酵母源金屬硫蛋白對(duì)慢性汞中毒小鼠氧化損傷的修復(fù)作用

王 穎，王欣卉，徐炳政，張東杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有 限公司，山東 青島 266400）

酵母源金屬硫蛋白對(duì)慢性汞中毒小鼠氧化損傷的修復(fù)作用

王 穎1，2，王欣卉1，徐炳政3，張東杰1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有 限公司，山東 青島 266400）

探討具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的兩種酵母源金屬硫蛋白（metallothionein，MT）亞型（MT-1和MT-2）對(duì)慢性汞中毒小鼠氧化損傷的修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)氯化汞染毒，連續(xù)灌胃兩種酵母源MT及二巰基丙磺酸鈉（dimercaptopropansulfonate sodium，DMPS）28 d后測(cè)定小鼠體質(zhì)量、全血汞含量及血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及機(jī)體總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）。與正常對(duì)照組小鼠相比，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05），灌胃給藥28 d后，兩種酵母源MT亞型高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著升高（ P＜0.05）；各給藥組小鼠血液、肝臟及腎臟汞含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05），兩種酵母源MT亞型高劑量組的排汞效果顯著優(yōu)于DMPS組（P＜0.05）；各給藥組小鼠血清中GSH-Px、SOD活力和MDA水平及總抗氧化能力接近正常對(duì)照組小鼠水平（P＞0.05），其中酵母源MT高劑量組的作用效果最佳，且在改善機(jī)體T-AOC方面的效果優(yōu)于DMPS組（P＜0.05），酵母源MT-1亞型升高小鼠血清SOD活力和降低血清MDA含量的作用效果明顯好于酵母源MT-2亞型。兩種酵母源MT對(duì)慢性汞中毒小鼠具有良好的氧化損傷保護(hù)作用及排汞效果。

酵母源金屬硫蛋白；汞；氧化損傷；保護(hù)

王穎， 王欣卉， 徐炳政， 等. 酵母源金屬硫蛋白對(duì)慢性汞中毒小鼠氧化損傷的修復(fù)作用［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 242-246.

WANG Ying， WANG Xinhui， XU Bingzheng， et al. Metallothioneins from yeast expell mercury and protect against oxidative damage in mice chronically treated with mercury［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 242-246. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615041. http://www.spkx.net.cn

汞作為一種毒性IIB族金屬，廣泛存在于自然和人類生活環(huán)境之中。汞通常可制成消毒劑、止痛劑和治療疥瘡的藥膏，并可添加于化妝品祛斑霜中，用以對(duì)臉部遮瑕及達(dá)到祛斑的效果。同時(shí)汞可制成殺蟲劑及觸媒劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中［1］。隨著對(duì)汞制劑日常的接觸，其慢性毒性作用隨之暴露。研究表明，汞在機(jī)體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為二價(jià)離子態(tài)（Hg2+），可穩(wěn)定存在于血液及機(jī)體肝、腎組織當(dāng)中，通過(guò)與體內(nèi)巰基（—SH）及膜表面蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加，從而產(chǎn)生大量自由基，使機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)加?。?-4］。目前對(duì)于汞慢性毒性的治療一般采用以二巰基丙磺酸鈉（dimercaptopropansulfonate sodium，DMPS）為主的金屬離子螯合劑類藥物［5-6］，但此類藥物在機(jī)體內(nèi)結(jié)合Hg2+的同時(shí)會(huì)結(jié)合Ca2+、Zn2+等有益金屬離子，造成機(jī)體金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡［7］，且其在體內(nèi)存留的藥物副作用毒性尚未明確，缺乏一定的安全性。

