微滴數(shù)字PCR法對(duì)肉制品中牛源和豬源成分的定量分析

苗 麗，張秀平，陳 靜，李 軻，王永杰，白 杰

（1.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南 鄭州 450003；2.河南檢驗(yàn)檢疫鑒定咨詢中心，河南 鄭州 450003）

微滴數(shù)字PCR法對(duì)肉制品中牛源和豬源成分的定量分析

苗 麗1，張秀平2，陳 靜2，李 軻2，王永杰2，白 杰2

（1.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南 鄭州 450003；2.河南檢驗(yàn)檢疫鑒定咨詢中心，河南 鄭州 450003）

為準(zhǔn)確檢測(cè)肉及肉制品中肉源成分的含量，實(shí)驗(yàn)基于微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)，建立了定量檢測(cè)肉及肉制品中牛肉和豬肉含量的方法。由ddPCR結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)生鮮肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間均呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，并以DNA含量為中間值計(jì)算出DNA拷貝數(shù)（C）與生鮮肉質(zhì)量之間的換算公式M牛=0.062C-0.943，M豬=0.045C-1.72。應(yīng)用建立的數(shù)字ddPCR方法對(duì)已知目標(biāo)肉種含量的混合肉量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明測(cè)量值和真實(shí)值基本一致，且不受外源物種的干擾。通過對(duì)市售量品的檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出不同量品中牛肉和豬肉的含量，并發(fā)現(xiàn)存在摻假現(xiàn)象，說明該檢測(cè)方法具有良好的市場應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)建立的ddPCR方法在肉及肉制品中牛肉和豬肉含量的定量檢測(cè)方面具有較大的應(yīng)用潛力，可為肉制品真?zhèn)舞b別日常檢測(cè)提供有力的科學(xué)依據(jù)。

微滴數(shù)字PCR；肉制品；DNA拷貝數(shù)；摻雜使假

苗麗， 張秀平， 陳靜， 等. 微滴數(shù)字PCR法對(duì)肉制品中牛源和豬源成分的定量分析［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 187-191.

MIAO Li， ZHANG Xiuping， CHEN Jing， et al. Quantitative analysis of bovine and porcine ingredients in meat products by droplet digital PCR［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 187-191. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608033. http://www.spkx.net.cn

肉及肉制品的“摻雜使假”是食品加工、流通和餐飲中存在的重要問題，由于價(jià)格差異帶來的利益誘惑，驅(qū)使一些不法商販和企業(yè)在牛、羊等高價(jià)肉制品中摻雜一些低廉肉種，用低價(jià)肉經(jīng)過香精處理后冒充高價(jià)肉，嚴(yán)重侵害消費(fèi)者權(quán)益［1-2］。三聚氰胺、瘦肉精、假牛肉事件以及2013年的馬肉風(fēng)波［3］等食品問題層出不窮，政府及檢驗(yàn)檢疫部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)肉及肉制品“摻雜使假”行為的監(jiān)督，而可靠的定性和定量檢測(cè)方法是檢驗(yàn)的關(guān)鍵。

在所有動(dòng)物源性成分的檢驗(yàn)技術(shù)中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)廣泛應(yīng)用于肉及肉制品的定性檢測(cè)［4-6］，特別是熒光定量PCR，不但能用于定性檢測(cè)［7］，還可以根據(jù)反應(yīng)中的循環(huán)數(shù)Ct值與初始DNA模板濃度進(jìn)行相對(duì)定量［8-9］。但是由于普通PCR的擴(kuò)增效率低、定量PCR需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及容易出現(xiàn)假陽性等因素，使得其定量體系需進(jìn)一步完善［10-11］。

微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是準(zhǔn)確定量核酸的一門新的核酸擴(kuò)增技術(shù)［12-13］。將含有DNA或RNA的PCR反應(yīng)體系分成約20 000 個(gè)微滴，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)［14］。由于其不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在低濃度的核酸含量下，也可高度靈敏和準(zhǔn)確的對(duì)核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量，使得ddPCR技術(shù)廣泛用于基因表達(dá)分析［15］、拷貝數(shù)變異分析［16-17］、致病菌檢測(cè)［18］、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)［19］等，具有較好的應(yīng)用前景。

