基于納米金/石墨烯修飾的超靈敏己二烯雌酚電化學生物傳感器

張 潔，吳 珺，王傳現，邵科峰，陳昌云，趙 波，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.南京師范大學化學與材料科學學院，南京 210097）

基于納米金/石墨烯修飾的超靈敏己二烯雌酚電化學生物傳感器

張 潔1，吳 珺2，王傳現1，邵科峰2，陳昌云2，趙 波2，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.南京師范大學化學與材料科學學院，南京 210097）

利用納米金/石墨烯復合納米材料以及己二烯雌酚小分子修飾電極，研制了一種新型的超靈敏己二烯雌酚復合納米電化學生物傳感器；制備了己二烯雌酚抗原和多克隆抗體；并以K3Fe（CN）6為探針，利用己二烯雌酚抗體與半抗原之間的競爭反應實現了對己二烯雌酚的超靈敏電化學免疫檢測。結果表明：納米金/石墨烯復合納米材料具有優(yōu)異的增敏性和可修飾性。研制的復合納米電化學生物傳感器具有很高的檢測靈敏度，己二烯雌酚質量濃度在1～6 000 ng/mL的范圍有良好的線性關系，檢測限可達到0.05 ng/mL；傳感器修飾己二烯雌酚小分子具有簡單、重復性和穩(wěn)定性好的優(yōu)點。對豬肉、鴨肉、牛肉以及奶粉實際量品進行了己二烯雌酚含量的分析，平均回收率在96.5%～103.7%之間，結果令人滿意。

納米金；石墨烯；復合納米材料；電化學生物傳感器；己二烯雌酚

張潔， 吳珺， 王傳現， 等. 基于納米金/石墨烯修飾的超靈敏己二烯雌酚電化學生物傳感器［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 201-206. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608036. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jie， WU Jun， WANG Chuanxian， et al. A supersensitive electrochemical immunosensor based on gold nanoparticle/ graphene composite modified electrode for dienestrol detection［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 201-206. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608036. http://www.spkx.net.cn

己二烯雌酚（結構如圖1所示）是一類作用很強的環(huán)境激素，大量使用后會干擾人的內分泌、造成胎兒畸形、誘發(fā)生殖器病變與腫瘤等多種病變，是動物源性食品和環(huán)境中檢出率最高、危害最嚴重的化學性殘留危害物之一。我國、歐盟、日本和美國都將其列為不能在任何動物制食品以及這些動物的飼料和生長環(huán)境中使用的禁用獸藥。檢測技術是危害物監(jiān)管的關鍵環(huán)節(jié)，而己二烯雌酚的檢測方法目前主要集中在色譜法［1-5］，鮮見有效的快速檢測方法。

圖1　己二烯雌酚結構式Fig.1 Structure of dienestrol

生物傳感器是利用生物活性物質的專一識別功能，有選擇地檢測待測物。它以選擇性好、不需要量品復雜預處理能直接應用于復雜量品的檢測等特點而受到廣泛重視［6-7］。構建己二烯雌酚高靈敏快速檢測的生物傳感器的關鍵環(huán)節(jié)包括：1）高靈敏和適合于固定生物活性分子的傳感器表面構建；2）能特異性識別待測物的抗原抗體。

納米金和石墨烯因其具有獨特的電子特性和表面微結構、高的表面活性、強吸附力等優(yōu)異特性［8-10］，可在增加生物分子的吸附量和穩(wěn)定性的同時提高生物分子的催化活性，從而大大增加傳感器的靈敏度［11-16］，在食品安全［17-18］、環(huán)境和藥物小分子［19-23］的檢測等領域得到重視。本實驗研制己二烯雌酚抗原抗體；將納米金/石墨烯復合材料組裝于工作電極表面，并修飾己二烯雌酚小分子；將復合納米技術、免疫分析技術和電化學傳感技術有機結合，研制速度快、靈敏度高、不用酶標記等優(yōu)點的超靈敏己二烯雌酚電化學檢測生物傳感器。與修飾生物大分子的傳感器相比，修飾小分子具有機理清楚、簡單可控、穩(wěn)定性和重復性好等優(yōu)點。是未來分析檢測領域的重要發(fā)展方向之一，具有重要的實際意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