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類富含巰基和半胱氨酸的小分子質(zhì)量胞內(nèi)功能性蛋白質(zhì)［8-10］。MT內(nèi)含有大量巰基，在機(jī)體內(nèi)的作用表現(xiàn)為螯合重金屬離子、清除氧自由基及修復(fù)重金屬離子致機(jī)體損傷等。常見MT一般是從動(dòng)物肝臟中提取，生產(chǎn)周期長(zhǎng)且價(jià)格高昂、利用范圍較小。酵母源MT是由Zn2+、Cu2+等金屬離子誘導(dǎo)酵母細(xì)胞所分泌的一類功能性蛋白質(zhì)，其相對(duì)于動(dòng)物源MT具有生產(chǎn)周期短、價(jià)格相對(duì)低廉且高效安全的特點(diǎn)，受到越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)探討了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的兩種酵母源MT亞型（MT-1、MT-2）的排汞效果及其對(duì)汞中毒小鼠機(jī)體抗氧化損傷的修復(fù)作用，旨在為酵母源MT在排汞及修復(fù)機(jī)體氧化性損傷方面提供相關(guān)數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（18±2） g，許可證號(hào)：SCXK-（吉）2011-0003，長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.2材料與試劑

酵母源金屬硫蛋白亞型（MT-1、MT-2，純度95%），黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離純化所得。

DMPS 上海研臣實(shí)業(yè)有限公司；氯化汞（HgCl2）上海撫生生物技術(shù)有限公司；肝素鈉、總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所。

1.3儀器與設(shè)備

YB-P50001型電子天平 北京長(zhǎng)拓銳新科技發(fā)展有限公司；AFS-920雙道原子熒光光度計(jì) 北京吉天儀器有限公司；Tecan Sunrise酶標(biāo)儀 力臻卓越科學(xué)儀器有限公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

取健康昆明小鼠90 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，稱體質(zhì)量。隨機(jī)抽取10 只小鼠為正常對(duì)照組（NOR組），其余用于構(gòu)建慢性汞中毒小鼠模型，分別為：模型對(duì)照組（MOD組）、陽(yáng)性對(duì)照組（DMPS組）、酵母源MT-1型處理組（低、中、高劑量各1 組）、酵母源MT-2型處理組（低、中、高劑量各1 組），每組小鼠10 只。

小鼠均飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)專用塑料鼠籠中，頂部配有鋼絲網(wǎng)蓋以及自動(dòng)飲水器，每2 d更換一次無(wú)菌碎木屑?jí)|料，室溫（24±2）℃、相對(duì)濕度（45±3）%，每日光照12 h，攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水。

1.4.2給藥劑量與方法

28 d實(shí)驗(yàn)期間，小鼠每日自由攝取實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料，正常對(duì)照組小鼠每日自由飲用去離子水，汞中毒小鼠每日自由飲用含50 nmol/L HgCl2的去離子水溶液，各組小鼠每日在同一時(shí)間灌胃給藥，各組小鼠具體灌胃劑量見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的藥劑分配Table 1 Agent administration to experimental animals

1.4.3相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄小鼠形態(tài)特征及體質(zhì)量變化，末次給藥24 h后，每組隨機(jī)抽取5 只小鼠，摘除眼球取血，分離血清，實(shí)驗(yàn)室試劑盒法測(cè)定小鼠血清中MDA含量，SOD及GSH-Px活力及總抗氧化能力，其余小鼠保存全血（肝素鈉抗凝），并摘除肝臟、腎臟，經(jīng)雙道原子熒光光度計(jì)測(cè)定血液、肝臟及腎臟汞含量。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1小鼠日常狀況

實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠，各慢性染毒小鼠均出現(xiàn)中毒癥狀，其中模型對(duì)照組和兩種酵母源MT亞型低劑量組小鼠最為明顯，其攝食量和飲水量明顯減少，體毛干燥稀疏，皮膚顏色隨染毒時(shí)間的增加出現(xiàn)青灰變色，模型對(duì)照組小鼠偶有眼瞼處出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，個(gè)別小鼠出現(xiàn)中毒性震顫，對(duì)外界刺激的敏感性減弱。各組小鼠中撕咬現(xiàn)象隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)有所減少。經(jīng)灌胃給藥后，DMPS組小鼠和MT各劑量組小鼠的中毒癥狀均有不同程度緩解，且緩解程度與給藥劑量大小相關(guān)。

