棉酚對(duì)小鼠肝臟SOD GSH-Px和MDA的影響

王海濤，梁　璐，趙樹(shù)臣，侯振中

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

棉酚對(duì)小鼠肝臟SOD GSH-Px和MDA的影響

王海濤，梁璐，趙樹(shù)臣，侯振中

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為了探討不同濃度棉酚對(duì)小鼠體重及肝臟組織抗氧化能力的影響，將32只小鼠隨機(jī)分成4組（對(duì)照組和低中高劑量棉酚組），連續(xù)灌胃20 d后處死并取肝臟稱重計(jì)算臟器指數(shù)，用分光光度法測(cè)定肝臟組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）或活性及丙二醛（MDA）含量。結(jié)果隨著灌胃天數(shù)的增加，對(duì)照組和低劑量組體重呈上升趨勢(shì)，中、高劑量組體重呈下降趨勢(shì)；各劑量組肝臟臟器指數(shù)明顯增加，低、中劑量組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），高劑量組高于對(duì)照組（P＞0.05）。隨著棉酚劑量的增加，中、高劑量組SOD活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），低劑量組和中高劑量組GSH-Px活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），中、高劑量組MDA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），表明口服中、高劑量的棉酚可抑制小鼠體重的增加，降低肝臟的抗氧化能力，使脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致肝臟氧化損傷，使肝臟功能受損。

棉酚；小鼠；體重；肝臟；抗氧化能力

棉酚（GOS）是錦葵科植物棉花的根、莖和種子所含的一種黃色多元酚類有毒化合物［1］。棉酚的毒性主要由活性醛基和活性羥基引起。動(dòng)物攝入棉酚后，棉酚在體內(nèi)各器官中的分布是不均勻的，肝臟含量最多，其次是膽汁、血清和腎，而淋巴結(jié)、脾、心、肺、膈肌和胰中的含量較低［2］。動(dòng)物機(jī)體的酶促抗氧化系統(tǒng)包括：超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）［3］；而機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度及氧自由基的水平用丙二醛（MDA）含量的高低來(lái)表示［4］。

棉酚的毒性作用成為國(guó)內(nèi)外研究人員的研究熱點(diǎn)，但棉酚對(duì)小鼠肝臟的氧化應(yīng)激損傷作用相對(duì)少見(jiàn)，本文主要探討棉酚對(duì)小鼠體增重的影響及肝臟組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響，旨在進(jìn)一步了解棉酚的氧化損傷作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)昆明系小鼠32只，雄性，8周齡，體重20±2 g，購(gòu)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于鼠籠中，適應(yīng)期為一周。在適應(yīng)期和試驗(yàn)階段溫度控制在22℃±2℃，濕度50%±2%，確保室內(nèi)通風(fēng)良好，每天光照12 h，給予自由采食和飲水。

1.1.2試驗(yàn)藥品醋酸棉酚，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度＞97.5%。CMC-Na，分析純，購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，溶于蒸餾水中配成1%CMC-Na溶液。SOD測(cè)試盒，MDA測(cè)試盒，GSH-Px測(cè)試盒，總蛋白定量測(cè)試盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組和給藥飼養(yǎng)一周后將32只小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為對(duì)照組（1% CMC-Na）和低、中、高劑量組（40 mg/kg、80 mg/kg、120 mg/kg體重的GOS），其中對(duì)照組每天按0.01 mL/g 1%CMC-Na灌胃；試驗(yàn)組用1%CMC-Na將棉酚稀釋成4 mg/mL、8 mg/mL和12 mg/mL的棉酚稀釋液，每天按0.01 mL/g給小鼠灌胃20 d。

1.2.2稱重在每天早上7：30至8：30給空腹后的小鼠進(jìn)行稱重。

1.2.3動(dòng)物組織樣品的處理及指標(biāo)檢測(cè)在第21天時(shí)將小鼠斷頸處死，迅速取出小鼠肝臟，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)；冰水浴條件勻漿，2 500 r/min低溫離心10 min，制成10%，5%和0.25%的勻漿。采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測(cè)SOD、GSH-Px活性及MDA和總蛋白含量。

1.3統(tǒng)計(jì)分析用GraphPad Prism 5.0作圖軟件進(jìn)行作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行記錄，多組間差異比較采用One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果用表示。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度的棉酚對(duì)小鼠體重及肝臟臟器指數(shù)的影響

