• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DEAE瓊脂糖凝膠純化龍膽多糖及其分子特性

    2016-11-14 12:37:49曹榮安梁茜茜李澤偉魏恭祿
    食品科學(xué) 2016年15期
    關(guān)鍵詞:粗品瓊脂糖龍膽

    肖 健,曹榮安*,賈 建,梁茜茜,李澤偉,魏恭祿,王 巍

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

    DEAE瓊脂糖凝膠純化龍膽多糖及其分子特性

    肖 健,曹榮安*,賈 建,梁茜茜,李澤偉,魏恭祿,王 巍

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

    以龍膽為原料提取龍膽多糖,純化后對其分子特性進(jìn)行研究。通過正交試驗確定了龍膽多糖的最佳提取參數(shù):浸提時間2.5 h、浸提溫度90 ℃、液料比20∶1(V/m),得率為12.80%。利用DEAE瓊脂糖凝膠柱對龍膽多糖粗品進(jìn)行純化,得到F1和F2兩個分離組分,得率分別為14.1%和63.4%?;瘜W(xué)組成分析表明龍膽多糖粗品、F1和F2是由不同含量的總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根和糖醛酸組成的,單糖組成主要包括阿拉伯糖和半乳糖,同時含有少量的葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖。采用高效尺寸排阻色譜-紫外檢測器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測器聯(lián)機系統(tǒng)對多糖的分子質(zhì)量及分布進(jìn)行分析,結(jié)果表明龍膽粗品、F1和F2分子質(zhì)量(Mw)為67.2×103~788.4×103u,回轉(zhuǎn)半徑(Rg)為90.2~321.1 nm。研究確定了龍膽多糖的提取參數(shù),并通過離子交換柱進(jìn)行純化,分析了龍膽多糖的分子特性,為下一步的生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

    龍膽;多糖;分離純化;分子特性

    肖健, 曹榮安, 賈建, 等. DEAE瓊脂糖凝膠純化龍膽多糖及其分子特性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(15): 130-135.

    XIAO Jian, CAO Rongan, JIA Jian, et al. Purification and molecular characterization of polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma by DEAE sepharose fast flow chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(15): 130-135. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615022. http://www.spkx.net.cn

    龍膽(Gentianae Radix et Rhizoma)為龍膽科植物龍膽的根和根莖[1],臨床上用于治療肝膽疾病、高血壓病、急性腎盂腎炎、病毒性角膜炎、皮膚病、急性咽炎、慢性支氣管炎、上呼吸道感染、結(jié)膜炎等疾?。?]。龍膽在國際上亦為天然藥物,被收載為苦味健胃劑[3]。龍膽多糖為龍膽的有效成分之一,而多糖作為一類天然高分子化合物受到研究者的日益重視。多糖是由醛糖或酮糖組成的,由10 個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的多聚物,是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一,在生命活動中扮演重要角色[4-5]。人們對于糖類的早期研究只注意到它作為細(xì)胞的組成成分和能源物質(zhì)的重要性,后來發(fā)現(xiàn)有些多糖可以作為細(xì)胞表面專一的識別信號,起傳遞信息的作用,參與生命科學(xué)中細(xì)胞的各種活動,具有多種多樣的生物學(xué)功能,例如多糖具有抗病毒[6]、抗衰老[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、抗凝[10]、抗血栓[11]、降血糖和治療糖尿?。?2-13]等作用,還有免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤的生物學(xué)功效,它能激活免疫受體,提高機體的免疫功能[6,8]。而且多種植物和真菌多糖例如人參、黃芪、靈芝、茯苓和香菇多糖可以增強癌癥患者免疫力、改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長生存時間等,已被廣泛用于各種腫瘤的治療[14]。本實驗以龍膽為原料提取龍膽多糖,進(jìn)行提取參數(shù)的研究,并對其進(jìn)行分離純化, 進(jìn)而分析其化學(xué)成分、單糖組成、分子質(zhì)量及分布。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    龍膽購自安徽亳州茲元堂。

    DEAE瓊脂糖凝膠 美國GE Healthcare公司;蛋白質(zhì)定量試劑盒 美國Bio-Rad公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白、明膠、葡萄糖醛酸 美國Sigma-Aldrich公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2儀器與設(shè)備

    3802 UV/VZS分光光度計 美國Unico公司;TSK Gel色譜柱 日本Tosoh公司;2487紫外檢測器、2414示差折光檢測器 美國Waters公司;DAWN HELEOS多角度激光光散射檢測器 美國Wyatt公司;6890N/ MSD5973氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

