肯定。

基于上述關(guān)于SS的中西醫(yī)病因病機(jī)理論，本研究初步探討了活血解毒方對SS模型鼠頜下腺AQ P表達(dá)的影響及其干預(yù)機(jī)制，分析研究結(jié)果：1)活血解毒方能改善SS模型鼠的頜下腺功能，顯著上調(diào)AQ P5的表達(dá)；2)與正常組相比，對照組AQ P5表達(dá)明顯降低，而治療組AQ P5表達(dá)無明顯差異；3)與對照組相比，TGPC組和H XJ D組AQ P5表達(dá)均有升高，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。因此認(rèn)為，SS模型鼠唾液分泌量減少、頜下腺指數(shù)降低與其頜下腺AQ P5表達(dá)顯著下調(diào)有關(guān)，這與Stei nfel d等［6］的研究結(jié)果一致，說明頜下腺AQ P5表達(dá)減低與SS發(fā)病和口干等癥狀相關(guān)。

總之，活血解毒方可以改善SS模型鼠頜下腺分泌功能，提高頜下腺指數(shù)，增加唾液分泌量，其作用機(jī)理與上調(diào)頜下腺AQ P5的表達(dá)水平有關(guān)。

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The Effects of HuoXue JieDu Prescription on AQP5 Expressions in the Salivary Gland of SS Mice

LI Fangkai1，GU Xinyi1，CUI Minying2，WANG Dongfeng2，WANG Min2，ZHU Yuelan1△
1 Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China；2 The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine

Objective:To explore the effects of HuoXue JieDu prescription on AQP5 expressions in the salivary gland of sjogren's syndrome（SS）mice.Methods:BABL/C mice were chosen as the normal group，NOD mice as SS models，and randomized into the model group，HuoXue JieDu（HXJD）prescription group and total glucosides of paenoy capsule（TGPC）group.Morphological changes and secretion functions of salivary gland in the mice of different groups were observed after the medication，and the levels of AQP5 expressions were determined by adopting SABC method.Results:After intervened for eight weeks with the medicine，the model group was lower than the normal group in AQP5 expressions obviously；compared with the model group，AQP5 expressions raised notably in TGPC group and HXJD group obviously，and there was no obvious difference in the comparison between TGPC group and HXJD group.Conclusion:HuoXue JieDu prescription could improve acini secretion function of salivary gland of SS mice，improve the index of salivary gland，and increase saliva secretion of SS mice，its mechanism is related to AQP5 expressions up regulation.

sjogren's syndrome；HuoXue JieDu prescription；AQP5

R285.5

A

1004-6852（2016）09-0019-04

2015-09-22

李方凱（1986—），男，碩士學(xué)位，醫(yī)師。研究方向：風(fēng)濕免疫疾病的中醫(yī)藥防治。

△通訊作者：朱躍蘭（1959—），女，博士學(xué)位，主任醫(yī)師，教授。研究方向：風(fēng)濕免疫疾病的中醫(yī)藥防治。