近江牡蠣糖胺聚糖毒理學(xué)的初步評價

胡雪瓊，吳紅棉，范秀萍，蔣 楊

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

近江牡蠣糖胺聚糖毒理學(xué)的初步評價

胡雪瓊，吳紅棉*，范秀萍，蔣 楊

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

目的：研究近江牡蠣糖胺聚糖作為保健食品使用的安全性。方法：采用急性毒性實驗、遺傳毒性實驗（Ames實驗、小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗）進(jìn)行毒理學(xué)研究與評價。結(jié)果：小鼠經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均大于20.0g/kg；3項遺傳毒性實驗的結(jié)果皆為陰性，未顯示出致突變性。結(jié)論：近江牡蠣糖胺聚糖急性毒性分級屬無毒級，無遺傳毒性。

近江牡蠣，糖胺聚糖，毒理學(xué)

近江牡蠣（Crassostrea Rivularis），牡蠣科或燕蛤科雙殼類軟體動物，分布于溫帶和熱帶各大洋沿岸水域[1]，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，歷來備受世人推崇。牡蠣含維生素、微量元素、蛋白質(zhì)、牛磺酸等多種營養(yǎng)成分，對人體具有提高免疫力、降血脂、促進(jìn)新陳代謝、改善高血糖癥狀等功能，對抗癌和防止癌細(xì)胞擴散也有一定效果[2]。

本實驗室前期對近江牡蠣糖胺聚糖增強免疫力的功能學(xué)檢驗結(jié)果表明：細(xì)胞免疫、單核巨噬細(xì)胞、抗體生成數(shù)和血清溶血素、NK細(xì)胞的殺傷活性均為陽性，表明其具有免疫增強功能[3]。本研究依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[4]對近江牡蠣糖胺聚糖（Crassostrea Rivularis Glycosaminoglycan）進(jìn)行毒理學(xué)評價，旨在為近江牡蠣糖胺聚糖用作保健食品及藥品提供科學(xué)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣全臟器經(jīng)雙酶酶解[5]、醇沉、脫色和等電點除蛋白和超濾脫鹽濃縮，得到精制品CG 由本實驗室提取制備；SPF級KM小鼠（合格證號：SCXK（湘）2009-0012） 湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供；實驗動物室溫度 22～25℃，相對濕度：55%～70%；組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）TA97、TA98、TA100和TA102廣東省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所惠贈，均置于-80℃保存；酚胺磺（Dexon）、疊氮化鈉（SA）、2-氨基芴（2-AF）、大鼠肝微粒體酶懸液（S9） 匯智泰康生物技術(shù)（北京）有限公司；小牛血清 杭州四季青生物有限公司；Giemsa貯備液 A Fisher ScientificWorld Company；伊紅染色液 廣州市中南化工有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基BD；瓊脂粉 天津市福晨化學(xué)試劑廠；D-生物素、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽 MDBIO. INC；L-組氨酸 中國新興化工試劑研究所；二甲基亞砜 天津高寧精細(xì)化工有限公司；環(huán)磷酰胺CTX江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

PHX型生化培養(yǎng)箱 寧波萊?？萍加邢薰?；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；JJ1006型電子天平 中國雙杰集團有限公司；MS3迷你振蕩器、德國IKA；OLYMPUS CK2型倒置顯微鏡、OLYMPUS CH30型生物顯微鏡 日本OLYMPUS公司；全自動血液生化分析儀 意大利Echo公司；MEK-7222K型全自動血球計數(shù)儀 日本光電公司；TS-12N型生物組織全自動脫水機、BM-VII型生物組織包埋機及冷凍機、CS-VI型攤片烤片機、RS-18型生物組織全自動染色機 湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性實驗 選取18～22g健康KM小鼠20只，雌雄各半。根據(jù)最大耐受劑量法，近江牡蠣糖胺聚糖粉末質(zhì)量濃度為0.25g/mL。灌胃前24h禁食，于次日分4次灌胃（每次灌胃量為20mL/kg），灌胃總量達(dá)20.0g/kg，連續(xù)觀察14d，記錄中毒癥狀及死亡情況。1.2.2 遺傳毒性實驗

