玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2結(jié)構(gòu)分析及原核表達(dá)

馬雙新，劉 寧，賈 慧，戴冬青，許苗苗，曹志艷，董金皋

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玉米大斑病菌漆酶基因結(jié)構(gòu)分析及原核表達(dá)

馬雙新，劉 寧，賈 慧，戴冬青，許苗苗，曹志艷，董金皋

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001）

【目的】對(duì)玉米大斑病菌（）漆酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測其蛋白功能，探究木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對(duì)表達(dá)的影響，并對(duì)其進(jìn)行克隆及原核表達(dá)，以便深入研究該基因在病菌生長、發(fā)育及致病過程中的作用?！痉椒ā客ㄟ^NCBI查詢獲得玉米大斑病菌EOA90070 ()基因的全序列，通過ClustalX與馬爾尼菲青霉菌（）(PMAA_082060)基因、煙曲霉（）(AFUA_2G17530)基因、構(gòu)巢曲菌（）(AN6635) 基因等漆酶家族基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，查看中的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，利用在線軟件SOPMA和ProtParam對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行檢測，通過SWISS-MODEL對(duì)Stlac2蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，采用SAVES對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過對(duì)ABTS的氧化試驗(yàn)確定木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對(duì)玉米大斑病菌漆酶產(chǎn)量的影響；利用RT-qPCR方法分析小分子物質(zhì)對(duì)表達(dá)規(guī)律的影響；采用原核表達(dá)系統(tǒng)，以pET-30a表達(dá)載體為框架，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，并將表達(dá)蛋白純化，以ABTS為底物，420 nm下檢測漆酶活性?！窘Y(jié)果】具有典型的Cu離子結(jié)合位點(diǎn)，與漆酶典型的Cu離子結(jié)構(gòu)域相似。其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋、延伸鏈、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲所占比例分別為18.59%、25.63%、11.91%和43.86%，分子量為61.64 kD，等電點(diǎn)為5.00，平均疏水性為-0.37，表明其為親水蛋白。當(dāng)在PDA中添加0.01 g·L-1香草醛、4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羥基苯甲酸和香蘭素時(shí)，玉米大斑病菌胞外漆酶的產(chǎn)量為香草酸＞香蘭素＞4-羥基苯甲醛＞4-羥基苯甲酸＞丁香醛＞對(duì)照。而在4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸存在時(shí)，玉米大斑病菌的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，約為對(duì)照的5—8倍。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，在67 kD處成功誘導(dǎo)表達(dá)出一條特異性蛋白條帶，大量表達(dá)純化后，漆酶活性為（40.7±0.3）U·L-1?！窘Y(jié)論】闡明了的生物信息學(xué)特性，初步斷定其為漆酶基因；4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸可顯著提高相對(duì)表達(dá)量，表明其在木質(zhì)素降解過程中起到了一定的作用；該基因所編碼的蛋白可通過pET-30a原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，體外漆酶活性可達(dá)（40.7±0.3）U·L-1，該研究結(jié)果為后期研究蛋白性質(zhì)打下了基礎(chǔ)。

玉米大斑病菌；；生物信息學(xué)分析；RT-qPCR；原核表達(dá)