2.1.1不同濃度的棉酚對(duì)小鼠體重影響由圖1可知，隨著灌胃天數(shù)的增加，對(duì)照組和低劑量組體重呈上升趨勢(shì)，中、高劑量組體重呈下降趨勢(shì)；與第0天同組體重相比，給小鼠灌胃6 d后，高劑量組顯著降低（P＜0.05）；給小鼠灌胃14 d后，與第0天同組體重相比，對(duì)照組體重顯著上升（P＜0.05），中、高劑量組顯著低于第0天同組體重（P＜0.05或P＜0.01）；給小鼠灌胃20 d后，對(duì)照組和低劑量組顯著高于第0天同組體重（P＜0.01或P＜0.05），中高劑量組極顯著低于第0天同組體重（P＜0.01）。

圖1　不同濃度的棉酚對(duì)小鼠體重的影響

2.1.2棉酚對(duì)肝臟臟器指數(shù)的影響由圖2可知，給小鼠灌胃20 d后，與對(duì)照組相比，臟器指數(shù)有所增高，但低劑量組差異極顯著（P＜0.01），中劑量組差異顯著（P＜0.05）。高劑量組差異不顯著（P＞0.05）。

圖2　不同濃度的棉酚對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

通過(guò)以上可以說(shuō)明，棉酚可以使小鼠體重降低和肝臟臟器指數(shù)增加。

2.2棉酚對(duì)肝臟組織氧化應(yīng)激有關(guān)酶活性的影響棉酚對(duì)肝臟組織SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響由表1可知，隨著棉酚濃度的增加，SOD、GSH-Px的活力逐漸降低，MDA的含量逐漸升高。中、高劑量組SOD的活力極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組和中、高劑量組GSH-Px活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）；中、高劑量組MDA的含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。與對(duì)照組相比，低劑量組SOD活力降低和MDA含量增加差異不顯著（P＞0.05）。

通過(guò)以上可以說(shuō)明，每天給小鼠灌胃高于80 mg/kg體重的棉酚可以使SOD活力降低、MDA含量增加，每天灌胃高于40 mg/kg體重的棉酚可以使GSH-Px活力降低。

表1　不同濃度的棉酚對(duì)肝臟組織SOD、GSH-Px活性MDA含量的影響

3　討論

有報(bào)道表明，在兔飼料中添加20%棉籽餅，試驗(yàn)兔出現(xiàn)了中毒的癥狀，表現(xiàn)為精神不振、食欲減退、被毛無(wú)光澤、消瘦和糞尿帶血等癥狀［5］。本試驗(yàn)給小鼠棉酚灌胃后，動(dòng)物逐漸出現(xiàn)行動(dòng)緩慢，精神沉郁，并且出現(xiàn)飲食飲水減少。高劑量組體重下降明顯，在灌胃兩周后四肢末端和尾根發(fā)涼，腹部脹氣明顯，出現(xiàn)腹瀉和血便，嘴角發(fā)黑。對(duì)小鼠進(jìn)行剖檢，肺淤血、水腫、肝充血，打開(kāi)腹腔，有難聞的惡臭氣體，腹腔積液，盲腸脹氣明顯，腸道血管充血，這一結(jié)果與上面的報(bào)道有相似性，同時(shí)也與袁彥波等［6］研究基本一致。

體重減輕是慢性中毒的標(biāo)志之一，此試驗(yàn)表明，中、高劑量的棉酚可使小鼠體重迅速下降，說(shuō)明大于80 mg/kg體重濃度的棉酚對(duì)小鼠有毒性作用。臟器指數(shù)是毒理試驗(yàn)中常用的指標(biāo)，臟器指數(shù)增大，表明臟器充血、水腫或增生肥大［7］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然低、中、高劑量組的臟器指數(shù)逐漸降低，但都高于對(duì)照組，分析其原因可能是低劑量組棉酚導(dǎo)致小鼠肝臟代償性肥大，但對(duì)于中、高劑量組來(lái)說(shuō)，隨著灌胃時(shí)間的增加，肝臟組織可能失去代償能力，向萎縮方向發(fā)展。

