龍眼果肉提取物改善東莨菪堿誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能

白亞娟，劉 磊，張瑞芬，鄧媛元，黃 菲，張名位

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龍眼果肉提取物改善東莨菪堿誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能

白亞娟1，2，劉 磊1，張瑞芬1，鄧媛元1，黃 菲1，張名位1，2

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510610；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 410070）

【目的】比較不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物對東莨菪堿所致記憶獲得性障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，初步解釋龍眼果肉改善學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制?！痉椒ā糠治鳊堁酃獯继嵛锖退嵛镏兄饕钚晕镔|(zhì)含量。將無特定病原體（SPF級）雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、龍眼果肉醇提物低劑量組/高劑量組（150 mg·kg-1/300 mg·kg-1）、龍眼果肉水提物低劑量組/高劑量組（150 mg·kg-1/300 mg·kg-1），共6組，連續(xù)灌胃28 d后，空白組腹腔注射等量生理鹽水，各試驗(yàn)組腹腔注射東莨菪堿造模，0.5 h后，以潛伏期和穿梭次數(shù)為考察指標(biāo)，采用避暗試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測試，作為習(xí)得成績；24 h后再次進(jìn)行避暗試驗(yàn)，對小鼠進(jìn)行記憶保持測試，測試結(jié)束后摘眼球取血，脫頸致死，取腦組織進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。測定腦組織的膽堿類（乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶choline acetyltransferase，ChAT和乙酰膽堿酯酶acetylcholinesterase，AChE活力）及抗氧化相關(guān)指標(biāo)（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量），血清中抗氧化相關(guān)指標(biāo)（SOD、GSH-Px活力及MDA含量）。通過綜合比較各組間行為學(xué)試驗(yàn)指標(biāo)、腦組織、血清生化指標(biāo)，判斷龍眼果肉改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用效果及作用機(jī)制。【結(jié)果】分析龍眼果肉提取物成分發(fā)現(xiàn)，龍眼果肉水提物主要為多糖及蛋白質(zhì)，醇提物除含有糖類外，還含有較豐富的酚類、黃酮類和磷脂物質(zhì)，其中，醇提物中總酚、總黃酮、總磷脂含量顯著高于水提物的（＜0.05）。行為學(xué)試驗(yàn)表明，模型組小鼠在避暗試驗(yàn)中5 min內(nèi)穿梭次數(shù)為2.89次，是正常小鼠的6.09倍，高劑量龍眼果肉醇提物和水提物組小鼠穿梭次數(shù)分別為0.75次和0.56次，與正常組無顯著差異；癡呆小鼠在避暗試驗(yàn)中的潛伏期僅為正常組的0.43倍,與模型組相比，各劑量龍眼果肉醇提物和水提物均能顯著增加癡呆小鼠在避暗試驗(yàn)中的潛伏期（＜0.05），且存在一定劑量效應(yīng)關(guān)系，其中龍眼果肉醇提物和水提物高劑量組小鼠的避暗潛伏期分別為289.18 s、290.80 s，與正常組相比無顯著差異（＞0.05）。生化指標(biāo)方面，與模型組相比，各劑量龍眼果肉醇提物和水提物均能顯著增加癡呆小鼠腦組織中ChAT活力，顯著降低AChE活力（＜0.05），且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。相同劑量時(shí)，龍眼果肉水提物效果優(yōu)于醇提物，其中龍眼果肉醇提物高劑量組，龍眼果肉水提物低、高劑量組小鼠腦組織中ChAT活力基本恢復(fù)正常水平；在抗氧化水平方面，與模型組相比，龍眼果肉醇提物高劑量組顯著增加癡呆小鼠腦組織和血清中SOD、GSH-Px活力，顯著降低MDA含量（＜0.05），基本達(dá)到正常水平，效果優(yōu)于同等劑量的龍眼果肉水提物?！窘Y(jié)論】龍眼果肉水提物和醇提物均可改善東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，但二者的作用機(jī)制可能存在差異，龍眼果肉水提物主要通過調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)改善學(xué)習(xí)記憶功能，其主要作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能為多糖或糖蛋白；醇提物則主要通過提高機(jī)體抗氧化活力改善學(xué)習(xí)記憶功能，其主要作用物質(zhì)可能為多酚、黃酮、磷脂等。

龍眼果肉；東莨菪堿；學(xué)習(xí)記憶功能；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶; 抗氧化