2.2小鼠體質(zhì)量變化

圖1　實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量指標(biāo)Fig. 1 Body weights of experimental and control mice

實(shí)驗(yàn)期間小鼠體質(zhì)量變化由如圖1所示，小鼠經(jīng)慢性染毒后，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），灌胃給藥后，除酵母源MT-1-L組和MT-2-L、MT-2-M組外，其他給藥組小鼠體質(zhì)量與模型對(duì)照組相比均有不同程度改善（P＜0.05），且與正常對(duì)照組小鼠無(wú)顯著差異。汞進(jìn)入人體內(nèi)經(jīng)消化道及小腸的吸收作用，引起消化道及腸胃的炎癥反應(yīng)，影響食物的吸收與利用［11-12］。染毒組小鼠在經(jīng)灌胃給藥后，體質(zhì)量降低狀況有所改善。研究表明，MT與DMPS作為金屬離子絡(luò)合劑，對(duì)Hg2+有明顯的結(jié)合作用，在體內(nèi)可結(jié)合Hg2+而抑制其在消化道及小腸內(nèi)的吸收作用，從而減輕其對(duì)消化道的損傷，并促進(jìn)食物的吸收，使體質(zhì)量趨于正常［13-14］。

2.3小鼠血清抗氧化酶系指標(biāo)及總抗氧化能力

表2　小鼠血清GSH-Px、SOD活力，MDA含量及總抗氧化能力Table 2 Serum GSH-Px， SOD， MDA levels and T-AOC in experimental animals

由表2可知，相較于正常對(duì)照組小鼠，慢性HgCl2染毒小鼠血清GSH-Px及SOD活力顯著降低（P＜0.05），總抗氧化能力也顯著降低（P＜0.05），而MDA水平則顯著升高（P＜0.05）。GSH-Px及SOD為富含巰基的一類抗氧化酶，研究表明，汞在機(jī)體內(nèi)易與巰基結(jié)合，從而破壞抗氧化酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致抗氧化酶失活，同時(shí)汞可破壞細(xì)胞膜表面蛋白結(jié)構(gòu)，致機(jī)體內(nèi)氧自由基水平升高，造成機(jī)體抗氧化體系失衡，從而產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷［15-16］。經(jīng)灌胃給藥28 d后，小鼠血清中抗氧化酶GSH-Px和SOD活力及總抗氧化能力均有所回升，脂質(zhì)過(guò)氧化水平指標(biāo)MDA含量也顯著降低，其中，MT-2-H組與MT-1-M、MT-1-H組對(duì)GSH-Px及SOD活力升高的效果顯著（P＜0.05），總抗氧化能力也與正常對(duì)照組小鼠接近，且兩種酵母源MT對(duì)小鼠機(jī)體抗氧化能力的提升及清除體內(nèi)MDA效果與其劑量成正相關(guān)。

2.4小鼠血液、肝臟及腎臟汞含量

小鼠血液、肝臟及腎臟汞含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示，相較于正常對(duì)照組，各染毒組小鼠經(jīng)慢性HgCl2染毒后，血液、肝臟及腎臟Hg2+含量顯著升高（P＜0.05），表明汞在進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可穩(wěn)定存在于血液及肝腎組織當(dāng)中，經(jīng)連 續(xù)灌胃給藥28 d后，各給藥組小鼠血液及肝臟、腎臟中汞含量與模型對(duì)照組小鼠相比均顯著降低（P＜0.05），且兩種酵母源MT對(duì)染毒小鼠血液及臟器汞含量的降低作用與給藥劑量成正相關(guān)。DMPS組降低小鼠血液及肝臟、腎臟中汞含量的效果顯著優(yōu)于MT-2-L、MT-2-M組和MT-1-L組（P＜0.05），兩種酵母源MT低劑量組對(duì)染毒小鼠的血液及肝臟、腎臟中汞含量的降低效果無(wú)顯著差異（P＞0.05），MT-2-H組和MT-1-M、MT-1-H組的排汞效果顯著優(yōu)于其他MT劑量組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，兩種酵母源MT和DMPS對(duì)慢性汞染毒小鼠有較好的排汞效果，在0.16～0.80 mg/（kg?d）劑量范圍內(nèi)，灌胃給藥高劑量的酵母源MT對(duì)小鼠的排汞效果最佳。