0 引言

【研究意義】漆酶（EC1.10.3.2）是一類在催化中心含有多個(gè)銅離子的多酚氧化酶，也被稱為多銅氧化酶[1]。在真菌中，漆酶主要參與病菌與寄主間的互作。以玉米大斑病菌（）漆酶基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)，探索其生物學(xué)特性，可為研究其在玉米大斑病菌致病過程中的作用打下基礎(chǔ)，對(duì)病害防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根據(jù)銅離子的配位清空和光譜特性，可將漆酶分為3種類型（類型I、類型II、類型III）[2]。漆酶的I型銅原子和氨基酸殘基結(jié)合成為單核中心，II型和III型銅原子構(gòu)成3核中心，I型銅原子作為初級(jí)電子的接受者，它參與分子內(nèi)的電子傳遞，把電子從底物傳遞到其他銅原子上；之后電子結(jié)合于3核位點(diǎn)，該位點(diǎn)進(jìn)一步把電子傳遞給活性中心的第二底物氧分子，使之還原為水[3]。漆酶廣泛存在于高等植物和真菌中，在昆蟲[4]和細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)[5-8]。在高等植物中，漆酶在木質(zhì)素形成過程中起到了主要作用[9-13]。而在真菌研究中發(fā)現(xiàn)，漆酶主要參與病菌的致病性、形態(tài)建成和木質(zhì)素降解等過程[14]；如漆酶基因的缺失導(dǎo)致其毒力和致病性較野生型菌株均有所下降；同樣，中漆酶基因的缺失導(dǎo)致其抗逆性和致病性降低。漆酶能夠氧化酚、多酚、芳香胺和一些非酚類化合物，將底物分子上的電子轉(zhuǎn)移到氧分子上，從而使氧還原成水[15]。自然條件下伴隨著木質(zhì)素的降解過程會(huì)產(chǎn)生一些小分子物質(zhì)，例如香草醛、4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羥基苯甲酸和香蘭素等[16-17]，這些小分子物質(zhì)嚴(yán)重影響了木質(zhì)素的后續(xù)降解過程[18-19]。漆酶能夠氧化這些小分子物質(zhì)，同樣在這些物質(zhì)存在的條件下，也能誘導(dǎo)漆酶的活性及產(chǎn)量的增加，如香草酸可影響真菌漆酶的活性及產(chǎn)量[20]，香蘭素和丁香酸對(duì)sp. AH28-2漆酶活性有明顯的誘導(dǎo)作用[21]，阿魏酸和香草醛可使漆酶產(chǎn)量提高10倍[22]，4-羥基苯甲酸對(duì)漆酶基因有顯著的誘導(dǎo)作用[23]，香草酸和壬基酚對(duì)漆酶基因有顯著誘導(dǎo)作用，添加1 mmol·L-1香草酸的樣品在第10天時(shí)漆酶基因的表達(dá)量是對(duì)照的7倍左右[24]。玉米大斑病是由玉米大斑病菌引起的一種真菌病害，在世界各個(gè)玉米產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重[25-26]。曹志艷[27]通過RACE技術(shù)從玉米大斑病菌基因組中克隆到，曹可可[28]通過多銅氧化酶結(jié)合銅離子的保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)玉米大斑病菌基因組，預(yù)測到了9個(gè)具有典型銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的類漆酶基因，其中EOA90070與曹志艷克隆到的基因序列一致，并將其命名為，根據(jù)表達(dá)的蛋白質(zhì)序列與已報(bào)道的多個(gè)真菌漆酶進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn) EOA90070（）與小麥黃斑病菌（）等致病漆酶同源性較高，屬于狹義的子囊菌漆酶，推測該基因在玉米大斑病菌侵染寄主過程中起重要作用。詹旭等[29]研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌、玉米小斑病菌（）、玉米彎孢葉斑病菌（）等10個(gè)產(chǎn)漆酶的植物病原真菌均具有降解木質(zhì)素的能力，其中玉米大斑病菌產(chǎn)漆酶活性最高，為18.984 U·mL-1。曹可可等[30]建立了以漆酶活性為響應(yīng)值的多元二次回歸模型，對(duì)玉米大斑病菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳條件下漆酶活性最高達(dá)（40.00±1.20）U·mL-1。【本研究切入點(diǎn)】在筆者實(shí)驗(yàn)室前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究玉米大斑病菌漆酶基因的結(jié)構(gòu)及其蛋白活性，篩選確定影響該基因表達(dá)的底物分子?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢驗(yàn)基因所屬類別，通過分析其在不同小分子物質(zhì)存在條件下的表達(dá)情況，研究在降解木質(zhì)素過程中起到的作用，并通過原核表達(dá)來探究其催化條件，為進(jìn)一步研究基因及蛋白功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年10月至2016年8月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

玉米大斑病菌01-23由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取試劑盒，TransStart Top Green qPCR SuperMix，BL21（DE3）購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶H I、d III、 LA Taq DNA酶、T4 Ligase、PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購于TaKaRa公司。

1.2 供試培養(yǎng)基及試劑

PDA培養(yǎng)基（g·L-1）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂粉13，自然pH；PD培養(yǎng)基（g·L-1）：馬鈴薯200，葡萄糖20。以上培養(yǎng)基均需經(jīng)過1×105Pa，121℃滅菌20 min后使用。ABTS購于生工生物工程（上海）股份有限公司。檸檬酸緩沖液（pH 3.0）：0.1 mol·L-1檸檬酸18.6 mL，0.1 mol·L-1檸檬酸三鈉1.4 mL。