0 引言

【研究意義】龍眼(lour.)作為中國重要的藥食同源食材，其果肉的養(yǎng)血安神、益智寧心、補(bǔ)益心脾等功效在《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等中國古代醫(yī)藥書上早有記載[1]。雖然藥用歷史已有上千年，但龍眼補(bǔ)益心智的功效缺少科學(xué)依據(jù)支撐，其活性成分仍不明確。記憶力損傷和認(rèn)知障礙是阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）的主要臨床表現(xiàn)，這種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病主要發(fā)生在老年期，嚴(yán)重危害老年人的身心健康。長期食用龍眼有改善記憶、防治AD的功效。因此，通過動(dòng)物試驗(yàn)探討龍眼果肉醇提物和水提物對記憶獲得性障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，初步分析龍眼果肉醇提物和水提物主要活性成分及含量，對進(jìn)一步明確龍眼果肉益智機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國內(nèi)外關(guān)于天然植物改善AD已有許多研究，腦內(nèi)乙酰膽堿水平下降是AD主要伴隨癥狀之一[2]，因此有效提高乙酰膽堿可以改善AD。RABIEI等[3]發(fā)現(xiàn)百香果醇提物可以縮短東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙大鼠在避暗試驗(yàn)中的潛伏期，通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿相關(guān)酶類改善其記憶能力。李富仁等[4]研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志茯苓醇提物能夠通過抑制乙酰膽堿酯酶活力改善東莨菪堿誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。YANG等[5]研究表明金針菇多糖通過調(diào)節(jié)海馬和大腦皮層中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性來修復(fù)東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙小鼠腦中乙酰膽堿水平，從而改善記憶能力。此外，氧化應(yīng)激在AD發(fā)病機(jī)制中也起著重要的作用，是自由基氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡所致[6]，因此，抗氧化也是改善AD有效途徑之一。FOYET等[7]發(fā)現(xiàn)（菊科）葉甲醇-水提取物可以提高東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙大鼠空間記憶能力及腦組織內(nèi)抗氧化能力。王丹等[8]的研究表明遠(yuǎn)志水提取物能通過增強(qiáng)小鼠自由基清除能力提高正常小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。龍眼改善記憶的功能在古代醫(yī)書上早有記載，而采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段研究其作用機(jī)制從近些年才開始。PARK等[9]發(fā)現(xiàn)龍眼果肉水提物顯著延長小鼠在避暗試驗(yàn)中的潛伏期，增加了海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurophic factor，BDNF）表達(dá)及未成熟神經(jīng)細(xì)胞的生成，對其他作用機(jī)制如膽堿能系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)并未涉及。駱萍等[10]研究發(fā)現(xiàn)龍眼果肉水提物、醇提物均可以顯著改善大鼠在Morris水迷宮中的空間記憶能力，并從抗氧化系統(tǒng)角度對其作用機(jī)制進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)龍眼果肉提取物可顯著提高腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧物酶（GSH-Px）酶活，減少丙二醛（MDA）生成，且有一定劑量效應(yīng)關(guān)系，表明龍眼果肉提取物可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力達(dá)到改善記憶功能，但其未對提取物的化學(xué)成分作進(jìn)一步分析。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于龍眼果肉的生物活性的研究，目前國內(nèi)外主要集中于免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等[11-16]，對其改善學(xué)習(xí)記憶功能的研究較少，其活性成分及作用機(jī)制仍不明確、不完善?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對龍眼果肉醇提物和水提物主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，選用急性腹腔注射東莨菪堿建立記憶損傷小鼠模型，比較不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物對癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，分析其對血清抗氧化系統(tǒng)及腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)的影響，為揭示龍眼改善學(xué)習(xí)記憶功能及作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年3—9月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與供試動(dòng)物

1.1.1 材料、藥品與試劑 龍眼果干（含水量為12.40%），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供，品種為‘儲良’；氫溴酸東莨菪堿注射液（scopolamine hydrobromide injection）購于徐州萊恩藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和總蛋白質(zhì)（total protein，TP）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、香草酸、蘆丁、鞣花酸、阿魏酸、異阿魏酸、水楊酸、香豆酸及鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司，甲酸、乙酸、乙腈為色譜純試劑，購于美國Fisher公司。95%乙醇（分析純）購于天津市大茂化學(xué)試劑廠，其余試劑均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性KM小鼠，體重20—25 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（粵）2011-0015。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（23±2）℃，相對濕度50%—60%，12/12 h 明暗交替，自由飲食、攝水。小鼠于試驗(yàn)前7 d置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境。

1.2 主要儀器

避暗系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），SB-5200TD超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），F(xiàn)DU-2110真空冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會社），EYELA CA-2600旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社），UV1800 型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津有限公司），多功能熒光分析儀 Fluoroskan Ascent FL（美國Thermo Fisher Scientific公司），HZQQX 型全溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子開發(fā)有限公司），冷凍離心機(jī)（美國Thermo Electron公司），DS-1 高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）、Agilent Technologies 1260 Series、6890N-5975B GC-MS （美國Agilent公司）。

