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    長(zhǎng)裂苦苣菜萃取物對(duì)胰島素抵抗 HepG2細(xì)胞糖代謝的影響*

    2016-11-14 06:12:00楊艷華林素靜劉西京
    關(guān)鍵詞:苦苣消耗量培養(yǎng)液

    楊艷華,林素靜,劉西京,杜 斌

    (1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,廣東 深圳 518055)

    長(zhǎng)裂苦苣菜萃取物對(duì)胰島素抵抗 HepG2
    細(xì)胞糖代謝的影響*

    楊艷華1,2,林素靜2*,劉西京2,杜 斌1

    (1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,廣東 深圳 518055)

    使用高濃度胰島素來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞,使之出現(xiàn)葡萄糖代謝的異常,以此建造胰島素抵抗HepG2/IR細(xì)胞模型,利用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)長(zhǎng)裂苦苣菜石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位組葡萄糖消耗量,研究長(zhǎng)裂苦苣菜不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型糖代謝的影響.結(jié)果顯示,10-6mol/L濃度的胰島素誘導(dǎo)處理HepG2細(xì)胞24 h是產(chǎn)生胰島素抵抗的最佳條件;與HepG2/IR模型組相比,各萃取部位均可以改善HepG2/IR細(xì)胞的葡萄糖消耗情況,以乙酸乙酯部位效果最佳.結(jié)果表明長(zhǎng)裂苦苣菜提取物有一定的改善胰島素抵抗的作用.

    長(zhǎng)裂苦苣菜;胰島素抵抗;HepG2細(xì)胞;葡萄糖消耗量

    糖尿?。╠iabetes mellitus,DM)患者中超過90%為Ⅱ型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus, T2DM),其顯著的病理生理學(xué)特征為胰島素調(diào)節(jié)與控制葡萄糖代謝能力的下降,即胰島素抵抗(Insulin Resistance, IR)[1].HepG2 細(xì)胞存在于動(dòng)物肝細(xì)胞,其肝胚胎瘤細(xì)胞株的表型與肝細(xì)胞很相似,HepG2 細(xì)胞中的胰島素受體數(shù)目在高劑量的胰島素條件下呈下降趨勢(shì),且下降程度與刺激持續(xù)時(shí)間及胰島素劑量呈正相關(guān).因此,以HepG2細(xì)胞模型來研究體外胰島素抵抗機(jī)制和降糖活性物質(zhì)篩選是理想d的選擇[2-3].

    長(zhǎng)裂苦苣菜( Sonchus brachyotus DC.)又名苦菜、苦曲菜、苦曲曲、苦苣菜、苣荬菜、苦荬菜等,具有清熱解毒、涼血止血之功,常用于治療急性咽炎、急性痢疾、闌尾炎、腸炎、痔瘡腫痛等[4-6].研究表明,長(zhǎng)裂苦苣菜具有降糖、抗菌、降壓和降膽固醇、抗心律失常、抗腫瘤、保肝、抗炎、清除自由基等作用[4-8].本文以人肝癌細(xì)胞HepG2建立胰島素抵抗模型,探究長(zhǎng)裂苦苣菜不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗 HepG2 細(xì)胞糖代謝的影響.

    1 材 料

    1.1 藥品與試劑

    長(zhǎng)裂苦苣菜( Sonchus brachyotus DC.)采自蘭州郊區(qū); DMEM高糖培養(yǎng)基(Corning公司);胰酶、四氮甲唑藍(lán)(MTT)、胎牛血清(Gibco公司);二甲基亞砜(DMSO)、乙醇(分析純)、鹽酸二甲雙胍(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):S16O5G1);精蛋白生物合成人胰島素注射液(規(guī)格400IU/10mL/支,諾和諾德中國制藥有限公司,批號(hào):EVG2553);葡萄糖測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS),D-Hank’s溶液.

    1.2 儀器

    DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司);Milli-Q超純水機(jī)(Milipore);4001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph);HERA cell 240 型CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo);DM IRB 型熒光倒置顯微鏡(德國Leica );BHC-ⅡA2系列生物安全柜(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司); 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);SS-325高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械有限公司);Multiskan MK3 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo);BS224s電子天平(德國賽多利斯);可調(diào)式移液器(Eppendorf);細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司).