本研究將具有絕對(duì)定量特性的ddPCR應(yīng)用于肉及肉制品中牛肉和豬肉的定量檢測(cè)，旨在探索肉的質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系，通過檢測(cè)量品中不同肉種的質(zhì)量來達(dá)到甄別惡意摻假與輕微沾染的目的，為質(zhì)檢部門打擊不法商販，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，提供有力科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

生鮮牛肉、豬肉、鴨肉、雞肉、羊肉、鵝肉、鵪鶉肉、貂肉、狐貍?cè)獾热饬?；豬肉松、牛肉松、火腿腸、速凍撒尿牛肉丸等牛肉和豬肉制品、小麥粉、大豆粉、玉米粉等購自鄭州某農(nóng)貿(mào)市場。

1.2試劑

Tris-飽和酚 索萊寶生物科技有限公司；蛋白酶K（20mg/mL） 日本Takara公司；ddPCR Master Mix 美國Bio-Rad公司；組織裂解液（1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸、10%十二烷基硫酸鈉）、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）、3 mol/L醋酸鈉溶液均為自配試劑。

1.3儀器與設(shè)備

DT500電子天平 江蘇常熟長青儀器廠；Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；NTS-4000AM恒溫振蕩水槽 日本Tokyo Tikakikai公司；BioSpec-nano微量核酸蛋白儀 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Quest LabCycler梯度PCR儀 德國Senso公司；QX200 ddPCR微滴生成儀 美國Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1引物與探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的牛肉單拷貝β-actin基因序列，通過軟件Meglign對(duì)其特異區(qū)域進(jìn)行多序列的比對(duì)，針對(duì)其保守區(qū)域設(shè)計(jì)牛肉的特異性引物和探針，用FAM熒光染料基團(tuán)標(biāo)記牛探針的5’端，非熒光淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記牛探針的3’端，并滿足數(shù)字PCR的要求。豬源引物和探針引自文獻(xiàn)［20］，引物和探針均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。詳細(xì)序列見表1。

表1　ddPCR的引物和探針Table 1 Primer and probe sequences for quantitative ddPCR assays

1.4.2肉量制備

取新鮮肉量的肌肉組織，絞碎后于烤箱中80 ℃烘干72 h，于組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)處理，作為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品，并用于制作模量混合量品，勻質(zhì)過程中不同肉類分開處理，防止不同動(dòng)物組織粉末交叉污染。

1.4.3DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取基因組DNA［20-21］。向50 mg肉粉里加入700 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，56 ℃水浴2 h，加入等量飽和酚，上下顛倒混勻，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入1/2體積的飽和酚和1/2體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），混勻，10 000 r/min離心10 min；取上清轉(zhuǎn)移至一干凈的EP管中，加入等量氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積的氯仿，10 000 r/min離心10 min；取上清液約400 μL，加入2.5 倍體積的無水乙醇及1/10體積的3 mol/L的醋酸鈉溶液，混勻，-20 ℃沉淀2 h后4 ℃ 12 000 r/min離心30 min；棄上清液，加入1mL 75%乙醇溶液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，自然干燥后加入ddH2O 100 μL溶解DNA，采用核酸定量測(cè)定儀測(cè)定提取肉量的DNA含量，確保提取DNA的OD260nm/OD280nm比值均在1.8～2.0之間，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4ddPCR反應(yīng)程序

20 μL反應(yīng)體系：上下游引物各1.8 μL（900 nmol/L），探針0.5 μL（250 nmol/L），ddPCR Master Mix 10 μL，DNA模板4 μL，其余用無菌水補(bǔ)齊。通過微滴生成儀約生成20 000 個(gè)微滴。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，98 ℃ 10 min，40 個(gè)循環(huán)。最后用微滴分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.4.5引物與探針的特異性