1.3 方法

1.3.1 Stlac2生物信息學(xué)分析 通過NCBI查找玉米大斑病菌Stlac2（EOA90070）與已知漆酶基因，如馬爾尼菲青霉菌（Penicillium marneffei）PbrB（PMAA_082060）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）Abr2 （AFUA_2G17530）、構(gòu)巢曲菌（Aspergillus nidulans）YA（AN6635）用ClustalX進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，查看Stlac2中的銅離子結(jié)合位點(diǎn)；利用在線軟件SOPMA（http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/ Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）和ProtParam（http://web. expasy.org/protparam/）對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行檢測，最后用SWISS-MODEL（http://swissmodel. expasy.org/）對(duì)Stlac2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并用SAVES（http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/）對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 玉米大斑病菌總RNA的提取 將生長在PDA培養(yǎng)基上4 d的玉米大斑病菌分別接種至含有0.01 g·L-1的香草醛、4-羥基苯甲醛、紫丁香醛、香草酸、4-羥基苯甲酸和丁香酸的PD培養(yǎng)基中，于25℃，黑暗靜置培養(yǎng)7 d后，搜集菌絲，用Up試劑盒提取總RNA用于的表達(dá)分析及cDNA克隆。

1.3.3在不同木質(zhì)素降解產(chǎn)物中的表達(dá)分析 將1.3.2中提取的玉米大斑病菌總RNA根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。置于-80℃保存。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，并以作為內(nèi)參。用Eppendorf Mastercyclyer ep實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，對(duì)在不同小分子物質(zhì)存在下的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 玉米大斑病菌漆酶表達(dá)分析引物

1.3.4的原核表達(dá)及活性檢測 以pET-30a為框架，用-F：5′-ATGTCTT ACAATG -3′，-R：5′-CAGGC CCGAGTCG -3′（下劃線為加入酶切位點(diǎn)H I和d III）擴(kuò)增cDNA全序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-，之后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆接種至含有50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃，220 r/min條件下培養(yǎng)，待其OD600達(dá)0.7—0.8，用1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)，2、4 h后分別取樣1.5 mL，6 000 r/min室溫離心2 min。用30 μL 5×SDS上樣緩沖液重懸沉淀，沸水浴15 min，5 000 r/min室溫離心1 min，取10 μL上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（12%分離膠，5%濃縮膠），檢測蛋白表達(dá)情況。Stlac2蛋白的純化步驟如下：（1）15℃誘導(dǎo) 12 h，收集細(xì)胞，并用140 ml冰浴的Buffer A（20 mmol·L-1Tris-HCl，300 mmol·L-1NaCl，1% Triton-100，pH 8.0）重懸，超聲裂解細(xì)胞，離心后上清過Ni-IDA柱；（2）200 ml Buffer E（20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，2 mol·L-1NaCl，0.1% TritonX-100）洗滌 Ni-IDA 柱；（3）50 ml Buffer F（20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，50 mmol·L-1NaCl，0.1% TritonX-100，20 mmol·L-1咪唑）洗滌Ni-IDA柱；（4）用Buffer G（20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，50 mmol·L-1NaCl，0.1% TritonX-100，250 mmol·L-1咪唑）洗脫 Ni-IDA柱。

Stlac2蛋白的活性檢測：漆酶活性的檢測采用ABTS法。5 mL反應(yīng)體系中含有100 mmol·L-1的檸檬酸緩沖液（pH 3.0），2 mmol·L-1的ABTS，50 μL的Stlac2純化蛋白，于30℃反應(yīng)5 min，測定420 nm下吸光度的變化值。每分鐘使1 μmol ABTS 氧化所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。公式如下：

U·L-1=n×△A×106/36 000/5

其中，n為稀釋倍數(shù)，△A為反應(yīng)液5 min中內(nèi)在420 nm處吸光度變化值，消光系數(shù)ξ為36 000 mol·L-1·cm-1。

2 結(jié)果

2.1生物信息

通過ClustalX軟件對(duì)玉米大斑病菌漆酶基因與已知漆酶基因進(jìn)行序列比對(duì)，并對(duì)其不同類型的Cu離子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析（圖1）。發(fā)現(xiàn)在中的所有銅離子結(jié)合位點(diǎn)均與已知漆酶一致，說明為典型的漆酶基因。

通過SOPMA在線軟件對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析（圖2），得出-螺旋、延伸鏈、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲在554個(gè)氨基酸中所占的比例分別為18.59%、25.63%、11.91%和43.86%（表2）。

通過在線軟件ProtParam對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行推測，發(fā)現(xiàn)分子量為61.64 kD，等電點(diǎn)為5.00，不穩(wěn)定系數(shù)為30.23，280 nm處吸光值介于1.627—1.635，總體疏水性（GRAVY）為-0.37，表明其為親水蛋白（表3）。