1.3 龍眼果肉提取物的制備

1.3.1 龍眼果肉醇提物的制備 取一定量的龍眼干果肉，按1﹕4（m/v）加入95%乙醇打漿，室溫浸泡1 h，超聲提取30 min，如此反復(fù)2次，離心（4 000 r/min，10 min）收集上清液，濾渣重復(fù)提取1次，合并上清液。55℃減壓濃縮至無乙醇蒸出，此濃縮浸膏即為龍眼果肉醇提物（含水量為10.86%）。

1.3.2 龍眼果肉水提物的制備 在1.3.1離心后的沉淀物中以1﹕20（m/v）加入蒸餾水，按1.3.1的方法提取，收集上清液。將濾渣用1﹕5的蒸餾水復(fù)提一次，合并上清液，減壓濃縮后加95%乙醇沉降（終濃度為80%），4℃冷藏過夜，離心收集沉淀物用無水乙醇洗滌3次，冷凍干燥得龍眼果肉水提物。

1.4 龍眼果肉提取物主要活性成分含量分析

分別對龍眼果肉醇提物和水提物的主要活性成分含量進(jìn)行如下分析：總糖含量通過苯酚-硫酸法測定，采用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品[17]。還原糖用DNS法測定，采用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品[18]。多糖總量為總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差值。蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品?？偡油ㄟ^福林酚法測定，沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品[19]。總黃酮通過三氯化鋁法測定，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品[20]?？偭字坎捎勉f藍(lán)比色法測定，以磷酸二氫鉀溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品[21]。單糖組成通過GC-MS測定[22]。酚類組成通過HPLC測定[23]。

1.5 動(dòng)物分組及處理

將72只小鼠隨機(jī)分成6組，每組12只，分別為：空白組、模型組、龍眼果肉醇提物低劑量組（150 mg·kg-1）、龍眼果肉醇提物高劑量組（300 mg·kg-1）、龍眼果肉水提物低劑量組（150 mg·kg-1）、龍眼果肉水提物高劑量組（300 mg·kg-1）。各劑量以提取物干基計(jì)，參照龍眼干果肉每日攝取量（9—15 g）[24]基于人-動(dòng)物劑量轉(zhuǎn)換公式[25]得到，并參考文獻(xiàn)[9]做一定調(diào)整。各組均按10 ml?kg-1?b.w.-1灌胃給藥（空白組和模型組灌胃生理鹽水），每天一次，連續(xù)28 d。在最后一次給藥1 h后，除空白組腹腔注射生理鹽水外，其他組均腹腔注射東莨菪堿（3 mg?kg-1?b.w.-1）制備小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，并于注射20 min后進(jìn)行避暗試驗(yàn)。

1.6 避暗試驗(yàn)

方法參考DONG等[26]進(jìn)行并做一些改進(jìn)，該試驗(yàn)分為習(xí)得測試（Acquisition trial）和記憶保持測試（Retention trial）兩部分。

小鼠灌胃第26天起，連續(xù)2 d在同一時(shí)間將小鼠放入避暗儀中適應(yīng)5 min。第28天腹腔注射東莨菪堿20 min后開始習(xí)得測試，將小鼠背對拱門放入明箱后，給暗室不銹鋼柵欄通以0.3 mA電流持續(xù)5 min，由于小鼠具有趨暗的習(xí)性會由明室向暗室探索，小鼠一進(jìn)入暗室即受電擊，其正確反應(yīng)是回到明室，記錄小鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間即為避暗潛伏期（step-through latency），步入潛伏期大于5 min者棄去不用,5 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)即為穿梭次數(shù)（shuttle number）,作為習(xí)得成績；24 h后對小鼠進(jìn)行記憶保持測試，記錄小鼠5 min內(nèi)的潛伏期及進(jìn)入暗室的次數(shù)（即穿梭次數(shù)），作為記憶成績，5 min內(nèi)未進(jìn)入暗室的小鼠其潛伏期按300 s計(jì)，穿梭次數(shù)計(jì)0次。

1.7 小鼠血漿、腦組織內(nèi)生化指標(biāo)檢測

行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，全血離心后取血清；脫頸椎處死小鼠，迅速于冰上斷頭取腦，加9倍體積（m/V）的冰生理鹽水進(jìn)行勻漿，4℃離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，即為10%組織勻漿。分別按照試劑盒表明書測定腦組織勻漿中ChAT和AChE活力，腦組織勻漿和血清中SOD、GSH-Px活力及MDA含量，采用考馬斯亮蘭法測定組織蛋白含量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較采用單因子方差分析（one way ANOVA），顯著性用LSD法及Dunnett’s 檢驗(yàn)（＜0.05），所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sd）表示。