    1.3方法

    1.3.1龍膽多糖提取參數(shù)研究

    1.3.1.1提取工藝

    采用水提醇沉法提取龍膽多糖,工藝如下:挑選龍膽原料除雜后60 ℃烘干,研磨過40 目篩,加入85%乙醇,70 ℃加熱回流攪拌2 h,冷卻后室溫攪拌12 h,離心后殘渣中分別加入85%乙醇和無水丙酮室溫攪拌,離心后沉淀在通風(fēng)櫥中自然干燥。按照一定的液料比加入蒸餾水進(jìn)行浸提,浸提兩次,合并兩次的提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,加入乙醇使最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%,攪拌10 min后放入4 ℃冰箱中靜置12 h,離心后棄去上清液,沉淀分別加入無水乙醇和丙酮洗滌兩次,離心后沉淀室溫干燥,稱質(zhì)量后按照下式計算多糖得率。

    1.3.1.2單因素試驗

    液料比對多糖得率的影響:選取液料比(V/m)分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1,浸提溫度80 ℃,浸提時間2 h,進(jìn)行多糖的提取,研究液料比對多糖得率的影響。

    浸提溫度對多糖得率的影響:液料比(V/m)10∶1,選取浸提溫度分別為75、80、85、90、95 ℃,浸提時間為2 h,進(jìn)行多糖的提取,研究浸提溫度對多糖得率的影響。

    浸提時間對糖得率的影響:液料比(V/m)10∶1,浸提溫度80 ℃,選取浸提時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,進(jìn)行多糖的提取,研究浸提時間對多糖得率的影響。

    1.3.1.3正交試驗

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,3 個因素各選取3 個水平進(jìn)行正交試驗,從而最終確定提取龍膽多糖的最佳參數(shù),并利用最佳參數(shù)進(jìn)行提取,測定龍膽多糖得率。

    1.3.2龍膽多糖的純化

    250 mg龍膽多糖溶于10 mL蒸餾水中,60 ℃溶解,3 ?m膜過濾后注入DEAE瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化,洗脫液分別為蒸餾水,0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl溶液,分別洗脫5 h,洗脫速率為1.5 mL/min。蒸餾水洗脫2 h后開始收集解析液,10 min/管。按照苯酚-硫酸法[15]測定解析液的總糖含量,合并相應(yīng)的溶液,濃縮、透析后凍干得到多糖分離組分。

    1.3.3總糖含量測定

    總糖含量測定參照Dubois等[15]的苯酚-硫 酸法:多糖配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液,60 ℃溶解待用。溶液中加入5%苯酚溶液后旋渦振蕩,加入濃硫酸溶液,充分旋渦振蕩,室溫反應(yīng)20 min后在490 nm波長處測定吸光度。選擇葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中總糖含量。

    1.3.4蛋白質(zhì)含量測定

    蛋白質(zhì)含量測定采用Lowry法(福林-酚法)[16],使用蛋白質(zhì)定量試劑盒:多糖配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液,60 ℃溶解待用。溶液加入試劑 A,充分旋渦振蕩,室溫反應(yīng)10 min。加入試劑B,充分旋渦振蕩,室溫反應(yīng)15 min后在750 nm波長處測定吸光度。選擇牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中蛋白質(zhì)含量。

    1.3.5硫酸根含量測定

    硫酸根含量測定采用Dodgson等[17]的氯化鋇-明膠濁度法:多糖用0.5 mol/L HCl溶液在110 ℃烘箱中水解5 h。水解液加入質(zhì)量濃度為3 g/100 mL三氯乙酸溶液,旋渦振蕩后再加入氯化鋇-明膠溶液,室溫反應(yīng)20 min后在360 nm波長處測定吸光度。選擇硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品,將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中硫酸根含量。

    1.3.6糖醛酸含量測定

    糖醛酸含量測定采用Filiset ti-Cozzi等[18]的間羥基聯(lián)苯法:多糖配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液,60 ℃溶解待用。樣品溶液加入磺酰胺鉀溶液(pH 1.6),旋渦振蕩后加入四硼酸鈉-硫酸溶液,充分旋渦振蕩,100 ℃沸水中反應(yīng)20 min,冰浴中迅速冷卻,加入質(zhì)量濃度為0.15 g/100 mL間羥基聯(lián)苯溶液(溶解在質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL氫氧化鈉溶液中),對照組僅加入質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL氫氧化鈉溶液。充分旋渦振蕩后室溫反應(yīng)10 min,在535 nm波長處測定吸光度,采用葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,將樣品吸光度減去對照組吸光度的結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計算出樣品中糖醛酸含量。

    1.3.7單糖組成分析

    參考Ciucanu等[19]的方法并稍作改動(樣品處理全過程需要氮氣保護(hù)):樣品和7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖)分別加入三氟乙酸,100 ℃水解6 h,之后分別加入硼氘化鈉(NaBD4)和無水醋酸進(jìn)行還原和乙?;?,制得相應(yīng)的糖醇乙酸酯衍生物。注入1 μL到GC-MS儀中進(jìn)行分析,采用的是HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣作為氦氣,流速為1.2 mL/min。升溫程序為160~210 ℃(10 min之內(nèi)),之后10 min內(nèi)以5 ℃/min升溫到240 ℃,保持在250 ℃,進(jìn)樣口溫度也保持在250 ℃。用電子轟擊源(electron impaction,EI)分析,電子能量為70 eV,質(zhì)量掃描范圍為35~450 m/z。根據(jù)氣相色譜出峰時間和質(zhì)譜的離子峰與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比從而確定單糖組成。

