青香蕉淀粉對乳酸菌在凍干和貯存過程中活性的保護效果

周中凱，王俊軒，李 瑩

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

青香蕉淀粉對乳酸菌在凍干和貯存過程中活性的保護效果

周中凱，王俊軒，李 瑩

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

研究青香蕉淀粉對冷凍干燥過程中乳酸菌活性的保護作用和對乳酸菌耐酸耐膽鹽性、菌粉貯藏穩(wěn)定性的影響以及與乳酸菌的協(xié)同抗氧化作用，旨在為香蕉的加工與開發(fā)以及益生菌保護技術(shù)提供思路與理論依據(jù)。青香蕉淀粉富含2型抗性淀粉，結(jié)果表明，青香蕉淀粉能與乳酸菌協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率達到63.62%，高于兩者各自抗氧化作用之和；乳酸菌可以附著于該淀粉顆粒的表面，并且可以將其作為底物緩慢利用；青香蕉淀粉可以顯著提高乳酸菌在冷凍干燥過程中的存活率，其值達到73.17%，保護效果優(yōu)于單獨使用甘油和海藻糖；添加了青香蕉淀粉還展現(xiàn)出提高乳酸菌耐酸和耐膽鹽的能力，加強其合生元產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

益生活性；青香蕉淀粉；乳酸菌；冷凍干燥；保護作用

周中凱， 王俊軒， 李瑩. 青香蕉淀粉對乳酸菌在凍干和貯存過程中活性的保護效果［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 144-148.

ZHOU Zhongkai， WANG Junxuan， LI Ying. Protective effect of unripe banana starch on viability of Lactobacillus plantarum during freeze-drying and storage［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 144-148. （in Chinese with English abstract）

益生菌類食品的流行與其消費需求的不斷增長帶動了益生菌保護技術(shù)的發(fā)展，為使益生菌能起到較好的益生作用，一般要求產(chǎn)品在到期之前其活菌數(shù)仍能達到105～107CFU/mL或CFU/g［1］。然而一些研究者發(fā)現(xiàn)，很多益生菌產(chǎn)品中的活菌數(shù)并不能夠達到標簽上所標明的活菌數(shù)［2］。因此，保持益生菌在加工、貯藏過程中的活性以及到達腸道時的活性就顯得尤為重要。

通過低溫或冷凍可以相對地提高益生菌的存活率，然而冷凍貯藏需要使溫度維持在-20～-40 ℃，造成很高的貯藏及運輸成本，因此通過干燥的手段移走水分是目前保藏益生菌較為常用的方式，但干燥過程中的脫水現(xiàn)象會造成益生菌的活力變?nèi)酰?］。脫水產(chǎn)生的細胞間的壓力直接作用在細胞質(zhì)膜上，改變了膜的流動性以及其他物理性質(zhì)，膜的脫水還會激發(fā)脂質(zhì)過氧化反應［4］。近年來有報道指出某些種類的碳水化合物表現(xiàn)出很好的保護細胞膜在冷凍和干燥過程中降低損傷的潛力［5-7］。

青香蕉中抗性淀粉的含量很高，利用香蕉中豐富的淀粉資源，研究開發(fā)高抗性淀粉產(chǎn)品，可緩解香蕉采后貯運、銷售環(huán)節(jié)壓力，提升香蕉的高層次應用和香蕉產(chǎn)業(yè)鏈的綜合競爭能力［8］。香蕉中的抗性淀粉可以不被胃和小腸消化而到達大腸，本身就對人類健康具有重要的生理功能，如預防結(jié)腸癌、調(diào)節(jié)血糖濃度、降低膽固醇、抑制脂肪堆積、增加礦物質(zhì)的攝入、刺激益生菌的生長等功能［9］?？剐缘矸劭梢耘c乳酸菌相輔相成，共同發(fā)揮作用，組成的合生元在人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)及預防和輔助治療疾病的功效。然而，對于抗性淀粉作為保護劑對于乳酸菌在凍干和貯存過程中的活性和穩(wěn)定性，卻很少被研究。本實驗研究了青香蕉淀粉對冷凍干燥過程中乳酸菌活性的保護作用，及其對于乳酸菌耐酸耐膽鹽性、菌粉貯藏穩(wěn)定性和與乳酸菌的協(xié)同抗氧化性的影響，旨在為香蕉資源的開發(fā)利用及益生菌保護技術(shù)開拓思路和提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與菌株

青香蕉 塘沽金元寶水果批發(fā)市場。

乳酸菌：植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，酸奶中分離純化得到，由天津科技大學糧油科學與營養(yǎng)實驗室提供。

1.2儀器與設備

JYL-C051料理機 九陽股份有限公司；DGG-100-2S電熱鼓風干燥箱 天津天宇實驗儀器有限公司；XW-80A漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；ALPHA 1-2 LD plus真空冷凍干燥機 德國Christ公司；Quanta 250環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3方法