2 結(jié)果

2.1 龍眼果肉提取物主要活性成分含量分析

龍眼果肉醇提物和水提物中主要活性成分含量見表1。由表1可知，龍眼果肉水提物以多糖和蛋白為主，總比例超過干物質(zhì)質(zhì)量的60%，其中多糖含量達(dá)到45.46%，而醇提物則含有較高的多糖和還原糖，總占比高達(dá)68.5%，其中還原糖含量占比高達(dá)35.21%。龍眼果肉醇提物和水提物的單糖組成成分相同，主要為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，但其組成比例存在顯著差異（＜0.05）。龍眼果肉醇提物單糖組成中葡萄糖含量最高，高達(dá)69.55%，水提物的單糖組成主要是阿拉伯糖和半乳糖，占比分別為43.29%、34.81%。磷脂含量方面，龍眼果肉醇提物約為水提物的4倍。與龍眼果肉水提物相比，醇提物中抗氧化物質(zhì)含量更高，總酚、總黃酮含量分別約為水提物的2倍、3.6倍。其中，醇提物酚類組成豐富，含有12種酚類物質(zhì)，鞣花酸含量最高；水提物酚酸組成相對簡單，含有5種酚類物質(zhì)，表兒茶素含量最高。

表1 龍眼果肉提取物中主要活性成分含量（均以干基計(jì)，±sd, n=3）

Table 1 Content of the main bioactive components in the extract of longan pulp (All based on dry basis, ±sd, n=3)

表1 龍眼果肉提取物中主要活性成分含量（均以干基計(jì)，±sd, n=3）

主要成分 Basis龍眼果肉醇提物 Ethanol extract of longan pulp龍眼果肉水提物 Aqueous extract of longan pulp 總蛋白Total protein (%)1.12±0.01a16.56±2.03b 總磷脂 Total phospholipids (mg·g-1)10.89±0.02b2.52±0.08a 還原糖 Reducing sugars (%)35.21±0.04b3.00±0.05a 多糖 Polysaccharides (%)33.34±0.98a45.46±1.06b 單糖組成Monosaccharide composition (%) 鼠李糖 Rhamnose1.09±0.02a5.22±0.02b 阿拉伯糖 Arabinose 14.15±0.01a43.29±0.03b 木糖 Xylose 1.47±0.02a3.64±0.05b 甘露糖 Mannose 3.11±0.02a3.49±0.08b 葡萄糖 Glucose 69.55±0.10b9.55±0.03a 半乳糖 Galactose 11.14±0.03a34.81±0.04b 總黃酮 Total flavonoids (mg CE·g-1 )1.53±0.02b0.42±0.01a 總酚Total phenol (mg GAE·g-1)9.52±0.16b4.82±0.19a 酚類組成Phenolscomposition (mg/100 g) 沒食子酸Gallic acid 10.51±0.47b0.87±0.35a 原兒茶酸Protocatechuic acid 6.27±0.73— 綠原酸Chlorogenic acid2.22±0.04a4.77±0.08b 兒茶素Catechin 11.13±0.54b0.19±0.02a 表兒茶素Epicatechin4.81±0.35a8.24±0.14b 香草酸Vanillic acid 0.65±0.03— 蘆丁Rutin 4.81±0.35— 鞣花酸Gallogen 135.51±14.02b5.8±0.43a 阿魏酸Ferulaic acid0.59±0.07— 異阿魏酸Isoferulic acid0.26±0.02— 水楊酸Salicylic acid 4.49±0.12— 香豆酸Coumaric acid 1.16±0.04—

表中不同小寫英文字母代表差異顯著，即＜0.05。下同

Values different letter superscripts mean significant difference (＜0.05). The same as below

2.2 小鼠避暗試驗(yàn)行為表現(xiàn)

不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物對東莨菪堿致衰小鼠在避暗試驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶能力的影響見圖1。在習(xí)得測試時(shí)，各組間潛伏期與穿梭次數(shù)均無顯著性差異（＞0.05）。在記憶保持測試時(shí)，與空白組相比，模型組潛伏期由300 s縮短至130.83 s，穿梭次數(shù)顯著增加至2.44次（＜0.05），表明腹腔注射東莨菪堿使小鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組相比，龍眼果肉各劑量醇提物和水提物組潛伏期均顯著延長（＜0.05），穿梭次數(shù)減少（＜0.05），且同一提取物的高劑量組比低劑量組效果顯著，醇提物和水提物高劑量組的潛伏期分別為289.18 s、290.80 s，穿梭次數(shù)分別為0.75、0.65，與空白組相比均無顯著差異（＞0.05），表明龍眼果肉醇提物與水提物均有改善癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，高劑量組處理小鼠的記憶能力已基本恢復(fù)到正常小鼠水平。