    1.3.8分子質(zhì)量及分布測定

    多糖配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液,60 ℃加熱溶解,3 ?m膜過濾后注入排阻色譜-紫外檢測器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測器聯(lián)機系統(tǒng)中測定分子質(zhì)量及分布情況。采用牛血清白蛋白對儀器進(jìn)行校正,流動相是0.15 mol/L NaNO3和0.02% NaN3,流速為0.4 mL/min,結(jié)果分析采用ASTRA 6.1軟件。

    1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1龍膽多糖的提取條件

    2.1.1單因素試驗結(jié)果

    對于龍膽多糖提取參數(shù)的研究,首先進(jìn)行了單因素試驗,選取的因素包括液料比、浸提溫度和浸提時間。液料比對多糖得率的影響見圖1,在液料比(V/m)10∶1~20∶1范圍內(nèi),隨著液料比的增大,多糖得率呈明顯上升趨勢,當(dāng)液料比(V/m)為20∶1時,多糖得率最高,為11.50%,之后隨著液料比的繼續(xù)升高,多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢,所以選取15∶1、20∶1、25∶1為進(jìn)行龍膽多糖提取正交試驗的液料比(V/m)。

    圖1 液料比對多糖得率的影響Fig. 1 Effect of liquid/solid ratio on the yield of polysaccharides

    浸提溫度對多糖得率的影響見圖2,可知在75~90 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,多糖得率呈明顯上升趨勢,當(dāng)浸提溫度為90 ℃時多糖得率最高,為11.60%,之后隨著溫度的繼續(xù)升高,多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢,所以選取85、90、95 ℃為進(jìn)行龍膽多糖提取正交試驗的溫度。

    圖2 浸提溫度對多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

    圖3為浸提時間對多糖得率的影響,可知在1.0~2.0 h內(nèi),隨著浸提時間的延長,多糖得率呈明顯上升趨勢,當(dāng)浸提時間為2.0 h時多糖得率最高,為11.47%,之后隨著浸提時間的繼續(xù)延長,多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢,所以選取1.5、2.0、2.5 h為進(jìn)行龍膽多糖提取正交試驗的時間。

    圖3 浸提時間對多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

    2.1.2正交試驗結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取液料比(V/m)15∶1、20∶1、25∶1,浸提溫度85、90、95 ℃,浸提時間1.5、2.0、2.5 h進(jìn)行正交試驗,試驗設(shè)計和結(jié)果見表1。

    表1 正交試驗設(shè)計和結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

    通過比較R值可知影響龍膽多糖得率因素的主次順序為C浸提時間>B浸提溫度>A液料比。通過k值的比較確定提取龍膽多糖的最佳組合為A2B2C3,即液料比20∶1、浸提溫度90 ℃、浸提時間2.5 h,龍膽多糖得率為12.80%。同時也有其他研究者對龍膽多糖的提取參數(shù)進(jìn)行了研究,王晨瑜等[20]確定水溶性龍膽多糖的最佳提取工藝條件為:提取溫度100 ℃、料液比1∶25、提取時間3.0 h、提取次數(shù)2 次,而Wang Chenyu等[21]從龍膽中提取水溶性多糖最佳參數(shù)為:提取溫度100 ℃、料液比1∶26.56、提取時間3 h、提取2 次,通過本實驗確定的提取參數(shù)與以上兩篇文獻(xiàn)的參數(shù)相近。同時本實驗中龍膽多糖的得率為12.80%,這也與史偉國[22]、王晨瑜[20]和Wang Chenyu[21]等所報道的龍膽多糖的提取率分別為12.59%、14.0%和13.0%的結(jié)果相近,提取參數(shù)和提取率上的一些差別可能是由于龍膽原料產(chǎn)地、提取實驗條件和設(shè)備差異造成的。

    2.2龍膽多糖純化結(jié)果

    利用DEAE瓊脂糖凝膠柱對提取得到的龍膽多糖粗品進(jìn)行純化,之后按照苯酚-硫酸法測定收集液的吸光度,以洗脫體積為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制出洗脫圖。由圖4可知,經(jīng)過洗脫后得到兩個洗脫峰,分別命名為分離組分F1和F2,可知F1主要是由蒸餾水洗脫出來的中性多糖,而F2主要是由0.5 mol/L NaCl洗脫出來的酸性多糖。將F1和F2溶液濃縮、透析后凍干,稱質(zhì)量后計算得率,F(xiàn)1的得率為14.1%,F(xiàn)2的得率為63.4%。

    圖4 龍膽多糖的DEAE瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線Fig. 4 Elution profile of the crude polysaccharide from Gentianae Radix et Rhizoma on DEAE Sepharose fast flow