己二烯雌酚、K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］ 美國Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京元亨圣馬生物技術研究所；KCl 國藥集團化學試劑公司；HAuCl4南京化學試劑有限公司；磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）：0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4溶液按一定比例配得。其他試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2儀器與設備

CHI852C電化學工作站、CHI660E電化學工作站上海辰華儀器有限公司；PHS-3E型pH計 上海今邁儀器儀表有限公司；FA1004分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JSM-7600F型高分辨熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3方法

1.3.1石墨烯和傳感器的制備

石墨烯通過采用Hummers法制備［24-25］。玻碳電極分別用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨成鏡面，然后超聲清洗，利用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法對該電極的峰電流的差值進行檢測，保證峰電流差值小于100 mV。

通過電化學沉積法在0.1 g/L的HAuCl4溶液中將納米金粒子電鍍至玻碳電極表面，再分別滴加4 μL 2.5 g/L石墨烯懸浮液和2 μL 0.2 g/L的己二烯雌酚標準溶液，晾干后用5%的BSA對電極表面的活性位點進行封閉。

1.3.2己二烯雌酚多克隆抗體的制備

1.3.2.1己二烯雌酚免疫抗原的合成

將97 mg己二烯雌酚半抗原加入6.5 mL二氧六環(huán)使其溶解，并加入40 μL氯甲酸異丁醋反應30 min后，再與溶于330 mg BSA 18 mL的50%二氧六環(huán)溶液的進行反應。將pH值調整至8.0左右，在4 ℃條件下攪拌過夜。經過72 h透析后，4 ℃條件下離心，冰凍干燥，制得己二烯雌酚免疫抗原。

1.3.2.2己二烯雌酚多克隆抗體的制備

采用雄性大耳兔為免疫動物，以己二烯雌酚抗原為免疫原，免疫劑量為1.5 mg/kg。首次免疫時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，背部皮下多點注射。間隔2 周用弗氏不完全佐劑替換弗氏完全佐劑進行加強免疫，劑量、方法同首免。最后一次免疫不加佐劑，7 d后心臟采血，以間接酶聯免疫吸附實驗法測定血清抗體效價，并用硫酸化沉淀法得到純化的己二烯雌酚多克隆抗體，-20 ℃保存。

1.3.3紫外-可見吸收光譜的檢測

將修飾電極所用石墨烯懸浮液和己二烯雌酚混合液，晾干后，通過超聲處理分散溶解于蒸餾水中，通過紫外-可見光譜測定來研究混合物與標準液吸收波長的變化。

1.3.4實際量品前處理

稱取適量的豬肉（鴨肉、牛肉）肌肉組織置于量品管中，在量品管中加入一定量的己二烯雌酚標準溶液混合后，使用乙腈-丙酮提取液對量品進行提取，提取液使用氮氣吹干后，加入PBS并混合均勻待用。

稱取適量的奶粉量品置于量品管中，同量加入一定量的己二烯雌酚標準溶液混合后，使用正己烷作為提取液對量品進行提取，提取液使用氮氣吹干后，加入PBS混合均勻待用。

1.3.5檢測方法與實驗原理

本實驗采用三電極體系，其中工作電極為玻碳電極，參比電極為Ag/AgCl參比電極，對電極為鉑絲電極。通過CV法以及電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectrum，EIS）法對傳感器進行電化學表征，使用差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法進行實驗條件優(yōu)化，并實現對己二烯雌酚的檢測。

己二烯雌酚的檢測是基于孵育液中的抗體和半抗原與電極表面修飾的半抗原之間的競爭，己二烯雌酚與己二烯雌酚多克隆抗體存在很強的特異性結合，將制備好的傳感器在含有抗體以及游離的己二烯雌酚的孵育液中進行孵育時，修飾于電極表面的己二烯雌酚和游離的己二烯雌酚都能與抗體進行競爭結合。孵育液中半抗原與抗體結合的越多，則與電極表面固定的半抗原就結合的少，反之電極表面固定的的半抗原與抗體結合的多，與游離的半抗原就結合的少。