2.3 小鼠腦組織中ChAT和AChE活性

不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠腦組織中ChAT和AChE活性的影響，見圖2。模型組ChAT活性顯著降低（＜0.05），AChE活性增高（＜0.05），表明東莨菪堿損傷小鼠膽堿能系統(tǒng)。與模型組相比，龍眼果肉水提物和醇提物各組ChAT活性顯著增高（＜0.05），且相同劑量下，水提物組ChAT活性（低劑量組：106.34 U·g-1OWW；高劑量組133.61 U·g-1OWW）顯著高于醇提物組（低劑量組：79.40 U·g-1OWW；高劑量組99.53 U·g-1OWW）（＜0.05），其中水提物高劑量組ChAT活性顯著高于空白組（98.70 U·g-1OWW）（＜0.05），表明龍眼果肉醇提物與水提物均可提高致衰小鼠的ChAT活性，且高劑量水提物效果更好。龍眼果肉醇提物和水提物低、高劑量組AChE活性分別為0.30、0.29、0.27、0.26 U·mg-1prot，與模型組相比均有不同程度降低且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05），但與空白組相比，仍未恢復(fù)正常水平（＞0.05）。這提示龍眼果肉改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用機(jī)制可能是通過提高中樞神經(jīng)ChAT活性，降低AChE活性，從而提高Ach的濃度實(shí)現(xiàn)的。

A：潛伏期 Step-through latency；B：穿梭次數(shù) Shuttle number。圖中同組測試中不同小寫英文字母代表差異顯著，即P＜0.05。下同 Values different letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as below

圖2 龍眼果肉提取物東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠腦組織ChAT和AChE活性的影響（±sd, n=12）

2.4 小鼠腦組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量

通過測定小鼠腦組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量，考察不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠抗氧化水平的影響，如表2所示。與空白組相比，模型組小鼠腦組織SOD和GSH-Px活力顯著降低，MDA含量增加（＜0.05），表明東莨菪堿損傷小鼠清除自由基能力；與模型組相比，龍眼果肉醇提物和水提物各劑量組腦組織SOD和GSH-Px活力均增高，MDA含量均降低（＜0.05），表明龍眼果肉醇提物和水提物均能不同程度地提高機(jī)體清除自由基能力；另外，與空白組相比，除水提物組的GSH-Px活力外，其余龍眼果肉醇提物和水提物組在MDA、SOD及GSH-Px均恢復(fù)正常水平（＞0.05）。相同劑量時(shí)，與龍眼果肉水提物比，醇提物組的MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px活性顯著升高，尤其是GSH-Px活性，低劑量和高劑量組分別升高了35.40%和21.50%（＜0.05），表明龍眼果肉醇提物能夠更好地增強(qiáng)東莨菪堿致衰小鼠腦組織中抗氧化酶活力，減少氧化產(chǎn)物含量，從而減輕組織過氧化損傷。

2.5 小鼠血清 SOD、GSH-Px活性及MDA含量

通過測定小鼠血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量，考察不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠抗氧化水平的影響，如表3所示。與空白組相比，模型組血清SOD和GSH-Px活力顯著降低，MDA含量顯著增加（＜0.05），表明東莨菪堿可以降低小鼠血液中的抗自由基能力；與模型組相比，龍眼果肉水提物和醇提物各劑量組血清SOD和GSH-Px活力均增高，MDA含量均降低（＜0.05），龍眼果肉醇提物組效果更優(yōu)，表明龍眼果肉醇提物和水提物均可增強(qiáng)東莨菪堿致癡呆小鼠血液的自由基清除能力，從而對修復(fù)神經(jīng)損傷有一定作用。

表2 龍眼果肉提取物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠腦組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響

Table 2 Effects of extract of longan pulp on MDA , SOD and GSH-Px in the dementia mice brain (±sd, n=12)

表2 龍眼果肉提取物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠腦組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響

組別Groups空白對照組Control模型組Model龍眼果肉醇提物組Ethanol extract of longan pulp龍眼果肉水提物組Aqueous extract of longan pulp 劑量 Dosage (mg·kg-1?b.w.-1)——150300150300 丙二醛MDA (nmol·mg-1 prot)12.63±0.84b15.38±1.08a11.80±0.89bc11.27±1.02c12.74±0.78b12.60±0.90b 超氧化物歧化酶SOD (U·mg-1 prot)67.77±1.34c59.20±3.53d89.72±4.60a92.53±2.08a82.51±5.29b94.28±2.52a 谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px (U·mg-1 prot)63.77±3.32a29.50±2.74c63.41±1.77a61.94±4.05a46.83±4.33b50.98±2.77b

表3 龍眼果肉提取物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響

Table 3 Effects of extract of longan pulp on MDA, SOD and GSH-Px in the dementia mice serum (±sd, n=12)

表3 龍眼果肉提取物對東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響

組別Groups空白對照組Control模型組Model龍眼果肉醇提物組Ethanol extract of longan pulp龍眼果肉水提物組Aqueous extract of longan pulp 劑量 Dosage (mg·kg-1?b.w.-1)——150300150300 丙二醛MDA (nmol·mg-1 prot) 3.15±0.47b5.31±0.67a3.21±0.21b3.02±0.53b3.64±0.38b3.62±0.25b 超氧化物歧化酶SOD (U·mg-1 prot)98.42±5.46c81.59±0.75d132.70±2.89a123.94±1.83b94.75±4.98c128.11±4.54b 谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px (U·mg-1 prot)1046.86±77.34a604.49±32.54d1100.00±67.92a817.31±18.80c976.73±84.56ab900.71±31.56b