    2.3龍膽多糖的化學(xué)組成

    對龍膽多糖粗品和分離組分F1、F2的化學(xué)成分和單糖組成進(jìn)行了測定,結(jié)果見表2。龍膽多糖粗品主要由59.0%總糖、12.8%蛋白質(zhì)、6.8%硫酸根和26.7%糖醛酸組成,而F1和F2的化學(xué)成分別為總糖91.2%和58.9%、蛋白質(zhì)4.1%和12.2%、硫酸根6.4%和9.2%、糖醛酸0.7%和28.8%。圖5是單糖標(biāo)準(zhǔn)品和龍膽多糖衍生物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖,圖5A是7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖,按照出峰時間先后順序?qū)?yīng)的單糖分別為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其中鼠李糖和巖藻糖衍生物的質(zhì)譜圖是一致的,阿拉伯糖和木糖衍生物的質(zhì)譜圖是一致的,甘露糖、葡萄糖和半乳糖衍生物的質(zhì)譜圖是一致的。圖5B、C、D分別為龍膽多糖粗品、F1和F2衍生物的總離子流色譜圖,根據(jù)出峰時間和質(zhì)譜圖對比確定對應(yīng)單糖的種類,同時根據(jù)峰面積計算單糖組成和比例。由表2可知,龍膽多糖粗品主要由阿拉伯糖(42.6%)和半乳糖(43.8%)組成,同時含有少量的葡萄糖(5.3%)、鼠李糖(4.8%)、甘露糖(2.7%)和木糖(0.8%)。F1和F2的單糖組成同粗品也非常相近,也是主要由阿拉伯糖(分別為53.3%和40.1%)和半乳糖(分別36.6%和47.7%)組成,同時分別含有5.3%和2.8%的葡萄糖、0.3%和7.5%的鼠李糖、3.8%和1.3%的甘露糖、0.7%和0.6%的木糖。王赫[23]從龍膽水溶性多糖中分離純化得到2 種不同的均一多糖組分TP-1、TP-2,經(jīng)氣相色譜法檢測,二者主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成,同時含有少量的巖藻糖、木糖和甘露糖。而本實驗分析確定的龍膽多糖的單糖組成主要為阿拉伯糖和半乳糖,葡萄糖的含量非常少,造成這種差別的原因可能是采用的龍膽原料和純化方法的不同,王赫采用的是Sephadex G100型凝膠柱純化龍膽多糖,而本研究采用的是DEAE瓊脂糖凝膠柱。

    表2 龍膽多糖粗品和分離組分的化學(xué)成分和單糖組成及含量Table 2 Chemical and monosaccharide compositions and content of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

    圖5 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和龍膽多糖糖醇乙酸酯衍生物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 5 Total ion current chromatogram and mass spectra for alditol acetates derivatives of monosaccharides and polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma

    2.4龍膽多糖的分子質(zhì)量及分布

    采用高效尺寸排阻色譜-紫外檢測器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測器聯(lián)機系統(tǒng)對龍膽多糖的分子質(zhì)量及分布情況進(jìn)行了研究,示差折光檢測曲線和紫外色譜見圖6。龍膽多糖粗品示差折光檢測曲線(圖6A)上有峰形不對稱的兩個峰,分別為洗脫時間30~42 min的峰Ⅰ和42~51 min的峰Ⅱ。F2也存在兩個峰(圖6C),分別為洗脫時間32~45 min的峰Ⅰ和45~51 min的峰Ⅱ,可知粗品和F2不是均一多糖。而F1在洗脫時間為40~51 min內(nèi)只存在一個峰形對稱的峰(圖6B),說明其是均一多糖。同時粗品和F2也存在明顯的紫外檢測峰,而F1的紫外檢測峰非常小,說明粗品和F2含有一定的蛋白質(zhì),而F1的蛋白質(zhì)含量很低,這與2.3節(jié)化學(xué)組成檢測中F1蛋白質(zhì)含量較低的結(jié)果是相互吻合的。

    同時利用ASTRA 6.1軟件進(jìn)行分析,得到分子質(zhì)量(Mw)和回轉(zhuǎn)半徑(Rg)的數(shù)值見表3??芍制贩澧窈头澧虻腗w分別為616.5×103、246.9×103u,Rg分別為90.2、270.2 nm。F1的Mw為67.2×103u,Rg為178.6 nm。F2的峰Ⅰ和峰Ⅱ的Mw分別為788.4×103、185.1×103u,Rg分別為90.3、321.1 nm。

    圖6 龍膽多糖粗品和分離組分的示差折光檢測曲線和紫外色譜圖Fig. 6 RI and UV chromatograms of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

    表3 龍膽多糖粗品和分離組分的分子質(zhì)量和回轉(zhuǎn)半徑Table 3 Molecular weights and radii of gyration of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

    3 結(jié) 論

    本研究確定了提取龍膽多糖的最佳參數(shù)為浸提時間2.5 h、浸提溫度90℃、液料比20∶1(V/m),此條件下龍膽多糖得率為12.80%。利用DEAE瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化,得到了極性不同的龍膽多糖組分F1和F2。化學(xué)組成分析表明龍膽多糖是由總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根和糖醛酸組成的,單糖組成主要包括阿拉伯糖和半乳糖,同時含有少量的葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖。粗品、F1和F2的Mw為67.2×103~788.4×103u,Rg為90.2~321.1 nm,同時分子質(zhì)量分布表明粗品和F2不是均一多糖,而F1是均一多糖。通過本研究明確了龍膽多糖的提取參數(shù)、 純化方法和分子特 性,為下一步對其生物活性和構(gòu)效關(guān)系的分析奠定了基礎(chǔ)。

    [1] 國家藥典委員會. 中華 人民共和國藥典2010年版一部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 89.