1.3.1青香蕉淀粉的制備

采用張雅媛等［10］的方法并做修改，將未成熟的青香蕉剝皮并切成小片，立即放入0.5 g/100 mL亞硫酸氫鈉溶液中護色，浸泡10 min后一同倒入九陽料理機中打漿，漿液依次通過60 目和100 目篩網(wǎng)，水洗離心（4 000 r/min，10 min），得到淀粉漿，加入0.5 g/100 mL NaOH溶液以除去可溶性纖維，反復水洗至呈中性，離心（4 000 r/min，10 min）后，置于50 ℃電熱鼓風干燥箱烘干，粉碎后過100 目篩得到青香蕉淀粉。

1.3.2乳酸菌的培養(yǎng)與菌懸液制備［11］

將植物乳桿菌Lactobacillus菌種活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，以4 ℃、10 000 r/min離心15 min得到菌體，用pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次后重新懸浮于PBS中，調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL（以N0表示）。

1.3.3協(xié)同抗氧化性測定

將1 mL待測菌懸液、0.1 g青香蕉淀粉以及二者混合物分別加入到裝有1 mL 0.2 mmol/L （無水乙醇配制）1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液試管中，搖勻后于室溫下避光放置30 min，離心后測定上清液在517 nm波長處的吸光度，用等體積PBS緩沖液代替樣品為空白對照，按公式（1）計算樣品對DPPH自由基的清除率［12］。每次實驗重復3 次并取平均值。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為實驗組的吸光度。

1.3.4淀粉-益生菌合生元的制備

采用Chotiko等［13］的方法并進行改進，將5 g青香蕉淀粉加入到50 mL制備好的菌懸液中，用漩渦混合儀混合均勻，在振蕩器中室溫緩慢振蕩2 h后進行預凍（-20 ℃，24 h），預凍好的樣品用真空冷凍干燥機進行凍干處理，研碎得到合生元粉。

1.3.5掃描電子顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)

采用環(huán)境掃描電子顯微鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM）進行淀粉顆粒外形觀察。將各個樣品均勻分散在帶有固定膠的圓形托盤上，然后置于電子顯微鏡下進行觀察、拍照［14］。

1.3.6青香蕉淀粉對乳酸菌凍干過程中活性的影響

對Jagannath等［15］的方法稍作修改進行活菌數(shù)的測定：凍干前菌液濃度為109CFU/mL（N0），冷凍干燥后，合生元粉恢復到室溫，用無菌PBS緩沖液溶解并恢復到凍干前的體積，并繼續(xù)用無菌PBS緩沖液進行梯度稀釋，用含有0.75 g/100 mL碳酸鈣的培養(yǎng)基進行澆注培養(yǎng)48 h后，平板計數(shù)，計算出等體積復原后的菌液濃度（N1），每次實驗重復3 次并取平均值。以不加青香蕉淀粉直接凍干的菌粉和分別添加海藻糖、甘油作為保護劑凍干的菌粉作為對照，用公式（2）計算乳酸菌的存活率。

1.3.7合生元產(chǎn)品貯藏期穩(wěn)定性實驗

干燥的合生元粉真空包裝并密封進行常溫保存，分別于第2周和第4周測定其剩余活菌數(shù)，每一階段樣品乳酸菌存活率通過計算貯存前后活菌數(shù)比值表示。

1.3.8青香蕉淀粉對乳酸菌耐酸、耐膽鹽性影響

調(diào)整乳酸菌菌懸液濃度為7.32×108CFU/mL，與等體積復原后的合生元溶液菌濃保持一致。對Cebeci等［16］的方法稍作修改進行耐酸水平測定：將復原后的合生元溶液和菌懸液分別取1 mL加入到9 mL無菌酸化的MRS液體培養(yǎng)基中（pH 2.0），培養(yǎng)2 h后取出，活菌數(shù)通過MRS瓊脂培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，計算出菌液濃度；對于耐膽鹽性，將復原后的合生元溶液和原菌液分別取1 mL加入9 mL含有1 g/100 mL牛膽粉的液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)通過MRS瓊脂培養(yǎng)基平板計數(shù)，計算出菌液濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1青香蕉淀粉-乳酸菌協(xié)同抗氧化性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，可溶解于乙醇，其溶液呈紫色，在517 nm波長處有強吸收。將自由基清除劑加入DPPH溶液中后吸收會減弱或消失，通過這種變化可以檢測和評價某種物質(zhì)的抗氧化能力［17］。在反應體系中分別加入乳酸菌菌體、青香蕉淀粉及二者混合物，測定三者對DPPH自由基的清除效果從而確定其抗氧化能力，結(jié)果如表1所示。