3 討論

避暗試驗(yàn)是檢測記憶能力改善效果最常用的方法之一。PARK等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在避暗試驗(yàn)中不同劑量龍眼果肉水提物可以延長小鼠記憶測試的潛伏期，200 mg·kg-1灌胃組效果最佳，與陽性對照比拉西坦組無顯著差異（＞0.05），但習(xí)得測試時(shí)各組的潛伏期無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射東莨菪堿顯著降低小鼠在避暗試驗(yàn)中記憶測試潛伏期，而給予龍眼果肉醇提物和水提物有明顯的改善作用，其中300 mg·kg-1水提物組效果最為顯著，與上述研究現(xiàn)象一致。馬宇昕等[27]用石菖蒲不同提取部位對β淀粉樣蛋白致學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠進(jìn)行水迷宮測試，結(jié)果表明石菖蒲揮發(fā)油、水提液和去油水煎液都具有改善記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，以揮發(fā)油灌胃組逃避潛伏期最短，但與其他兩組無顯著差異。對于人參的研究也呈現(xiàn)出相似的結(jié)果，JIN等[28]發(fā)現(xiàn)原人參二醇/原人參三醇比例為1.24時(shí)可以顯著改善東莨菪堿誘導(dǎo)獲得性障礙小鼠在避暗試驗(yàn)和水迷宮中的空間記憶能力，但對正常小鼠并無記憶提高效果，LYUBIMOV等[29]發(fā)現(xiàn)人參多糖也有改善大鼠學(xué)習(xí)記憶的功效。這表明同一天然產(chǎn)物中可能存在多種具有改善學(xué)習(xí)記憶功能的物質(zhì)。駱萍[10]用Morris水迷宮試驗(yàn)研究了龍眼果肉提取物對東莨菪堿處理大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，發(fā)現(xiàn)龍眼果肉醇提物和水提物均可顯著減少癡呆大鼠在Morris水迷宮中首次穿臺時(shí)間，增加穿臺次數(shù)。本研究結(jié)果表明，龍眼果肉醇提物和龍眼果肉水提物均能顯著延長東莨菪堿所致記憶獲得障礙小鼠在避暗試驗(yàn)中的潛伏期、減少穿梭次數(shù)，改善小鼠記憶能力，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，從急性應(yīng)激角度闡述了龍眼果肉提取物對記憶的改善作用，與上述研究結(jié)果一致。

大腦記憶功能衰退會伴隨著乙酰膽堿水平下降，神經(jīng)元損傷，增加炎癥和氧化應(yīng)激[6]。其中，乙酰膽堿（ACh）水平下降是AD患者主要伴隨癥狀之一[2]。ACh由膽堿在ChAT的催化下合成，AChE可以水解ACh為膽堿和醋酸，一定程度上，ChAT活性可以反應(yīng)ACh的含量。東莨菪堿是一種毒蕈堿膽堿能受體拮抗劑，可對大腦皮層和海馬膽堿能系統(tǒng)突觸上面的ACh受體進(jìn)行阻斷，降低大腦皮層和海馬中ACh含量，作用于記憶的獲得環(huán)節(jié)，引起模型短時(shí)程記憶損害[30]。AChE抑制劑是目前應(yīng)用最廣泛的治療AD藥物。其中天然產(chǎn)物中香豆素類、黃酮類、芪類、生物堿類[2,31-32]等AChE抑制劑已作為一類AD治療藥物資源的代表。本研究中，龍眼果肉醇提物與水提物可以降低AChE活力，提高ChAT活力，可以推測其主要通過有效調(diào)節(jié)乙酰膽堿水平達(dá)到改善學(xué)習(xí)記憶的作用，表明龍眼果肉可以作為治療AD藥物潛在資源之一。研究發(fā)現(xiàn)，金針菇多糖可以上調(diào)結(jié)合素36和p-CaMK II的表達(dá)，調(diào)節(jié)海馬和大腦皮層中ChAT和AChE酶活修復(fù)東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙小鼠乙酰膽堿水平，從而改善記憶能力[5]。周苗苗等[33]發(fā)現(xiàn)魷魚卵磷脂可以通過影響中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，改善東莨菪堿所致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，大豆磷脂也表現(xiàn)出類似效果[34]。遠(yuǎn)志茯苓醇提物可以顯著抑制東莨菪堿所致記憶獲得障礙小鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶活性高達(dá)57.66%，從而發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶作用[4]。本試驗(yàn)分析龍眼果肉醇提物和水提物的主要活性物質(zhì)組成發(fā)現(xiàn)，龍眼果肉水提物中主要為多糖和蛋白質(zhì)，含有少量多酚和黃酮，與前人研究結(jié)果相似[13]，推測其調(diào)節(jié)膽堿功能的物質(zhì)基礎(chǔ)為多糖或多糖-蛋白復(fù)合物；龍眼果肉醇提物除含有較高水平糖類外，黃酮、磷脂類物質(zhì)含量比水提物高，推測其通過多糖黃酮、磷脂等共作用來調(diào)節(jié)膽堿功能，確切的物質(zhì)基礎(chǔ)需要進(jìn)一步研究。