    [2] 劉濤, 才謙, 付玉芹, 等. 中藥龍膽的研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)雜志,2004, 31(1): 85-86. DOI:10.3969/j.issn.1000-1719.2004.01.065.

    [3] 謝觀. 中國醫(yī)學(xué)大辭典第四冊[M]. 北京: 中國書店出版杜, 1988: 150.

    [4] 季宇彬, 肖鳳, 汲晨鋒. 多糖抗腫瘤研究進(jìn)展[J]. 上海醫(yī)藥, 2007,28(7): 309-311. DOI:10.3969/j.issn.1006-1533.2007.07.008.

    [5] 邱琳, 辛現(xiàn)良, 耿美玉. 多糖構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 9(9): 1764-1768.

    [6] YANG T H, JIA M, ZHOU S Y, et al. Antivirus and immune enhancement activities of sulfated polysaccharide from Angelica sinensis[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012,50(3): 768-772. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2011.11.027.

    [7] YEA M, CHEN W X, QIU T, et al. Structural characterisation and anti-ageing activity of extracellular polysaccharide from a strain of Lachnum sp.[J]. Food Che mistry, 2012, 132(1): 338-343. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.10.087.

    [8] SILVA B P D, PARENTE J P, SILVA P. An anti-inflammatory and immunomodulatory polysaccharide from Orbignya phalerata[J]. Fitoterapia, 2001, 72(8): 887-893. DOI:10.1016/S0367-326X(01)00338-0.

    [9] LI C, CAI J P, GENG J S, et al. Purification, characterization and anticancer activity of a polysaccharide from Panax ginseng[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 51(5): 968-973. DOI:1 0.1016/j.ijbiomac.2012.06.031.

    [10] MAO W J, LI H Y, LI Y, et al. Chemical characteristic and anticoagulant activity of the sulfated polysaccharide isolated from Monostroma latissimum (Chlorop hyta)[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 44(1): 70-74. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2008.10.003.

    [11] TRENTO F, CATTANEO F, PESCADOR R, et al. Antithrombin activity of an algal polysaccharide[J]. Thrombosis Research, 2001,102(5): 457-465. DOI:10.1016/S0049-3848(01)00264-X.

    [12] HAN Q, YU Q Y, JIANG S, et al. Molecular characterization and hypoglycemic activity of a novel water soluble polysaccharide from tea (Camellia sinensis) flower[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 86(2): 797-805. DOI:10.1016/j.carbpol.2011.05.039.

    [13] KIM H M, KANG J S, KIM J Y, et al. Evaluation of antidiabetic activity of polysaccharide isolated from Phellinus linteus in non obese diabetic mouse[J]. International Immunopharmacology, 2010, 10(1): 72-78. DOI:10.1016/j.intimp.2009.09.024.

    [14] 林夢感, 楊義芳, 李永輝. 多糖抗腫瘤活性構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2007, 38(6): 949-953. DOI:10.3321/ j.issn:0253-2670.2007.06.059.

    [15] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356. DOI:10.1021/ ac60111a017.

    [16] LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the Folin-phenol reagents[J]. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193: 265-275.

    [17] DODGSON K S, PRICE R G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides[J]. Biochemical Journal,1962, 84: 106-110. DOI:10.1042/bj0840106.

    [18] FILISETTI-COZZI T M C C, CARPITA N C. Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars[J]. Analytical Biochemistry, 1991, 197: 157-1 62. DOI:10.1016/0003-2697(91)90372-Z.

    [19] CIUCANU I, KERELK F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates[J]. Carbohydrate Research, 1984,131: 209-217. DOI:10.1016/0008-6215(84)85242-8.

    [20] 王晨瑜, 劉鑫, 張晶, 等. 水溶性龍膽多糖的提取工藝研究[J]. 北方園藝, 2013(10): 155-157.

    [21] WANG C Y, WANG Y, ZHANG J, et al. Optimization for the extraction of polysaccharides from Gentiana scabra Bunge and their antioxidant in vitro and anti-tumor activity in vivo[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2014, 45(4): 1126-1132. DOI:10.1016/j.jtice.2013.12.004.

    [22] 史偉國, 張玉, 吳宏斌, 等. 龍膽多糖最佳提取工藝研究[J]. 北方園藝, 2012(9): 181-183.