    1.3 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

    人肝癌細(xì)胞株HepG2,由深圳市大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞資源庫技術(shù)平臺(tái)王妍教授饋贈(zèng).將HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),溫度設(shè)定37℃,培養(yǎng)基放置在5% CO2培養(yǎng)箱中.傳代間隔為2~3天1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

    2 方 法

    2.1 樣品制備與溶液配制

    2.1.1 樣品制備

    取長(zhǎng)裂苦苣菜全草粉碎,過10目篩(2.0 mm),稱取60g,70%乙醇回流提取3次,每次1h,合并濾液,減壓回收溶劑,所得浸膏加蒸餾水溶解混懸,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,隨后減壓回收各有機(jī)溶劑,并于60℃烘干,即得不同提取部位,得率分別是0.45%、1.12%和3.25%.精密稱量,用完全培養(yǎng)液分別配成0.001、0.01、0.1、0.25 mg/mL備用.

    2.1.2 配制完全培養(yǎng)液

    取胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)液按照1: 9比例配置完全培養(yǎng)液.

    2.2 胰島素濃度對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型的影響考察

    使用完全培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞進(jìn)行稀釋,設(shè)定細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,將其接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),單孔200 μL,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中.當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)瓶底80%時(shí),棄上清液,以D-Hank’s液清洗2次,加入新鮮調(diào)配的含10-6,10-7,10-8,10-9mol/L胰島素的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,每孔200 μL,一組3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)正常培養(yǎng)細(xì)胞的平行對(duì)照組.培養(yǎng)時(shí)間24h,取各組的細(xì)胞上清液,以葡萄糖氧化酶法依次測(cè)定各組的葡萄糖含量,同時(shí)觀察記錄細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化.

    2.3 胰島素抵抗細(xì)胞模型時(shí)間影響考察

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,同2.2項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞,加入10-6mol/L的胰島素后,各組于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8、12、24、36和48 h,取各組的細(xì)胞上清液,用葡萄糖氧化酶法依次測(cè)定每組的葡萄糖含量,同時(shí)觀察記錄細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化.

    通過上述試驗(yàn)選取最優(yōu)的胰島素作用時(shí)間和胰島素濃度,建立適宜的HepG2 胰島素抵抗細(xì)胞模型.

    2.4 不同濃度各萃取物對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗的影響

    根據(jù)上述考察參數(shù)建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型,設(shè)置二甲雙胍濃度梯度組、胰島素抵抗模型組、正常對(duì)照組和萃取部位石油醚、乙酸乙酯、正丁醇濃度梯度組,其中空白組不接種細(xì)胞,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔.正常對(duì)照組每孔各加完全培養(yǎng)液200μL,胰島素抵抗模型組加10-6mol/L胰島素的完全培養(yǎng)液200 μL/孔,其余給藥組每孔分別加入不同濃度溶液200 μL,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24h后取各組上清培養(yǎng)液,以葡萄糖氧化酶法測(cè)定其葡萄糖含量.隨后移出上清培養(yǎng)液,每孔加入180 μL完全培養(yǎng)液和20 μL 0.5% MTT,培養(yǎng)4h,將培養(yǎng)液吸棄,每孔加入150 μL DMSO,震搖10 min,于490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)OD值.

    2.5 計(jì)算

    葡萄糖消耗量(mmol/L)=對(duì)照組葡萄糖含量-給藥組葡萄糖含量.

    2.6 統(tǒng)計(jì)分析

    3 結(jié) 果

    3.1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,可見隨著胰島素濃度的增大,葡萄糖消耗率越來越大,但當(dāng)濃度達(dá)到10-6mol/L時(shí),葡萄糖消耗率突然下降,幾乎與正常對(duì)照組一致,說明在較低濃度范圍時(shí),胰島素對(duì)葡萄糖的消耗具有一定的促進(jìn)作用,當(dāng)達(dá)到一定量時(shí),導(dǎo)致了胰島素抵抗,細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗急劇降低.當(dāng)胰島素濃度在10-6mol/L時(shí),胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗程度達(dá)到最大.倒置顯微鏡下觀察,正常組HepG2細(xì)胞為菱形或梭形的貼壁細(xì)胞,與典型的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征相似,10-6mol/L濃度模型組細(xì)胞邊緣變成稍圓形,說明高濃度胰島素對(duì)HepG2的活性有一定的抑制作用.

    3.2 胰島素作用不同時(shí)間對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

    加入10-6mol/L的胰島素完全培養(yǎng)液,分別作用8、12、24、36、48h,測(cè)得細(xì)胞葡萄糖消耗情況見表2.根據(jù)結(jié)果可知,在最初達(dá)到12h時(shí),胰島素對(duì)HepG2的葡萄糖消耗率達(dá)到了最大,為41.58%,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄糖消耗率逐漸降低,在24、36、48h分別為20.29%、17.33%、8.98%,說明在24h小時(shí)已開始出現(xiàn)胰島素抵抗,故本實(shí)驗(yàn)建立胰島素抵抗模型中最佳胰島素濃度為10-6mol/L,最佳作用時(shí)間為24h.