通過DPV來檢測游離半抗原與固定半抗原和抗體之間進行結合時產生的電流響應的變化，從而實現對己二烯雌酚的檢測。如圖2所示為納米金/石墨烯/己二烯雌酚生物傳感器檢測己二烯雌酚過程原理圖。

圖2　生物傳感器檢測己二烯雌酚過程原理圖Fig.2 Principle of the electrochemical immunosensor for dienestrol detection

2　結果與分析

2.1修飾電極的表征

2.1.1掃描電鏡

圖3a顯示，電極表面的納米金粒徑在200～250 nm之間，分布均勻。納米金具有優(yōu)異的增敏性和生物相容性，能有效保持生物分子的活性，這是構建生物傳感器的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗對Hummers法制備的石墨烯也進行了形貌表征，圖3b顯示了其典型的片層結構，表面褶皺是由于石墨烯很薄的片層結構容易折疊所導致。石墨烯中的碳原子采取sp2雜化構成的蜂窩狀結構，每個碳的剩余電子形成的大π共軛體系，從而形成優(yōu)良的導電性，加之其很高的比表面積，具備優(yōu)良的可修飾性，是構建高靈敏電化學傳感器的優(yōu)異材料。圖3c和圖3d為同時修飾納米金及石墨烯的電鏡圖，圖中顯示石墨烯片層結構分布在納米金粒子中，說明納米金/石墨烯都已修飾在電極表面。

圖3　納米金以及石墨烯掃描電鏡圖Fig.3 SEM of gold nanoparticles （GNPs）， grapheme and their composite

2.1.2紫外-可見吸收光譜

圖4　修飾電極材料的紫外-可見吸收光譜Fig.4 UV spectra of surface-modifying materials

己二烯雌酚穩(wěn)定地修飾在石墨烯表面是制備傳感器的關鍵環(huán)節(jié)，為了驗證己二烯雌酚小分子成功地修飾在了電極表面，分別對修飾電極的己二烯雌酚標準溶液、石墨烯懸濁液以及石墨烯/己二烯雌酚混合溶液進行了紫外-可見吸收光譜的測定。由圖4可知，己二烯雌酚標準溶液在228.5 nm波長處有明顯的吸收峰，石墨烯沒有明顯的吸收峰，石墨烯-己二烯雌酚復合物則在226.5 nm波長處有紫外吸收峰與己二烯雌酚的特征吸收峰相近。己二烯雌酚通過物理吸附方式修飾于石墨烯表面，它們之間可能包括兩個方面的作用力：一方面是，由于石墨烯具有電子富集性的大π共軛體系，會與己二烯雌酚的羥基之間容易形成氫鍵；另一方面是，己二烯雌酚結構中的苯環(huán)也是大π共軛結構，與石墨烯的大π共軛體系可形成π…π作用。這兩種分子間作用力影響了己二烯雌酚的電子性質，從而使其電子光譜發(fā)生了變化。由此可見，己二烯雌酚小分子已經被固定在石墨烯表面。

2.1.3電化學表征

圖5　不同修飾電極的CV法圖譜Fig.5 CV of different modified electrodes

通過CV法以及EIS研究修飾電極不同階段的界面性質。傳感器以K3［Fe（CN）6］為標記物，在含有2 mmol/L K3［Fe（CN）6］的PBS溶液中進行CV圖譜的掃描，其結果如圖5所示。曲線a為裸電極在K3［Fe（CN）6］中表現出一對明顯的氧化還原峰。在電極表面修飾納米金（曲線b）以及石墨烯（曲線c）后氧化還原峰發(fā)生了明顯的增強，己二烯雌酚不具有電化學活性故對曲線c的峰電流沒有影響。將制備好的納米金/石墨烯/己二烯雌酚傳感器浸入含有己二烯雌酚多克隆抗體的孵育液中孵育后，再對該電極進行CV測定，如曲線d所示，孵育液中的抗體與電極表面修飾的半抗原發(fā)生了免疫結合，形成的復合物附著在電極上，阻礙電子傳遞導致峰電流下降。這同時也可以證明己二烯雌酚以及抗體已經固定在電極表面了。