氧化應(yīng)激是記憶損傷早期發(fā)生的病變，是AD另一癥狀[35]。當(dāng)腦組織中樞膽堿能神經(jīng)退化時(shí)，會引起機(jī)體抗氧化酶活性不斷下降，進(jìn)而引發(fā)體內(nèi)自由基異常堆積，造成氧化應(yīng)激[36]。脂質(zhì)豐富的大腦易受到線粒體產(chǎn)生的ROS攻擊[37]，氧化應(yīng)激與線粒體功能失調(diào)有密切聯(lián)系，線粒體功能失調(diào)會增加腦內(nèi)淀粉樣蛋白水平，進(jìn)而形成AD[38]。東莨菪堿通過干擾乙酰膽堿水平在腦內(nèi)引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致認(rèn)知障礙[39]。已有研究表明，記憶損傷與腦內(nèi)脂質(zhì)堆積增加，MDA含量增加，SOD、GSH-Px活力降低密切相關(guān)[40-42]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量龍眼果肉醇提物和水提物均可不同程度提高腦及血清中SOD、GSH-Px酶活，降低MDA含量，其中300 mg·kg-1龍眼醇提物效果最好，因此，可以推測龍眼果肉醇提物和水提物可以通過改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)來提高機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力。逯愛梅等[43]研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖可以顯著增強(qiáng)東莨菪堿誘導(dǎo)記憶獲得性障礙小鼠腦中的SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量，從而改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。XIAO等[44]發(fā)現(xiàn)共飼小鼠蓮房原花青素與乳酸菌，可提高東莨菪堿致衰小鼠腦中的SOD、GSH-Px、T-AOC等抗氧化酶活減輕腦組織氧化損傷，改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。（菊科）葉甲醇-水提取物各劑量組均能提高東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙大鼠提高腦內(nèi)總抗氧化能力，增強(qiáng)SOD、GSH-Px酶活，降低血清中NO含量[6]，改善其記憶能力。JYOTI等[45]研究表明印度天胡荽甲醇提取物可以提高大鼠海馬區(qū)神經(jīng)抗氧化能力，修復(fù)神經(jīng)元損傷，進(jìn)一步對其活性物質(zhì)的組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該提取物含有豐富單寧和總酚，呈現(xiàn)出良好的抗氧化能力[46]。由以上可見，天然產(chǎn)物水提物與醇提物都可能通過良好的抗氧化效果保護(hù)腦組織氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而改善其學(xué)習(xí)記憶能力，其主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)為多糖、原花青素、多酚等。KUNWORARATH[47]等研究結(jié)果表明龍眼果肉水提物有良好的體內(nèi)抗氧化效果。駱萍[10]研究發(fā)現(xiàn)，分別用乙醇、水提取得到的龍眼果肉醇提物和水提物均可提高癡呆大鼠腦組織中SOD、GSH-Px酶活，減少M(fèi)DA生成，且低劑量（6 g·kg-1）效果更優(yōu)，但其主要作用物質(zhì)并不清楚。本試驗(yàn)所采用的樣品為依次經(jīng)過乙醇、水提取得到的醇提物和水提物，相對成分更純，試驗(yàn)劑量（150 mg·kg-1、300 mg·kg-1）參照龍眼干果肉每日攝取量（9—15 g）并基于人-動(dòng)物劑量轉(zhuǎn)換公式得到，且表現(xiàn)出較好效果，故本研究的數(shù)據(jù)更適合用于指導(dǎo)龍眼的日常生活消費(fèi)。所以，龍眼果肉醇提物效果更好，可能是因?yàn)槠淇偡?、總黃酮含量較水提物高，這些物質(zhì)有更好的抗氧化、抗炎作用[48]。而且，與水提物相比，醇提物酚類組成更為豐富，含有12種酚類物質(zhì)，其含量也相對更高，其中鞣花酸含量最高，高達(dá)135.51 mg·100g-1DW。以上結(jié)果表明，龍眼果肉醇提物和水提物通過提高機(jī)體清除自由基的能力，降低脂質(zhì)過氧化損傷程度，減輕自由基對腦組織的損害，保護(hù)腦組織，從而發(fā)揮抗衰老的作用，預(yù)防和改善學(xué)習(xí)記憶障礙。