為驗(yàn)證所建ddPCR方法的特異性，將通過試劑盒測(cè)定的牛肉和豬肉陽性量品作為陽性對(duì)照，以羊、雞、鴨、鵝、鵪鶉、貂、狐貍?cè)獾瘸Ｒ娙饧靶←湻?、大豆粉、玉米粉等植物物種等提取的DNA作為模板進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.6肉量質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定

1.4.6.1肉量質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系

分別稱量10 個(gè)質(zhì)量梯度的牛肉和豬肉（含量依次從5～50 mg）量品，提取基因組DNA，運(yùn)用核酸定量測(cè)定儀測(cè)定DNA含量。每個(gè)梯度重復(fù)3 次。相關(guān)系數(shù)R2的計(jì)算用Excel自動(dòng)生成。

1.4.6.2DNA含量與拷貝數(shù)的關(guān)系

將提取的牛肉和豬肉的DNA進(jìn)行系列稀釋后，分別以10 個(gè)DNA質(zhì)量濃度梯度（25～250ng/μL）進(jìn)行ddPCR的檢測(cè)，分析DNA含量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系。每個(gè)梯度重復(fù)3 次。相關(guān)系數(shù)R2的計(jì)算用Excel自動(dòng)生成。

1.4.7ddPCR的抗干擾實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證所建ddPCR方法的抗干擾性，以總質(zhì)量為50 mg，分別稱量10 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%～100%）的牛肉粉與豬肉粉制成兩兩混合量品；同時(shí)分別在牛肉粉與豬肉粉最低含量（10%）時(shí)添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的其他肉種，制成多肉量混合量品。按1.4.3節(jié)的方法提取混合肉量DNA，進(jìn)行10 倍稀釋后，取4 μL進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn)。

1.4.8市售量品的檢測(cè)

分別從某市場中購買牛肉和豬肉制品（豬肉松、速凍肉包、火腿腸、速凍撒尿牛肉丸等），用建立的ddPCR方法對(duì)肉制品中牛源和豬源成分的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證所建方法的準(zhǔn)確性和實(shí)際應(yīng)用能力。

1.5數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Excel進(jìn)行圖表編輯。

2　結(jié)果與分析

2.1引物和探針特異性

為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)選用的牛肉和豬肉引物和探針的特異性，選擇常見肉量及部分植物物種作為DNA模板進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示選取的引物和探針對(duì)其他肉量及植物物種均無交叉反應(yīng)，表明引物和探針的特異性良好，能夠用于牛肉和豬肉含量的檢測(cè)。

2.2DNA提取及含量的測(cè)定

為摸索不同肉量質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系，提取牛肉和豬肉各10 個(gè)質(zhì)量梯度（質(zhì)量依次從5～50 mg）量品的DNA，運(yùn)用核酸定量測(cè)定儀檢測(cè)提取肉量的DNA含量。通過3 次批間重復(fù)，結(jié)果顯示肉的質(zhì)量與其所測(cè)定的DNA含量之間有明顯的線性關(guān)系。牛肉和豬肉的相關(guān)系數(shù)R2分別是0.995 9（圖1）和0.997 7（圖2），表明肉的質(zhì)量在5～50 mg范圍內(nèi)與DNA含量有明顯的線性關(guān)系，即y牛=11.406x+13.602和y豬=11.957x-3.160 7，其中x代表肉的質(zhì)量/mg；y代表所測(cè)得的DNA含量/（ng/μL）。

圖1　牛肉的質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系Fig.1 Linear relationship between meat quantity and nucleic acid content of beef

圖2　豬肉的質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系Fig.2 Linear relationship between meat quantity and nucleic acid content of pork