    [23] 王赫. 龍膽多糖提取分離純化及其組成糖分析[J]. 中國醫(yī)藥指南,2011, 9(21): 250-251. DOI:10.3969/j.issn.1671-8194.2011.21.168.

    Purification and Molecular Characterization of Polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma by DEAE Sepharose Fast Flow Chromatography

    XIAO Jian, CAO Rongan*, JIA Jian, LIANG Xixi, LI Zewei, WEI Gonglu, WANG Wei
    (College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

    The molecular characterization of the polysaccharides purified from Gentianae Radix et Rhizoma was investigated in this study. By using orthogonal array design, the optimal extraction parameters that provided the maximum yield of polysaccharides of 12.80% were determined as follows: extraction time 2.5 h, temperature 90 ℃, and ratio of liquid to solid 20:1 (V/m). The crude polysaccharide was purified by DEAE sepharose fast flow chromatography to obtain two fractions,F(xiàn)1and F2, with a yield of 14.1% and 63.4%, respectively. All the crude polysaccharide and purified fractions were composed of neutral sugar, protein, sulfate and uronic acid with various ratios. Arabinose and galactose were the major monosaccharide units along with a small portion of glucose, rhamnose, mannose and xylose. The molecular weights (Mw) and radii of gyration(Rg) of all three samples ranged from 67.2 × 103to 788.4 × 103u and from 90.2 to 321.1 nm, respectively, as determined by HPSEC-UV-MALLS-RI system. The results obtained in this study can provide the basis for further bioactivity studies.

    Gentianae Radix et Rhizoma; polysaccharides; separation and purification; molecular characterization

    10.7506/spkx1002-6630-201615022

    TS201.1

    A

    1002-6630(2016)15-0130-06

    10.7506/spkx1002-6630-201615022. http://www.spkx.net.cn

    2015-11-05

    2015年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510223010);黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)2014年度校內(nèi)培育課題(XZR2014-08);黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動計劃項目(XDB2015-30)

    肖健(1994—),男,本科生,研究方向為食品科學(xué)。E-mail:1501800314@qq.com

    曹榮安(1980—),男,講師,博士,研究方向為天然生物活性產(chǎn)物。E-mail:racao@163.com

    引文格式:

    猜你喜歡
    粗品瓊脂糖龍膽
    龍膽瀉肝湯輔助治療濕熱瘀滯型慢性前列腺炎的療效觀察
    基于膠原-瓊脂糖的組織工程表皮替代物構(gòu)建研究
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    抗氧化紫球藻胞外多糖酶解物制備工藝優(yōu)化
    食品與機械(2018年5期)2018-07-14 03:15:24
    尖葉假龍膽化學(xué)成分的研究
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:43
    瓊脂糖以及高分辨率瓊脂糖制備方法研究進(jìn)展*
    廣州化工(2016年11期)2016-09-02 00:42:59
    不同廠家龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的溶出度測定和比較
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:40
    橡膠硫化促進(jìn)劑TBBS制備方法
    針對乙酰吉他霉素的工藝研究
    1024视频免费在线观看| 深夜精品福利| 高清av免费在线| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲色图av天堂| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲专区中文字幕在线| 桃色一区二区三区在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 嫩草影院精品99| 欧美日本亚洲视频在线播放| av欧美777| 1024香蕉在线观看| 国产av在哪里看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 在线观看日韩欧美| 日本免费a在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 热99国产精品久久久久久7| 97碰自拍视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产有黄有色有爽视频| 国产黄a三级三级三级人| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品国产高清国产av| 我的亚洲天堂| 欧美最黄视频在线播放免费 | 夜夜夜夜夜久久久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 激情视频va一区二区三区| 精品久久久久久,| 国产av一区二区精品久久| 久久精品影院6| 亚洲国产看品久久| 午夜免费鲁丝| 韩国av一区二区三区四区| 久久青草综合色| 欧美最黄视频在线播放免费 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久99久视频精品免费| 极品教师在线免费播放| 国产成年人精品一区二区 | 久久亚洲精品不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 村上凉子中文字幕在线| 国产成人欧美在线观看| 视频区图区小说| 国产成人欧美在线观看| 成人三级做爰电影| 久久国产精品人妻蜜桃| 在线观看免费高清a一片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩大尺度精品在线看网址 | 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久国产欧美日韩av| 一级a爱视频在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久人妻熟女aⅴ| aaaaa片日本免费| av片东京热男人的天堂| 日韩高清综合在线| 欧美黄色淫秽网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 热re99久久精品国产66热6| 国产1区2区3区精品| 亚洲五月婷婷丁香| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 最近最新中文字幕大全免费视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲av成人av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 咕卡用的链子| 亚洲人成伊人成综合网2020| 大陆偷拍与自拍| 91成年电影在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 满18在线观看网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品影院久久| 久久精品91蜜桃| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩免费av在线播放| 91成人精品电影| 老司机靠b影院| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 最好的美女福利视频网| 免费av毛片视频| 免费av毛片视频| 免费在线观看完整版高清| 国产亚洲欧美在线一区二区| а√天堂www在线а√下载| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久亚洲真实| 国产欧美日韩一区二区三| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲伊人色综图| 一级a爱片免费观看的视频| 日本欧美视频一区| 国产主播在线观看一区二区| 啦啦啦 在线观看视频| 久9热在线精品视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 身体一侧抽搐| 色在线成人网| 国产精品二区激情视频| 丰满的人妻完整版| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲色图av天堂| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲成人免费电影在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久天堂一区二区三区四区| 中文欧美无线码| 国产高清videossex| 国产精品久久久久成人av| 一级黄色大片毛片| 麻豆成人av在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品久久久久久,| 波多野结衣av一区二区av| 精品人妻在线不人妻| 国产午夜精品久久久久久| 中国美女看黄片| 麻豆国产av国片精品| 99久久国产精品久久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产1区2区3区精品| 岛国在线观看网站| 日韩精品中文字幕看吧| 又紧又爽又黄一区二区| 自线自在国产av| 婷婷六月久久综合丁香| 极品教师在线免费播放| 黑丝袜美女国产一区| 欧美日本中文国产一区发布| 99精品欧美一区二区三区四区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 波多野结衣一区麻豆| 免费在线观看黄色视频的| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av成人av| 香蕉国产在线看| 国产人伦9x9x在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| av天堂在线播放| 久久久久久久午夜电影 | 精品第一国产精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品一区二区三区四区久久 | 看免费av毛片| 麻豆成人av在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产黄a三级三级三级人| 一级片免费观看大全| 操出白浆在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 黄片小视频在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品免费视频内射| av在线播放免费不卡| 久久99一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 热99国产精品久久久久久7| 色在线成人网| 亚洲人成77777在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 脱女人内裤的视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人三级黄色视频| 午夜福利在线免费观看网站| a在线观看视频网站| 最新在线观看一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 色综合婷婷激情| 日韩中文字幕欧美一区二区| 搡老岳熟女国产| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人精品久久二区二区91| 久9热在线精品视频| 校园春色视频在线观看| 看黄色毛片网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 深夜精品福利| 午夜精品在线福利| 黑人猛操日本美女一级片| 搡老熟女国产l中国老女人| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| a级片在线免费高清观看视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 久久国产精品影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成年人精品一区二区 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一二三四社区在线视频社区8| 极品人妻少妇av视频| 亚洲一区中文字幕在线| 在线视频色国产色| 国产av精品麻豆| 嫁个100分男人电影在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲中文字幕日韩| 大陆偷拍与自拍| 久久久国产成人精品二区 | 国产av一区二区精品久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 美女 人体艺术 gogo| 啦啦啦在线免费观看视频4| 天堂俺去俺来也www色官网| 十八禁网站免费在线| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲色图av天堂| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 在线av久久热| 长腿黑丝高跟| 69精品国产乱码久久久| 手机成人av网站| 国产三级黄色录像| 人妻久久中文字幕网| 丝袜在线中文字幕| 久久久久久大精品| aaaaa片日本免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久香蕉精品热| 亚洲成人国产一区在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品国产区一区二| 交换朋友夫妻互换小说| 免费在线观看日本一区| 精品国产美女av久久久久小说| 热99re8久久精品国产| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费在线观看完整版高清| 国产97色在线日韩免费| 高清欧美精品videossex| 岛国在线观看网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 在线播放国产精品三级| 老司机深夜福利视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 香蕉久久夜色| ponron亚洲| 精品久久久久久,| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 757午夜福利合集在线观看| 成人三级黄色视频| av在线天堂中文字幕 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲精品在线美女| 免费在线观看完整版高清| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲三区欧美一区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美久久黑人一区二区| 午夜福利一区二区在线看| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜亚洲福利在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99热只有精品国产| 国产高清videossex| 日韩成人在线观看一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 中文亚洲av片在线观看爽| 一夜夜www| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲第一青青草原| 国产片内射在线| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩有码中文字幕| 不卡一级毛片| 亚洲五月婷婷丁香| 国产亚洲av高清不卡| 日本a在线网址| 黄色毛片三级朝国网站| 长腿黑丝高跟| 黄色a级毛片大全视频| av在线播放免费不卡| 操美女的视频在线观看| 黄色 视频免费看| 亚洲精华国产精华精| 成人永久免费在线观看视频| 天天添夜夜摸| 看片在线看免费视频| 亚洲成人国产一区在线观看| www.