在細(xì)胞內(nèi)，棉酚可以結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜，同時(shí)棉酚與氨基酸非特異性共價(jià)結(jié)合使棉酚成為普遍的酶抑制劑［8］。SOD在細(xì)胞漿中和線粒體基質(zhì)中起重要的防御作用［9］，SOD是機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化酶促防御系統(tǒng)中的一個(gè)重要酶，能有效清除氧自由基。GSH-Px是一種抗氧化酶，可清除線粒體及胞漿中所產(chǎn)生的H2O2和脂類中的H2O2。而MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物之一，其水平的高低與機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度成正比［10］。de Carvalho W L等人以40 mg/kg體重劑量的棉酚給Wistar大鼠灌胃15 d，造成大鼠肝臟GSH含量減少，GSSG含量增加［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的棉酚引起大鼠繁殖能力降低，而GSH-Px活性和GSSG含量顯著增加，MDA水平增加［12］。本試驗(yàn)表明，隨著棉酚劑量的增加，肝臟中SOD、GSH-Px活性逐漸降低，MDA含量逐漸升高，且呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這說(shuō)明一定劑量的棉酚可以造成肝臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化能力降低，從而導(dǎo)致肝臟氧化損傷。這一結(jié)果與Bender H S等［13］的報(bào)道相一致。然而EI-sharaky A S等［14］通過(guò)給大鼠每天注射低于20 mg/kg體重濃度的棉酚2周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH-Px和SOD活性升高，造成與本試驗(yàn)的不同，主要可能與棉酚的劑量和在體內(nèi)作用的時(shí)間有關(guān)，而此試驗(yàn)造成的SOD、GSH-Px活性下降，可能是棉酚對(duì)兩種酶的直接作用或是SOD、GSH-Px在清除自由基的過(guò)程中導(dǎo)致自身活性的下降，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入探討。

4　結(jié)論

口服80 mg/kg體重以上劑量的棉酚可抑制小鼠體重的增加，降低肝臟的抗氧化能力，引起肝臟氧化應(yīng)激，造成肝臟功能受損。本試驗(yàn)為棉酚引起肝臟氧化損傷提供一定的參考，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］邵仕香，董慶潔，郭星，等.棉酚及其衍生物的醫(yī)藥研究進(jìn)展［J］.天津理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，18（1）：87-92.

［2］王利，汪開(kāi)毓.動(dòng)物棉酚中毒的研究進(jìn)展［J］.畜禽業(yè)，2002，（5）：26-28.

［3］侯楠楠.棉酚對(duì)蛋雞肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝和抗氧化功能的影響［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［4］桑琛，李明學(xué).衰老自由基學(xué)說(shuō)和運(yùn)動(dòng)對(duì)抗自由基損傷的作用［J］.吉林體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（1）：80-81.

［5］劉芳，潘曉亮.棉籽餅和棉籽殼對(duì)育肥羊尿結(jié)石發(fā)病率的影響［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（4）：92-94.

［6］袁彥波，趙樹(shù)臣，侯振中.棉酚對(duì)雄性小鼠的生殖毒性作用［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（7）：83-85.

［7］Dahamna S，Bencheikh F，Harzallah D，et al.Cypermethrin toxic effects on spermatogenesis and male mouse reproductive organs［J］.Commun Agric Appl Biol Sci，2010，75（2）：209-216.

［8］吳高風(fēng).棉酚對(duì)細(xì)毛羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞和精液品質(zhì)影響的研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2010.

［9］趙云罡，徐建興，線粒體.活性氧和細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2001，28（2）：168-171.

［10］李艷飛，趙漢嵩，羅繼龍，等.長(zhǎng)期鋁暴露對(duì)大鼠肝臟功能的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（3）：12-14.

［11］de Carvalho W L，Maioli M A，Mendes L C N，et al.Mechanisms of the intoxication of rat liver caused by gossypol［J］.Pesquisa Veterinria Brasileira，2013，33（3）：339-344.

［12］Santana A T，Guelfi M，Medeiros H C，et al.Mechanisms involved in reproductive damage caused by gossypol in rats and protective effects of vitamin E［J］.Biological Research，2015，48（1）：1-8.

［13］Bender H S，Derolf S Z，Misra H P.effects of Gossypol on the Antioxidant Defense System of the Rat Testis［J］.Systems Biology in Reproductive Medicine，1988，21（1）：59-70.

［14］El-Sharaky A S，Newairy A A，Elguindy N M，et al.Spermatotoxicity，biochemical changes and histological alteration induced by gossypol in testicular and hepatic tissues of male rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48（12）：3354-3361.

S859.82

B

0529-6005（2016）09-0096-03

2016-03-16

王海濤（1990-），男，碩士生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)，E-mail：haitao19901008@163.com

趙樹(shù)臣，E-mail：zscrichard@163.com；侯振中，E-mail：houzz_1963@163.com