    3.3 不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測(cè)結(jié)果

    由結(jié)果可知,正常組(p<0.05)單位細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯高于模型組,說明胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型建立成功.另一方面,MTT檢測(cè)的OD值卻顯著降低(p<0.05),說明高濃度的胰島素對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性,這也可能是導(dǎo)致模型組葡萄糖消耗量下降的原因之一.與HepG2/IR 模型組相比較,二甲雙胍不同濃度作用于模型細(xì)胞后,模型細(xì)胞的葡萄糖消耗量均有不同程度增加,其中葡萄糖消耗量最多的是0.25和0.1 mg/ml濃度組,但由于模型組的OD值(p<0.05)明顯高于0.25 mg/ml濃度組的OD值,說明此濃度下二甲雙胍的細(xì)胞毒性較強(qiáng),這也可能是二甲雙胍在高濃度時(shí)對(duì)葡萄糖的消耗量反而降低的緣故.

    不同濃度石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位作用于模型細(xì)胞后,均不同程度地改善了模型細(xì)胞的胰島素消耗量.尤以較高的濃度組0.1、0.25mg/ml對(duì)葡萄糖的消耗具有較顯著的作用(分別為p < 0.01和 p < 0.05).

    3組隨著濃度的增加,OD值也隨之增加,表明3個(gè)不同萃取部位對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用,抵消了胰島素對(duì)細(xì)胞的毒性作用,同時(shí)三組的對(duì)葡萄糖的消耗也隨之增加,這也可能是長(zhǎng)裂苣荬菜改善胰島素抵抗的機(jī)制之一.從整體葡萄糖消耗量分析可見,模型細(xì)胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明顯,說明乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗效果最佳.結(jié)果見表3.

    表1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(±S ,n=5)

    表1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(±S ,n=5)

    胰島素濃度/(mol·L-1)葡萄糖含量/(mmol·L-1)葡萄糖消耗率/(%)0 6.407±0.267 -10-95.770±0.256 9.94 10-85.513±0.286 13.95 10-75.566±0.270 13.12 10-66.589±0.247 -

    表2 胰島素作用不同時(shí)間對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(±S,n=5)

    表2 胰島素作用不同時(shí)間對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(±S,n=5)

    時(shí)間/h正常組葡萄糖含量/(mmol·L-1)胰島素組葡萄糖含量/(mmol·L-1)葡萄糖消耗率/(%)8 3.534±0.0778 2.748±0.0769 22.24 12 2.109±0.386 1.232±0.463 41.58 24 7.224±0.207 5.758±0.214 20.29 36 9.450±0.178 7.812±0.464 17.33 48 10.340±0.371 9.411±0.447 8.98

    表3 不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測(cè)結(jié)果(±S,n=5)

    表3 不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測(cè)結(jié)果(±S,n=5)

    注:與正常組對(duì)比:#p < 0.05,##p < 0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比:* p < 0.05,** p < 0.01

    組別 葡萄糖消耗量/(mmol·L-1) OD值正常對(duì)照組 3.833±0.077 0.586±0.063 HepG2/IR 模型組 3.079±0.052#0.501±0.030#0.25 3.842±0.144** 0.459±0.026*二甲雙胍組(mg/mL)0.10 4.310±0.085** 0.608±0.063** 0.01 3.596±0.264* 0.594±0.072* 0.001 3.436±0.184* 0.570±0.109 0.25 3.496±0.225* 0.598±0.074*石油醚部位(mg/mL)0.10 3.783±0.074** 0.636±0.095* 0.01 3.256±0.136 0.424±0.086* 0.001 3.131±0.036 0.308±0.091* 0.25 4.254±0.078 ** 0.692±0.061 **乙酸乙酯( mg/mL)0.10 3.953±0. 055** 0. 587±0.067* 0.01 3.367±0.137* 0.454±0.023* 0.001 3.498±0.197* 0.346±0.076* 0.25 3.996±0.043** 0.643±0.038**正丁醇部位(mg/mL)0.10 3.461±0.180* 0.593±0.065* 0.01 3.348±0.132* 0.466±0.014* 0.001 3.197±0.089* 0.423±0.047*

    4 討 論

    胰島素抵抗參與了Ⅱ型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展的全過程,是T2DM的重要機(jī)制之一[9].因此,從胰島素抵抗的防治著手尋找抗糖尿病的新藥是一個(gè)重要的方向.肝臟及周圍組織是胰島素作用的靶器官,HepG2 細(xì)胞在高濃度胰島素作用下,HepG2 細(xì)胞表面胰島素受體數(shù)目下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)[2-3].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以10-6mol/L的胰島素誘導(dǎo)的模型效果較佳,在培養(yǎng)24h后細(xì)胞對(duì)胰島素的攝取顯著降低,說明了模型的成功.