熟女人妻精品国产| 精品一品国产午夜福利视频| 老司机福利观看| 免费看a级黄色片| 精品熟女少妇八av免费久了| 免费在线观看影片大全网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av熟女| 美国免费a级毛片| 宅男免费午夜| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 麻豆一二三区av精品| 亚洲成人免费av在线播放| 51午夜福利影视在线观看| svipshipincom国产片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产三级黄色录像| 国产99久久九九免费精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 视频区图区小说| 欧美日韩精品网址| 成人av一区二区三区在线看| 真人做人爱边吃奶动态| 18禁观看日本| 亚洲av电影在线进入| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av电影中文网址| 国产免费av片在线观看野外av| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 一本综合久久免费| 国产不卡一卡二| 99riav亚洲国产免费| 亚洲午夜理论影院| 亚洲专区中文字幕在线| 久久中文字幕人妻熟女| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲少妇的诱惑av| av超薄肉色丝袜交足视频| 中文字幕av电影在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 99精品在免费线老司机午夜| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产黄a三级三级三级人| 午夜老司机福利片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久热这里只有精品99| 99久久综合精品五月天人人| 国产又色又爽无遮挡免费看| 操美女的视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产综合久久久| 99久久人妻综合| 久久久久久久午夜电影 | 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品免费视频内射| 国产真人三级小视频在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲五月色婷婷综合| 一级片免费观看大全| 老司机在亚洲福利影院| 色精品久久人妻99蜜桃| 757午夜福利合集在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99国产精品一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 久久午夜综合久久蜜桃| 悠悠久久av| 91成年电影在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲美女黄片视频| 91麻豆av在线| 久热这里只有精品99| 夫妻午夜视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产精品一区二区三区四区久久 | 午夜福利在线免费观看网站| x7x7x7水蜜桃| 亚洲九九香蕉| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 91在线观看av| 啦啦啦免费观看视频1| 青草久久国产| 91麻豆av在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲中文av在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 亚洲av电影在线进入| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美激情久久久久久爽电影 | 在线观看午夜福利视频| 在线观看www视频免费| 后天国语完整版免费观看| 少妇粗大呻吟视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 操出白浆在线播放| 国产视频一区二区在线看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产高清国产精品国产三级| 日韩欧美国产一区二区入口| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 9色porny在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| av在线天堂中文字幕 | 女性被躁到高潮视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色怎么调成土黄色| 国产免费av片在线观看野外av| 后天国语完整版免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 十分钟在线观看高清视频www| 黄色成人免费大全| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲成人久久性| 国产精品av久久久久免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲熟女毛片儿| 一a级毛片在线观看| 后天国语完整版免费观看| 99热只有精品国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲九九香蕉| 水蜜桃什么品种好| 国产av又大| 亚洲全国av大片| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲av熟女| 亚洲精品成人av观看孕妇| 波多野结衣一区麻豆| 国产深夜福利视频在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久精品国产清高在天天线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜福利在线免费观看网站| 色老头精品视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 在线观看免费日韩欧美大片| 91字幕亚洲| e午夜精品久久久久久久| 欧美在线黄色| xxx96com| 免费高清在线观看日韩| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 久久欧美精品欧美久久欧美| 校园春色视频在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一二三四在线观看免费中文在| tocl精华| 午夜影院日韩av| 国产精品 欧美亚洲| 十八禁网站免费在线| 精品国产国语对白av| 欧美在线一区亚洲| 999精品在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩大码丰满熟妇| 韩国精品一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 丰满的人妻完整版| 99国产精品99久久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 免费在线观看日本一区| 咕卡用的链子| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人18禁在线播放| 亚洲激情在线av| 两个人看的免费小视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 少妇 在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产一区二区激情短视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久中文看片网| 高清在线国产一区| 美女午夜性视频免费| 桃色一区二区三区在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美乱妇无乱码| 一二三四在线观看免费中文在| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲avbb在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 日本wwww免费看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美成人午夜精品| 日韩高清综合在线| 香蕉久久夜色| 99国产综合亚洲精品| 国产成人av激情在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国产精品久久久av美女十八| www.精华液| 嫩草影视91久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 午夜免费成人在线视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 美女午夜性视频免费| 精品日产1卡2卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产一区二区三区视频了| 电影成人av| 欧美成人午夜精品| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲全国av大片| 精品无人区乱码1区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久久人人人人人| 日本wwww免费看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产野战对白在线观看| 中文字幕色久视频| 国产男靠女视频免费网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲精品中文字幕在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产男靠女视频免费网站| 成人国语在线视频| 欧美在线黄色| 高清在线国产一区| 天堂动漫精品| 亚洲av片天天在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产欧美网| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 超碰成人久久| 51午夜福利影视在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中文欧美无线码| 18禁观看日本| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美黑人精品巨大| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线视频色国产色| 国产片内射在线| 色综合站精品国产| 精品久久久精品久久久| 大型av网站在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男人操女人黄网站| 亚洲专区中文字幕在线| 两人在一起打扑克的视频| 国产三级在线视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 天堂√8在线中文| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 两性夫妻黄色片| 波多野结衣高清无吗| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产xxxxx性猛交| 一级片'在线观看视频| 国产成年人精品一区二区 | 欧美+亚洲+日韩+国产| e午夜精品久久久久久久| 国产真人三级小视频在线观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 9热在线视频观看99| 国产黄色免费在线视频| 午夜视频精品福利|