表1　乳酸菌、抗性淀粉及其混合物對DPPH自由基的清除能力TTaabbllee 11 DDPPPPHH ffrreeee rraaddiiccaall ssccaavveennggiinngg aaccttiivviittyy ooff llaaccttiicc aacciidd bbaacctteerriiaa，resistant starch and their mixture

表1　乳酸菌、抗性淀粉及其混合物對DPPH自由基的清除能力TTaabbllee 11 DDPPPPHH ffrreeee rraaddiiccaall ssccaavveennggiinngg aaccttiivviittyy ooff llaaccttiicc aacciidd bbaacctteerriiaa，resistant starch and their mixture

種類乳酸菌青香蕉淀粉乳酸菌+青香蕉淀粉DPPH自由基清除率/%16.10±0.1843.66±0.4263.62±0.58

由表1可知，乳酸菌和青香蕉本身都表現(xiàn)出一定的清除DPPH自由基能力，分別達到16.10%和43.66%，將相同量的乳酸菌液和青香蕉淀粉混合均勻后緩慢振蕩作用2 h，將得到的混合物加入到DPPH乙醇溶液反應后，測定DPPH自由基清除率達到了63.62%，高于乳酸菌和青香蕉淀粉各自的抗氧化能力，并且還略高于二者單獨作用的DPPH自由基清除率之和，這說明乳酸菌和抗性淀粉不僅不會互相影響各自的抗氧化能力，可能還具有協(xié)同抗氧化的作用。

2.2ESEM觀察乳酸菌和抗性淀粉的交互作用

圖1　青香蕉淀粉（A）、淀粉-乳酸菌復合物凍干粉（BB）ESEM圖（×5 000000）Fig. 1 Environmental scanning electron micrographs of unripe banana starch （A） and freeze-dried lactic acid bacteria adhered on unripe banana starch （B） （×5 000）

青香蕉淀粉與乳酸菌作用前后掃描電子顯微鏡結(jié)果如圖1所示，青香蕉淀粉顆粒多為扁平狀，表面光滑，和乳酸菌作用后，乳酸菌可以附著于淀粉的表面，形成物理屏障，這與其他研究者觀察到益生菌與纖維附著方式相類似［18-19］，這可能是淀粉能起到保護作用的原因之一。除此之外，還可以觀察到部分淀粉表面出現(xiàn)一些輕微侵蝕，這表明抗性淀粉可以作為底物被乳酸菌利用且利用速率緩慢，抗性淀粉既可為乳酸菌生存生長提供營養(yǎng)源，又不會被過快利用使代謝產(chǎn)物過多積累，有利于延長凍干合生元粉的貯藏時間。淀粉結(jié)構(gòu)基本保持完整，有利于抗性淀粉進入體內(nèi)后益生功能的發(fā)揮［20］。

2.3青香蕉淀粉對乳酸菌凍干存活率的影響

圖2　添加不同保護劑的乳酸菌凍干后存活率（n==33）Fig. 2 Effect of protectants on survival rate of lactic acid bacteria after freeze drying （n = 3）

分別測定凍干過程中乳酸菌本身及其分別添加青香蕉淀粉、甘油和海藻糖作為保護劑的復合物中乳酸菌的存活率，其結(jié)果如圖2所示。不添加保護劑直接將菌體凍干后，乳酸菌的活菌數(shù)嚴重下降，存活率僅有3.15%，添加不同保護劑后，與裸菌相比，復合物中乳酸菌存活率均顯著提高（P＜0.05）。添加甘油后乳酸菌存活率提高到8.85%，添加海藻糖存活率提高到29.30%，添加青香蕉淀粉后乳酸菌存活率提高最為顯著，提高到73.17%，青香蕉淀粉對乳酸菌在冷凍干燥過程中的保護作用最佳，優(yōu)于海藻糖和甘油做保護劑的效果。結(jié)合電子顯微鏡觀察的結(jié)果，由于青香蕉淀粉起到了較好的物理屏障的功能，從而降低了乳酸菌細胞在凍干過程受到的損傷，使得存活率提高。

2.4青香蕉淀粉對乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的影響

乳酸菌本身以及與合生元粉的耐酸耐膽鹽性測定結(jié)果見圖3。耐酸耐膽鹽是乳酸菌作為食補因子的重要指標之一［21］。胃酸和膽鹽具有抗菌作用，益生乳酸菌隨著食物進入口腔，經(jīng)過胃和小腸，最終到達小腸末端。通常人體胃液pH值為3左右，空腹和食用酸性食品pH值可達2，食物通過胃的時間一般是1～2 h［22］，通過胃液后存活的菌株將在小腸的上部遇到膽鹽，故對膽鹽具有抗性是它能夠在腸道中生長、存活、發(fā)揮功效的另一個重要指標。