圖2　小鼠血液、肝臟及腎臟汞含量Fig. 2 Mercury levels in the blood， liver and kidney of mice

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)將具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的兩種酵 母源MT亞型（MT-1、MT-2）［17-19］應(yīng)用于慢性汞中毒小鼠，得到了良好的修復(fù)抗氧化酶系、清除體內(nèi)MDA及排汞效果。研究表明，汞可穩(wěn)定存在于機(jī)體內(nèi)，并在進(jìn)入機(jī)體初期，隨血液流動(dòng)致全身各處，蓄積于肝臟、腎臟為主的靶器官當(dāng)中，造成機(jī)體損傷［20-22］，汞對(duì)—SH具有強(qiáng)親和性，可與體內(nèi)含有—SH的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制蛋白質(zhì)發(fā)揮其原本作用而失活，汞可與體內(nèi)GSH-Px、SOD上的—SH位點(diǎn)結(jié)合，從而使兩種抗氧化酶活性位點(diǎn)改變，失去原有的抗氧化活性；同時(shí)，汞可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基，包括超氧陰離子自由基（O2-?）、羥自由基（?OH）及H2O2等［23］，自由基可對(duì)臨近的DNA、分子基團(tuán)及生物膜結(jié)構(gòu)等進(jìn)行攻擊，奪取其離子或正電子基團(tuán)，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷，使脂質(zhì)過(guò)氧化物和大量MDA積累［24］。

本實(shí)驗(yàn)以慢性HgCl2染毒小鼠作為載體，探討了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的兩種酵母源MT亞型的排汞效果及修復(fù)機(jī)體氧化損傷的作用效果。結(jié)果顯示，兩種酵母源MT亞型可結(jié)合汞離子，降低小鼠消化道及胃腸道汞離子含量，減輕腸道內(nèi)細(xì)胞損傷，提高機(jī)體食物營(yíng)養(yǎng)素吸收及代謝能力，從而改善汞中毒小鼠體質(zhì)量指標(biāo)，使汞中毒小鼠體質(zhì)量接近正常對(duì)照組小鼠。體內(nèi)GSH-Px、SOD活性及總抗氧化能力是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)能力的重要檢測(cè)指標(biāo)，Hg2+可結(jié)合GSH-Px及SOD的—SH位點(diǎn)，使之變性失活［25］，同時(shí)Hg2+可致機(jī)體自由基增加，機(jī)體抗氧化體系失衡，從而又加劇了GSH-Px和SOD的消耗，最終導(dǎo)致機(jī)體總抗氧化能力降低和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷終產(chǎn)物MDA含量的增加。酵母源MT富含—SH，易與Hg2+結(jié)合，且MT在機(jī)體內(nèi)會(huì)釋放自身所攜帶的Zn2+，以提供激活GSH-Px及SOD所需要的離子基團(tuán)，從而激活體內(nèi)抗氧化酶系，并維持其在體內(nèi)含量，另外MT在體內(nèi)所暴露出的—SH易被自由基氧化，從而降低體內(nèi)自由基含量，減少脂質(zhì)過(guò)氧化損傷總產(chǎn)物MDA含量的增加，降低氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，提高了機(jī)體總抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)中，相較于模型對(duì)照組小鼠，兩種酵母源MT亞型給藥組均可明顯提高小鼠血清中的GSH-Px、SOD活力，且呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并且在提升機(jī)體總抗氧化能力上，兩種酵母源MT亞型效果甚至優(yōu)于DMPS。酵母源MT-1亞型高劑量組對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量的清除效果與DMPS作用無(wú)顯著差異（P＞0.05），總體來(lái)看，酵母源MT-1亞型清除小鼠體內(nèi)MDA的效果優(yōu)于酵母源MT-2亞型。