另外，制備好的傳感器在含有0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］溶液中進行EIS的測定。圖6展示了不同修飾電極在修飾過程中典型的Nyquist圖，圖中在高頻區(qū)顯示出的半圓弧形直徑代表電荷轉移電阻。曲線a與插入圖為裸電極的電化學阻抗。在裸電極表面經過電化學沉積納米金后，修飾電極的電荷轉移電阻值相對于裸電極有很大的減小（曲線b）。該修飾電極的電荷轉移電阻值隨著石墨烯的修飾進一步減小（曲線c）。己二烯雌酚不具有電化學活性，對電荷轉移電阻并無影響（曲線d）。用BSA封閉活性位點后，傳感器在含有己二烯雌酚多克隆抗體孵育液中進行孵育，抗體與電極表面修飾的己二烯雌酚發(fā)生了免疫結合形成了半抗原-抗體復合物，復合物具有不導電性阻礙了回路中電子的傳遞，電荷轉移電阻值增加（曲線e）。電化學抗阻圖譜結果表明己二烯雌酚以及抗體已經固定在電極表面，這與CV圖譜結果顯示一致。

圖6　不同修飾電極的EIS圖Fig.6 EIS of different modified electrodes

2.2檢測己二烯雌酚影響因素的優(yōu)化

圖7　檢測己二烯雌酚影響條件的優(yōu)化Fig.7 Optimization of experimental conditions for detecting dienestrol

2.2.1孵育時間的優(yōu)化

為了讓半抗原和抗體在孵育過程中能夠完全競爭結合，在實驗過程中孵育時間尤為重要。首先對孵育時間進行優(yōu)化，將傳感器在含有相同質量濃度的己二烯雌酚抗體的PBS溶液中分別進行不同時間的孵育，用PBS沖洗后進行DPV掃描。如圖7a所示，在30 min前，己二烯雌酚半抗原與己二烯雌酚多克隆抗體發(fā)生了競爭結合，形成的半抗原-抗體復合物，阻礙電極表面電子的傳遞，導致了DPV相應電流值的逐漸下降。在30 min之后，傳感器表面的半抗原與孵育液中的半抗原跟抗體的競爭幾乎達到了平衡，電極表面的復合物不再增加，響應電流值不在下降。延長孵育時間對DPV峰電流值影響不大，故選取30 min作為競爭結合的最優(yōu)時間。

2.2.2孵育液中抗體量的優(yōu)化

半抗原與抗體的競爭結合時提供的抗體量也是影響實驗的重要因素。將傳感器在50 μL含有不同量己二烯雌酚抗體的PBS溶液中分別進行孵育30 min，用PBS沖洗后進行DPV進行掃描。結果如圖7b所示，隨著抗體量不斷增加，電流響應值也不斷下降。當抗體添加量達到6 μL后，固定在電極表面的己二烯雌酚和孵育液中己二烯雌酚與抗體競爭幾乎達到了平衡，不再形成半抗原-抗體復合物，響應電流值幾乎不變，再增加孵育液中抗體量對DPV峰電流值影響不大，故選取6 μL作為孵育時的最優(yōu)抗體量。

2.3己二烯雌酚的檢測結果

圖8　己二烯雌酚的檢測Fig.8 Detection of dienestrol

為了實現傳感器對己二烯雌酚的檢測，將傳感器置入含有己二烯雌酚以及其抗體的孵育液中孵育30 min后，使用PBS清洗。如圖8所示，與不含游離己二烯雌酚的DPV響應電流值相比，隨著己二烯雌酚質量濃度的增加響應電流值也隨之增大。定義在孵育液中不含己二烯雌酚時響應電流為I0，Ix為孵育液中含有不同質量濃度己二烯雌酚時所測得的響應電流，響應電流變化值ΔI（ΔI=Ix-I0）與質量濃度在1～6 000 ng/mL范圍內的己二烯雌酚有良好的線性關系（r=0.981 41），最低檢測限可達到0.05 ng/mL。實驗結果表明，由于納米金/石墨烯復合納米材料極好的導電性，使得該生物傳感器實現了對己二烯雌酚寬范圍、超靈敏的檢測。