    實(shí)驗(yàn)表明,各萃取部位對(duì)模型細(xì)胞的胰島素抵抗敏感度各異,模型細(xì)胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明顯,表明乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗效果最佳.從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可推測(cè):有效范圍內(nèi)的高濃度萃取物對(duì)胰島素抵抗模型細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用,保護(hù)和增強(qiáng)細(xì)胞的生命狀態(tài)免受損傷,以此促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗;而低濃度的萃取物則是增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性,來改善胰島素抵抗?fàn)顩r,但這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明.

    根據(jù)試驗(yàn)情況,石油醚萃取部位主要含大量的葉綠素、脂肪烴和少量萜等極性較小的化合物;乙酸乙酯主要含倍半萜類、三萜類、黃酮類等化合物;正丁醇部位主要是苷類化合物,其中活性以乙酸乙酯和正丁醇部位相對(duì)較好.從各萃取部位的收率上來說,石油醚部位也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它2個(gè)部位,不是長(zhǎng)裂苦苣菜的主要活性部位.可見,長(zhǎng)裂苦苣菜萃取部位中改善胰島素抵抗效果最佳的是乙酸乙酯部位,為長(zhǎng)裂苦苣菜在抗糖尿病領(lǐng)域中的應(yīng)用研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

    [1] 陸菊明.中國2型糖尿病防治指南(2013年版)更新要點(diǎn)的解讀[J].中國糖尿病雜志,2014,22(10):2-42.

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    [9] Samuel V T, Shulman G I. Mechanisms for insulin resistance: common threads and missing link[J]. Cell, 2012,148(5):852-871.

    電子與通信學(xué)院學(xué)子勇奪“華為網(wǎng)院杯”

    2015全國大學(xué)生ICT技能大賽桂冠

    2015年12月6日“華為網(wǎng)院杯”2015全國大學(xué)生ICT技能大賽決賽在深圳圓滿閉幕,我校電信學(xué)院學(xué)生吳惠民與林曉東勇奪桂冠,王隆杰老師獲得優(yōu)秀指導(dǎo)教師獎(jiǎng)。本次大賽由華為技術(shù)有限公司舉辦,來自全國29個(gè)省市400多所院校、近5000名在校大學(xué)生參加。本次大賽取得的成績(jī)不僅表現(xiàn)了我院學(xué)生良好的技能水平和職業(yè)素養(yǎng),更體現(xiàn)出我院貫徹“三育人”教育理念取得了實(shí)際成果。

    (深職院 電子與通信工程學(xué)院)

    Effect of Bioactive Components from Sonchus Brachyotus D C. on Glucose Metabolism in Insulin Resistant HepG2 Cells

    YANG Yanhua1,2, LlN Sujing2*, LlU Xijing2, DU Bin1

    (1.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450001, China;
    2. School of Applied Chemistry & Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055, China)

    The purpose of the present paper is to study the different extraction parts from Sonchus brachyotus D C. on glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells. The model of insulin resistance in HepG2 cells induced high concentrations of insulin. Glucose consumption is tested on petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol extraction. Concentration of 10-6mol/L insulin is found to be the best condition for HepG2 cells 24 h to generate insulin resistance. Compared with model group Hepg2/IR, the Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can reduce the HepG2 / IR glucose consumption. It works especially well on the ethyl acetate extract. The results show that Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can improve the effect of insulin resistance.

    Sonchus brachyotus D C.; insulin resistance; HepG2 cell; glucose consumption

    R285

    A

    1672-0318(2016)01-0045-05

    10.13899/j.cnki.szptxb.2016.01.010

    2015-06-18

    *項(xiàng)目來源:深圳市大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞資源庫公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)(合同號(hào):GGJS20130331152344401)、深圳市科創(chuàng)委2015年基礎(chǔ)研究(JCYJ2015 0630 1141 40632)、深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年創(chuàng)新基金(2011年)資助項(xiàng)目

    楊艷華(1988-),女,河南人,在讀碩士,研究方向:天然藥用植物的提取分離與純化.

    *通訊作者:林素靜(1977-),女,海南人,碩士,副教授,主要研究方向:中藥質(zhì)量控制研究、藥物制劑.

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