2.3DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系

為摸索DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系，在ddPCR檢測(cè)最高核酸質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，將提取的牛肉和豬肉DNA進(jìn)行10 個(gè)梯度的系列稀釋（25～250 ng/μL），取4 μL模板進(jìn)行ddPCR的檢測(cè)。結(jié)果顯示在ddPCR檢測(cè)過程中，每個(gè)量品的微滴生成均在15 000以上，滿足了絕對(duì)定量的要求，且DNA含量與其所生成的DNA拷貝數(shù)之間有明顯的線性關(guān)系。牛肉和豬肉的相關(guān)系數(shù)R2分別是0.999 0（圖3）和0.999 2（圖4），表明核酸的含量在100～1 000 ng范圍內(nèi)與拷貝數(shù)呈明顯的線性關(guān)性，即y牛=3.526 2x-4.008 2和y豬=4.626 4x+43.857，其中x代表所加模板DNA總量/ng；y代表所測(cè)得的DNA拷貝數(shù)/（copies/μL）。

圖3　牛肉DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系Fig.3 Linear relationship between nucleic acid content and DNA copy number of beef

圖4　豬肉DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系Fig.4 Linear relationship between nucleic acid content and DNA copy number of pork

2.4肉量質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定結(jié)果

根據(jù)肉量的質(zhì)量與所提取DNA含量之間的線性關(guān)系，及DNA含量與所測(cè)定DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，選擇DNA含量作為中間值，計(jì)算肉量的質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系，從而達(dá)到通過測(cè)定DNA拷貝數(shù)來計(jì)算原始肉量質(zhì)量的目的。牛肉質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系式：M牛=0.062C-0.943；豬肉質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系式：M豬=0.045C-1.72，其中C代表每微升的DNA拷貝數(shù)/（copies/μL）；M代表肉量的質(zhì)量/mg。

2.5已知質(zhì)量混合肉量的數(shù)字PCR抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　已知質(zhì)量的多種混合肉樣的ddPCR定量分析Table 2 Results of quantification of samples with known concentration

為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，分別對(duì)已知目標(biāo)肉量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合量品提取DNA，進(jìn)行10 倍稀釋后，取4 μL進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，將DAN拷貝數(shù)值代入肉量質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系式中計(jì)算肉量質(zhì)量。結(jié)果顯示測(cè)得的數(shù)值與真實(shí)肉量基本一致，并且不受外源肉量的干擾（表2），表明所建立的ddPCR方法可以應(yīng)用于不同肉制品中牛源和豬源成分的定量檢測(cè)。

2.6市售量品的檢測(cè)結(jié)果

表3　市售樣品的ddPCR定量分析Table 3 Results of quantification of samples from local supermarket %

使用本研究建立的ddPCR方法，對(duì)市售肉制品中的牛源和豬源成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，其中兒童牛肉松和兒童豬肉松中牛肉和豬肉含量約為30%，經(jīng)ddPCR測(cè)定后牛肉和豬肉的含量分別為27.8%和26.6%；速凍撒尿牛肉丸成分包含豬肉、雞肉和牛肉，經(jīng)檢測(cè)牛肉含量僅為2.41%，相對(duì)含量較少。對(duì)牛肉卷的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，牛肉含量占2.5%，而豬肉含量占36%，這表明市售肉制品存在摻假現(xiàn)象。通過一系列的市售食品的定量檢測(cè)，驗(yàn)證了建立的牛肉和豬肉定量ddPCR檢測(cè)體系的實(shí)際應(yīng)用能力，可以用來甄別無意沾染與故意摻假以及衡量肉制品的摻假程度。

3　討 論

食品安全、質(zhì)量和原料組成成分等問題已經(jīng)越來越多的受到公眾的關(guān)注［22-23］，而傳統(tǒng)的依靠感官與經(jīng)驗(yàn)鑒別的手段已遠(yuǎn)不能滿足對(duì)市售肉制品摻假現(xiàn)象進(jìn)行控制和監(jiān)管的需要，建立有效地測(cè)定肉源成分的檢測(cè)方法是諸多研究人員研究的熱點(diǎn)。

定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測(cè)定核酸含量［9，24-25］，而ddPCR能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始量品的絕對(duì)定量［12，14］。因此特別適用于檢測(cè)依靠Ct值不能很好分辨、以及目的核酸含量較低的量品。