4 結(jié)論

龍眼果肉醇提物與水提物均能顯著改善東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，二者的作用機(jī)制不盡相同。前者改善學(xué)習(xí)記憶機(jī)制主要通過提高機(jī)體清除自由基的能力，降低脂質(zhì)過氧化損傷程度，減輕自由基對腦組織的氧化損傷；后者則主要通過增強(qiáng)腦組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活力，降低乙酰膽堿酯酶（AChE）活力，從而增加神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，加快神經(jīng)信號的傳導(dǎo)。究其原因，可能與二者中活性物質(zhì)的種類和含量差異有關(guān)，龍眼果肉醇提物主要作用物質(zhì)可能為酚類、黃酮、磷脂等，而水提物則可能為多糖或糖蛋白，龍眼果肉改善學(xué)習(xí)記憶功能可能與二者的共同作用有關(guān)。本研究結(jié)果為揭示龍眼果肉的記憶功能提供了重要信息。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Longan Pulp Extracts Ameliorate Scopolamine-induced Learning and Memory of Impairment Mice

BAI Ya-juan1, 2, LIU Lei1, ZHANG Rui-fen1, DENG Yuan-yuan1, HUANG Fei1, ZHANG Ming-wei1, 2

(1Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610;2College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 410070)

【Objective】The objective of this experiment is to study the effect of different doses of both ethanol extract and aqueous extract of longan pulp on learning and memory function in dementia mice induced by scopolamine and to clarify the mechanism of longan pulp in improving learning and memory of imparment mice.【Method】The contents of the main active substances in the ethanol extract and water extract of longan pulp were analyzed. SPF male kunming mice were randomly divided into 6 groups for 28 d administration: normal control group, model group, low/high dose longan pulp ethanol extract group (150 mg?kg-1/300 mg?kg-1), low/high dose longan pulp aqueous extract group (150 mg?kg-1/300 mg?kg-1). At the end of last time administration, thepassive avoidance testswere performed after mice received scopolamine intraperitoneal injection, the indexes of step-through latency and shuttle number were marked as acquisition trial, the passive avoidance testswere performed again after 24 h which was marked as retention trial. Then detection of the antioxidant activities of serum and brain，such as SOD, GSH-Px, MDA, as well as ChAT and AChE of brain tissue were carried out. 【Result】By analyzing the constituents of longan pulp extract, it was found that longan pulp aqueous extract contains mainly polysaccharide and protein, and ethanol extract contains not only carbohydrates, but also abundant phenolic acid, flavonoid and phospholipid substances. Moreover, the content of total phenols, total flavonoids and total phospholipid in ethanol extraction was significantly higher than that of aqueous extract. The shuttle number of model mice in acquisition trial of passive avoidance test in 5 min (2.89) was 6.09 times of normal control (0.46). Meanwhile shuttle numbers of the high dose longan pulp ethanol extract and aqueous extract groups were 0.75 and 0.56,respectively, the numbers had no significant difference with normal control. The step-through latency of model group in acquisition trial of passive avoidance test was decreased to 130 s (normal control group was 300 s,＜0.05). Compared with model group, each dose of longan pulp ethanol extract and aqueous extract could significantly increase the dementia mice in the step-through latency of passive avoidance test (＜0.05)with dose-dependent, especially the high dose longan pulp ethanol extract and aqueous extract group (289.18 s, 290.80 s, respectively,) basically reached normal level. Biochemical examinations revealed that each dose of longan pulp ethanol extract and aqueous extract could significantly increase the activity of ChAT in brain of dementia mice and significantly reduce AChE activity (＜0.05) in a dose-dependent manner. At the same dose level, aqueous extract of longan pulp performed better than ethanol extract. ChAT activity recovered normal in high dose longan pulp ethanol extract group, low/high dose longan pulp aqueous extract groups. In the antioxidation, compared with the model group, longan pulp ethanol extract in high dose group was significantly increased SOD and GSH-Px activities and decreased MDA content significantly in serum and brain of dementia mice (＜0.05), basically reached normal, the effect was better than the same dose of aqueous extract of longan pulp.【Conclusion】Both ethanol extract and aqueous extract of longan pulphave repairing effects on memory deficits and behavioral disorders produced by scopolamine. It was suggested that ethanol extract and aqueous extract of longan pulpmay be bene?cial to the treatment of Alzheimer’s disease, but their action mechanisms might be different: to promote learning and memory, aqueous extract of longan pulp mainly regulates cholinergic nerve systemby polysaccharide or glycoprotein, and ethanol extract is mainly by means ofproviding antioxidation protection, phenolic acid, flavonoid and phospholipid are principal bioactive substances.

longan pulp; scopolamine; learning and memory function; choline acetyltransterase; antioxidation

2016-03-31；接受日期：2016-08-08

國家自然科學(xué)基金（31301459，31401662）、廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313568）、廣州市珠江科技新星專項(xiàng)（201506010028）

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