2.4實際量品的檢測結果

表1　實際樣品（豬肉、鴨肉、牛肉和奶粉）加標處理檢測己二烯雌酚實驗結果Table 1 Recoveries of dienestrol from spiked samples of pork， duck，beef and milk powder

分別對4 種不同的實際量品進行了回收率實驗。經過前處理的量品分別在高、中、低3 個添加量進行各3 次檢測，通過線性關系計算得到回收率。如表1所示，豬肉實際量品的回收率為90.3%～104.4%，鴨肉實際量品的回收率為86.8%～106.0%，牛肉實際量品的回收率為101.7%～109.1%，奶粉實際量品的回收率為91.3%～111.1%。結果表明，制備的納米金/石墨烯/己二烯雌酚傳感器具有很好的實用性，完全適用于動物源性食品中己二烯雌酚的檢測。

2.5納米金/石墨烯/己二烯雌酚生物傳感器的以穩(wěn)定性及重復性

生物傳感器的重復性以及穩(wěn)定性對該傳感器是很重要的衡量指標。本實驗利用DPV法，對傳感器的穩(wěn)定性進行了測試。將制備的生物傳感器重復在2 mmol/L的K3［Fe（CN）6］溶液中進行掃描10 次，該傳感器的響應電流變化值相對標準偏差小于10%，結果表明成功研制了基于納米金/石墨烯復合材料，具有很好穩(wěn)定性的新型電化學生物傳感器。

本實驗還對該傳感器的重復性進行了研究。將制備的生物傳感器放置在空氣中，每天對該傳感器進行DPV掃描，經過7 d測得生物傳感器的響應電流變化值相對標準偏差小于10%，結果表明該傳感器的重復性可以接受。

3　結 論

本實驗成功研制了一種通過半抗原-抗體競爭，用于檢測己二烯雌酚的超靈敏電化學生物傳感器?；陔姌O表面沉積納米金顆粒以及修飾石墨烯這兩種復合納米材料，納米金和石墨烯良好的生物相容性以及導電性，提高了傳感器檢測靈敏度、穩(wěn)定性以及重復性。該傳感器具有快速、靈敏、價格低、檢測限低以及檢測范圍廣的特點，可以實現對己二烯雌酚的快速檢測。這種生物傳感器的研制在檢測方面存在著巨大潛力，有著良好的前景，為實現更多快速檢測提供了參考。

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A Supersensitive Electrochemical Immunosensor Based on Gold Nanoparticle/Graphene Composite Modified Electrode for Dienestrol Detection

ZHANG Jie1， WU Jun2， WANG Chuanxian1， SHAO Kefeng2， CHEN Changyun2， ZHAO Bo2，*
（1. College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China；2. College of Chemistry and Material Science， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

A novel electrochemical immunosensor was developed by modifying the electrode with gold nanoparticles/ graphene composite material. The immunogen was prepared by conjugating dienestrol （hapten） to the carrier protein （bovine serum albumin） and used to generate polyclonal antibodies. Cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry were employed to monitor the fabrication process of immunoreaction system in solutions containing the redox probe K3Fe（CN）6. The results revealed that gold nanoparticle/grapheme composites could effectively modify the electrode and enhance its sensitivity. The biosensor showed excellent detection performance with a broad linear range of 1-6 000 ng/mL and a supersensitive detection limit of 0.05 ng/mL. In addition， the biosensor modified with the small molecule of dienestrol had the advantages of simplicity， reproducibility and stability. Good recoveries in the range of 96.5%-103.7% were obtained in the detection of pork， dunk， beef and milk powder samples.

gold nanoparticles； graphene； composite materials； electrochemical biosensor； dienestrol

10.7506/spkx1002-6630-201608036

TS202.3

A

1002-6630（2016）08-0201-06

2015-04-16

江蘇省科技廳科技支撐計劃社會發(fā)展項目（BE2014720）；江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（14）2127）

張潔（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全分析與檢測。E-mail：348657754@qq.com

趙波（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測與預警。E-mail：zhaobo@njnu.edu.cn

引文格式：