1.2.2.1 Ames實驗 選用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102共4株實驗菌株，采用平板摻入法，分加與不加S9混合液兩種。受試物加熱滅菌后，共設(shè)5個劑量組，分別為5000、1000、200、40、8μg/皿。同時設(shè)定1個雙蒸水陰性對照組和3個陽性對照組（Dexon、SA、2-AF），各劑量組各菌株各做3個平行樣，重復(fù)實驗1次。在37℃條件下培養(yǎng)48h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)，求出每組平均菌落數(shù)。當(dāng)受試物回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變的2倍以上并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時即可判定為陽性。

1.2.2.2 小鼠骨髓紅細(xì)胞微核實驗 SPF級KM小鼠（25～30g）50只，隨機分為5組。對照組給予相同體積蒸餾水；陽性對照組為環(huán)磷酰胺（CTX，50mg/kg）；CG高、中、低劑量組分別為10、5、2.5g/kg。采用2次經(jīng)口給受試物，中間間隔24h，于第2次給受試物6h后處死動物，取一側(cè)胸骨制備骨髓涂片。Gimsa染色后鏡檢計數(shù)嗜多染紅細(xì)胞中的微核發(fā)生率（‰）。

1.2.2.3 小鼠精子畸形實驗 SPF級KM小鼠（25～30g）50只，隨機分為5組。對照組給予相同體積蒸餾水；陽性對照組為環(huán)磷酰胺（CTX，50mg/kg）；CG高、中、低劑量組分別為10、5、2.5g/kg（為人可能攝入量的100、50、25倍）。各組均按20mL/kg經(jīng)口灌胃，每日1次，連續(xù)5d。首次給藥后的第35d頸椎脫臼法處死小鼠，制備精子標(biāo)本，1%伊紅染色。高倍鏡下觀察，每只動物計數(shù)1000個精子，記錄畸形精子數(shù)，計算精子畸變率（‰）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用x±S表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 近江牡蠣糖胺聚糖急性毒性實驗

在14d的觀察期內(nèi)，動物的活動及體質(zhì)量增長正常，無一動物死亡；外觀、體征、行為活動、精神狀態(tài)、飲食、大小便等均未有異常改變；口、眼、鼻等處也無異常分泌物。經(jīng)解剖小鼠，肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與正常小鼠比較，皆未發(fā)現(xiàn)明顯病變和差異。表明該受試物對雌、雄小鼠經(jīng)口最大可耐受劑量（MTD）≥20g/kg。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》附錄D急性毒性劑量分級表的規(guī)定，近江牡蠣CG屬無毒級。

表1 Ames實驗結(jié)果（x±S，n=3）Table 1 Results of Ames tes（tx±S，n=3）

2.2 近江牡蠣糖胺聚糖遺傳毒性實驗

2.2.1 Ames實驗 從表1可見，通過一般觀察，發(fā)現(xiàn)各組各皿均未見細(xì)菌毒性表現(xiàn)及沉淀。菌落計數(shù)兩次實驗，結(jié)果均表明，陽性對照組TA97、TA98、TA100和TA102的回變菌落數(shù)與陰性對照組比較顯著增加（p＜0.01）；近江牡蠣糖胺聚糖五個劑量組TA97、TA98、TA100和TA102的回變菌落數(shù)，無論有無S9活化系統(tǒng)，與陰性對照組相比無顯著性關(guān)系，表明近江牡蠣糖胺聚糖無明顯的突變作用。

因此，依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）和GB 15193.4-2003鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶實驗評價標(biāo)準(zhǔn)判斷，近江牡蠣糖胺聚糖在鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變體系中未顯示有致突變作用。

2.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗 由表2可以看出，在兩性小鼠中CG各劑量組的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)/成熟紅細(xì)胞（PCE/RBC）與相應(yīng)對照組相比無顯著性差異；而且也未少于對照組的20%，表明CG未對骨髓細(xì)胞分裂產(chǎn)生抑制[6-8]。與對照組相比，兩性小鼠的CTX組微核率均有極顯著性差異（p＜0.01），表明發(fā)生了突變；兩性小鼠的CG各劑量組微核率均無顯著性變化（p＞0.05），且無劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，CG對兩性小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率無影響。