酵母源MT具有高效結(jié)合Hg2+的能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)灌胃酵母源MT后，染毒小鼠血液及肝臟、腎臟汞含量顯著下降（P＜0.05），且與兩種酵母源MT亞型呈一定的量效關(guān)系。酵母源MT富含的—SH可與Hg2+特異性結(jié)合，形成可溶性Hg-MT絡(luò)合物并通過(guò)代謝系統(tǒng)排出體外，降低血液及肝臟、腎臟汞含量，從而緩解汞對(duì)機(jī)體的損傷。酵母源MT由Cu2+、Zn2+等離子誘導(dǎo)合成［26］，在體內(nèi)可與Hg2+特異性結(jié)合，降低血液Hg2+含量，同時(shí)亦可釋放出自身攜帶的離子，激活金屬類抗氧化酶活性，清除體內(nèi)活性氧，修復(fù)機(jī)體抗氧化體系。

本實(shí)驗(yàn)中，兩種酵母源MT亞型顯示了優(yōu)異的結(jié)合Hg2+、修復(fù)抗氧化酶體系、提高機(jī)體總抗氧化能力水平及清除體內(nèi)MDA含量的效果，為其在促進(jìn)排出機(jī)體Hg2+和提高機(jī)體抗氧化能力方面提供了數(shù)據(jù)支持，與本課題組研究酵母源MT促進(jìn)排鉛的作用效果相當(dāng)［27］，以此表明，酵母源MT在重金屬離子促排和修復(fù)重金屬離子致機(jī)體氧化損傷修復(fù)方面的作用效果優(yōu)異，并擁有廣闊的發(fā)展前景。

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Metallothioneins from Yeast Expell Mercury and Protect against Oxidative Damage in Mice Chronically Treated with Mercury

WANG Ying1，2， WANG Xinhui1， XU Bingzheng3， ZHANG Dongjie1
（1. College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China； 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center， Daqing 163319， China； 3. Qingdao Langyatai Co. Ltd.， Qingdao 266400， China）

The intent of this research was to explore the effect of metallothioneins from yeast with self-owned intellectual property rights on protecting against oxidative damage and expelling mercury in mice with chronic mercury poisoning. The mice with mercuric chloride exposure were continuously lavaged with two types （MT-1 and MT-2） of metallothioneins from yeast and dimercaptopropansulfonate sodium （DMPS） for 28 days， respectively. Body weight， mercury level in the whole blood， SOD， GSH-Px and MDA levels in serum， and total antioxidative capacity （T-AOC） in the body were measured at the end of the administration period. Compared with the normal control group， body weight in the model control group significantly decreased （P ＜ 0.05）， while both high-dose MT treatment groups showed a significant increase in body weight after gavaging for 28 days （P ＜ 0.05）. The mercury levels in blood， liver and kidney in all drug treatment groups were decreased significantly when compared with the model control group （P ＜ 0.05）. The effects of two types of high-dose metallothioneins on expelling mercury were significantly better than that of DMPS （P ＜ 0.05）. SOD， GSH-Px， MDA levels in serum and T-AOC in the body in all administration groups were brought back to the levels of the normal group （P ＞ 0.05）. Two monomeric forms of MT at the high dose had significant impact on improving total antioxidant capacity in the body better than that of DMPS （P ＜ 0.05）. However， MT-1 was significantly superior to MT-2 in increasing serum SOD and reducing serum MDA. Both metallothioneins from yeast had an obvious effect on expelling mercury and protecting against oxidative damage.

metallothioneins from yeast； mercury； oxidative damage； protection

10.7506/spkx1002-6630-201615041

2016-04-07

黑龍江省博士后資助項(xiàng)目（LBH-Z13168）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201445）；黑龍江省農(nóng)墾總局“十二五”重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（HNK125B-13-05）；黑龍江省新世紀(jì)優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2014-2016）

王穎（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程及食品質(zhì)量安全。E-mail：Wychen156@163.com

TS202.3

A

1002-6630（2016）15-0242-05

10.7506/spkx1002-6630-201615041. http://www.spkx.net.cn

引文格式：