圖3　青香蕉淀粉對乳酸菌耐酸性（A）和耐膽鹽性（B）的影響（n=3）=3Fig. 3 Effect of unripe banana starch on acid tolerant （A） and bile-salt tolerant capacity （B） of lactic acid bacteria （n = 3）

由圖3可知，乳酸菌在pH 2的環(huán)境中培養(yǎng)2 h后，活菌數(shù)由開始的7.32×108CFU/mL下降到3.41×107CFU/mL，存活率僅為4.6 5%，合生元粉溶液則從開始的7.32×108CFU/mL下降到1.06×108CFU/mL，存活率提高到了14.42%；在耐膽鹽測試中，乳酸菌存活率由18.17%提高到23.47%。綜上可以看出，青香蕉淀粉作為保護劑，與乳酸菌復合后有利于提高乳酸菌在酸性環(huán)境中和膽鹽環(huán)境中的存活率，對耐酸性提高更為明顯。有研究表明，凍干過程會使細胞質(zhì)膜受到損傷，從而對酸性和膽鹽環(huán)境變得敏感，胞內(nèi)水分向外滲透，導致細胞受損［23］，而添加青香蕉淀粉提高了乳酸菌對于酸性和膽鹽環(huán)境的耐受力，可能是由于淀粉降低了凍干過程對乳酸菌細胞質(zhì)膜的損傷，此外，淀粉可以與酸及膽鹽作用［24］，降低環(huán)境濃度，這也是潛在機理之一，其具體保護機制還有待進一步研究。

2.5青香蕉淀粉對凍干菌粉貯藏穩(wěn)定性作用

經(jīng)過1 個月的常溫貯藏后，直接凍干的菌粉活菌數(shù)剩余4.35×107CFU/g，而合生元中剩余的活菌數(shù)仍然能達到7.32×108CFU/g。由圖4可知，合生元體系中由于有青香蕉淀粉的保護作用，活菌數(shù)的下降速率比直接凍干的菌粉更為緩慢，提高了乳酸菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性。研究顯示［25］，菌粉存活率的下降與水分含量的上升具有一致性，青香蕉淀粉的存在可以穩(wěn)定水分含量，提高耐貯藏性。在本研究中貯藏1 個月后剩余的活菌數(shù)遠高于發(fā)揮乳酸菌益生作用所要求的106CFU/g，體現(xiàn)出很好的應用潛力。

圖4　青香蕉淀粉對乳酸菌貯藏穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of unripe banana starch on the storage stability of lactic acid bacteria

3　結(jié) 論

通過實驗結(jié)果可以看出，青香蕉淀粉對乳酸菌在冷凍干燥過程中起到很好的保護作用，效果優(yōu)于海藻糖和甘油的添加，并且能顯著提高凍干乳酸菌粉在貯藏期間的穩(wěn)定性，可以作為益生菌的凍干保護劑。此外，青香蕉淀粉展現(xiàn)出自身的益生元特性，不僅可以和乳酸菌起到協(xié)同抗氧化作用，還有助于加強乳酸菌的耐酸性和耐膽鹽性，提高其在胃腸道的存活率，從而更好的發(fā)揮體內(nèi)益生特性。

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Protective Effect of Unripe Banana Starch on Viability of Lactobacillus plantarum during Freeze-Drying and Storage

ZHOU Zhongkai， WANG Junxuan， LI Ying
（College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

This research investigated unripe banana starch as a protectant for Lactobacillus plantarum during the freeze drying process and its effect on acid and bile salt tolerance and storage stability of the lactic acid bacterium， as well as their synergistic antioxidant effect aiming to provide an idea and theoretical foundation for deep processing， development and probiotic bacterial protection of banana. Unripe banana starch from low maturity banana contained higher level of type 2 resistant starch. The experimental results indicated that unripe banana starch had synergistic antioxidant effect with Lactobacillus plantarum in scavenging 63.62% of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radicals， which was higher than the sum of their individual effects. The lactic acid bacterium could attach to the surface of the starch granules to use it slowly as a nutrient source. Meanwhile， unripe banana starch could significantly increase survival rate （up to 73.17%）of Lactobacillus plantarum during freeze drying， and its protective effect was better than that of glycerol and mycose，respectively. This study also suggests the potential of unripe banana starch to increase the tolerance of Lactobacillus plantarum to acid and bile salt， and enhance of the stability of synbiotic products.

probiotic viability； unripe banana starch； lactic acid bacteria； freeze-drying； protective effect

10.7506/spkx1002-6630-201615024

TS231

A

1002-6630（2016）15-0144-05

10.7506/spkx1002-6630-201615024. http://www.spkx.net.cn

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2015-09-20

國家自然科學基金面上項目（31471701）

周中凱（1964—），男，教授，博士，研究方向為谷物科學與營養(yǎng)。E-mail：zkzhou@tust.edu.cn

引文格式：