表2 近江牡蠣糖胺聚糖對小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響（x±S，n=10）Table 2 Effect of CG on micronucleus rate of mouse bone marrow polychromatic erythrocyte（x±S，n=10）

2.2.3 小鼠精子畸形實驗 由表3可知，與對照組比，CTX組的畸變率有極顯著升高（p＜0.01）；CG劑量組對小鼠精子畸形發(fā)生率未產(chǎn)生明顯改變，各劑量組與對照組相比，無顯著差異（p＞0.05）；表明CG無致小鼠精子畸形作用。

表3 近江牡蠣糖胺聚糖對小鼠精子畸形的影響（x±S，n=10）Table 3 Effect of CG on mouse sperm abnormality（x±S，n=10）

3 討論

海洋動物中的多糖類物質(zhì)具有較好的生物活性與應(yīng)用價值，美國、歐洲、日本等采用現(xiàn)代生物、新型化學(xué)化工和食品加工高新技術(shù)，研究開發(fā)牡蠣的功能活性成分，已開發(fā)了保健療效品、調(diào)味品及食品添加劑等產(chǎn)品[9]。盡管牡蠣在國內(nèi)外均為常規(guī)食用的普通食品，且是國家衛(wèi)生部規(guī)定的藥食同源物品，并采用食品級酶與食品級酒精為提取劑，按常規(guī)工藝提取，但以提取的牡蠣糖胺聚糖用于生產(chǎn)保健食品，仍需進(jìn)行毒理安全性評價。因此，根據(jù)毒理學(xué)實驗的選擇要求，我們以近江牡蠣糖胺聚糖粗品為研究對象，對其急性毒性、遺傳毒性實驗進(jìn)行了研究。

上述動物實驗結(jié)果表明，近江牡蠣糖胺聚糖對KM小鼠LD50大于20g/kg（以體質(zhì)量計），且動物活動正常，未發(fā)現(xiàn)不良癥狀，根據(jù)急性毒性劑量（LD50）分級標(biāo)準(zhǔn)，該樣品屬無毒級。根據(jù)對遺傳物質(zhì)作用終點的差別，并兼顧原核細(xì)胞與真核細(xì)胞、體內(nèi)實驗與體外實驗以及體細(xì)胞和生殖細(xì)胞相配套原則，進(jìn)行了3項遺傳毒性實驗，即Ames實驗、小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗、小鼠精子畸變實驗。實驗結(jié)果表明3項遺傳毒性實驗結(jié)果皆為陰性，表明該受試物無致突變作用。本研究對近江牡蠣糖胺聚糖粗品的初步毒理學(xué)評價結(jié)果，為其在保健食品上的安全應(yīng)用提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

近江牡蠣糖胺聚糖粗品經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）大于20.0g/kg，屬于無毒級食品基料；3項遺傳毒性實驗（Ames實驗、骨髓細(xì)胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗）結(jié)果均為陰性，表明其無遺傳毒性、無致突變作用。

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[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S].2003：177-242.

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Toxicological evaluation of glycosaminoglycan from Crassostrea Rivularis

HU Xue-qiong，WU Hong-mian*，F(xiàn)AN Xiu-ping，JIANG Yang
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Objective：The toxicological safety of glycosaminoglycan from Crassostrea Rivularis（CG）as a healthy food material was evaluation.Methods：Acute toxicity test，genetic toxicity test（Ames test，micronucleus test of born marrow in mice，sperm shape abnormality test in mice）were used in this study according to the procedures for toxicological assessment of food.Results：Acute toxicity test showed that the acute oral maximum tolerated doses（MTD）of CG to male and female rats were both more than 20.0g/kg body weight.All results of three genotoxicity tests were negative and no mutagenicity.Conclusion：Glycosaminoglycan from Crassostrea Rivularis（CG）was non-toxic substances based on the acute toxicity grading and non-genetic toxicity based on genotoxicity tests.

Crassostrea Rivularis；glycosaminoglycan；toxicology

R114

A

1002-0306（2014）08-0349-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.071

2013－09－26 *通訊聯(lián)系人

胡雪瓊（1970-），女，大專，高級實驗師，研究方向：農(nóng)海產(chǎn)品深加工。

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項（A201008I02）。