本研究通過ddPCR分析了牛肉和豬肉量品的質(zhì)量與拷貝數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間均具有明顯的線性關(guān)系，建立了肉質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的換算公式，證明了ddPCR技術(shù)可以應(yīng)用于肉及肉制品中種源成分的定量分析。這對(duì)于市售量品中某種肉源成分的無意沾染或有意添加可以進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，由于檢測(cè)過程不需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接增加了檢測(cè)效率，使得肉制品中摻假行為能夠快速準(zhǔn)確的檢出。

本研究建立的檢測(cè)體系主要著眼于市售肉及肉制品，鑒于其成分復(fù)雜，肉種多量，本研究制備了已知目標(biāo)肉種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合肉量來檢驗(yàn)所建體系的抗干擾能力，結(jié)果顯示本研究建立的牛源和豬源的檢測(cè)體系無論在兩兩混合還是多肉量混合的情況下，抗干擾能力都很強(qiáng)，與實(shí)際質(zhì)量相差不大。

為進(jìn)一步驗(yàn)證所建方法的實(shí)際應(yīng)用能力，選取含有目標(biāo)肉種的市售加工食品進(jìn)行檢測(cè)。牛肉和豬肉ddPCR檢測(cè)體系都能夠特異性地檢出各種肉制品中的目標(biāo)肉種的含量。通過兩種檢測(cè)體系的聯(lián)用，還可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)是否摻雜標(biāo)簽未注明肉類，如本研究發(fā)現(xiàn)某品牌牛肉卷中牛肉含量占2.5%，而豬肉含量占36%，說明牛肉卷中摻雜有大量的豬肉成分，證明市場上確實(shí)存在用低價(jià)肉冒充高價(jià)肉的摻假現(xiàn)象。

綜上所述，本研究所建立的ddPCR檢測(cè)體系彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷，更加快速、準(zhǔn)確、靈敏，且可以進(jìn)行絕對(duì)定量，可滿足當(dāng)前食品中種源性成分摻假的定量檢測(cè)，尤其是應(yīng)用于清真食品檢測(cè)，以及保護(hù)對(duì)某種肉（牛、豬）成分過敏者，為質(zhì)檢部門打擊不法商販的食品摻假、造假行為，維護(hù)消費(fèi)者合法利益提供有力的科學(xué)依據(jù)。

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Quantitative Analysis of Bovine and Porcine Ingredients in Meat Products by Droplet Digital PCR

MIAO Li1， ZHANG Xiuping2， CHEN Jing2， LI Ke2， WANG Yongjie2， BAI Jie2
（1. Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhengzhou 450003， China；2. Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine， Zhengzhou 450003， China）

A highly precise quantitative method based on the droplet digital polymerase chain reaction （ddPCR） technique was developed to detect bovine and porcine ingredients in meat products. By using the ddPCR method， we found good linear relationships between the raw meat weight and DNA content and between the DNA content and DNA copy number. Using the DNA content as an intermediate value， we established the following formulae for calculating the weight of the original raw meat from the specific DNA copy number: Mbeef= 0.062C - 0.943，Mpork= 0.045C - 1.72. By examining the mixed meat samples of known compositions， we found that the final quantitative results for the mixed samples were similar to the true raw meat weights， free from interference from exogenous species. Analysis of commercial samples showed that the ddPCR quantification system enables determination of the proportions of bovine and porcine ingredients in meat products with good practicability. Quantitative analysis indicates that ddPCR is highly precise in quantifying beef and pork in meat products and therefore has the potential to be used in routine analysis and meat adulteration of various species.

droplet digital polymerase chain reaction； meat products； DNA copy number； meat adulteration

10.7506/spkx1002-6630-201608033

TS207.3

A

1002-6630（2016）08-0187-05

10.7506/spkx1002-6630-201608033. http://www.spkx.net.cn

2015-07-10

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK089）

苗麗（1971—），女，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)及食品微生物學(xué)。E-mail：ml5628@163.com

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