利用SWISS-MODEL對(duì)Stlac2蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖3-A），并用SAVES在線軟件對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估（圖3-B）。核心區(qū)域的殘基位點(diǎn)占83.2%，其他允許區(qū)域殘基位點(diǎn)占16.1%，不合理殘基位點(diǎn)占0.7%。3D-1D score≥0.2的殘基位點(diǎn)占83.24%。表明Stlac2的三維構(gòu)象比較合理。

表2 漆酶基因二級(jí)結(jié)構(gòu)組成分析

表3 漆酶基因理化性質(zhì)分析

2.2 木質(zhì)素降解產(chǎn)物存在下玉米大斑病菌胞外漆酶的產(chǎn)生情況將玉米大斑病菌培養(yǎng)在含有0.01 g·L-1的木質(zhì)素降解產(chǎn)物（丁香醛、4-羥基苯甲醛、香草酸、香蘭素、4-羥基苯甲酸）的PDA中，并添加終濃度為0.3 mmol·L-1的ABTS和終濃度為30 mmol·L-1的KNO3，培養(yǎng)5 d后發(fā)現(xiàn)，與CK對(duì)比，菌落周圍的紫色深淺依次為香草酸＞香蘭素＞4-羥基苯甲醛＞4-羥基苯甲酸＞丁香醛＞CK，表明在這些小分子有機(jī)物存在的條件下，玉米大斑病菌漆酶基因的表達(dá)量有所增加，其中在添加香草酸、香蘭素、4-羥基苯甲醛時(shí)，表現(xiàn)尤其明顯（圖4）。

1：CK；2：丁香醛Syringaldehyde；3：香草酸Vanillic acid；4：香蘭素 Vanillin；5：4-羥基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid；6：4-羥基苯甲醛 4-Hydroxybenzaidehyde

2.3 木質(zhì)素降解產(chǎn)物存在下的相對(duì)表達(dá)分析

用Up提取試劑盒提取PD中培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌的總RNA，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在加入4-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲醛后的表達(dá)量顯著升高，約為CK的5—8倍，而在加入香蘭素時(shí)，的相對(duì)表達(dá)量有所下降，在加入其他物質(zhì)時(shí)表達(dá)量變化不顯著（圖5）。說明4-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲醛能夠誘導(dǎo)的表達(dá)，在木質(zhì)素降解過程中，發(fā)揮了一定的作用。

2.4 Stlac2的原核表達(dá)及活性測定

以pET-30a載體為框架，用d III和H I雙酶切片段連接到載體上，構(gòu)建pET-Stlac2表達(dá)質(zhì)粒（圖6）。將成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖7）。

將雙酶切驗(yàn)證正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測后，結(jié)果顯示，在未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液中，培養(yǎng)2 h和4 h后，重組質(zhì)粒在67 kD（61.64 kD+ 5.6 kD空載）左右未產(chǎn)生的明顯的蛋白條帶，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液中，在67 kD左右有清晰的蛋白條帶，證明Stlac2被成功表達(dá)（圖8）。純化后檢測漆酶活性為（40.7± 0.3）U·L-1。

1：CK；2：丁香醛Syringaldehyde；3：香草酸Vanillic acid；4：香蘭素 Vanillin；5：4-羥基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid；6：4-羥基苯甲醛 4-Hydroxybenzaidehyde。圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱狀圖上不同的字母代表基因相對(duì)表達(dá)差異顯著（p＜0.05）The values were mean±standard error, the different letters above the bar represented the significant differences (p＜0.05)

圖6 pET-Stlac2 重組質(zhì)粒圖譜

3 討論

自1883年首次從漆樹中發(fā)現(xiàn)漆酶以來，漆酶一直是從事化學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)W者所關(guān)注的熱點(diǎn)話題。第一個(gè)被擴(kuò)增出來的真菌漆酶為粗糙脈孢菌（）漆酶基因[31]，之后更多的真菌漆酶被發(fā)現(xiàn)，特別是在以擔(dān)子菌為主的白腐真菌中[32]，隨著研究深入及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，漆酶在真菌中的功能和作用越來越清楚，在病原性真菌中，漆酶在色素產(chǎn)生、子實(shí)體形成、菌體形態(tài)建成、病原菌致病性、植物與病原菌互作、脫毒和應(yīng)激反應(yīng)等方面具有重要作用[33-35]。

M：DL5000 DNA Maker；1—4：pET-Stlac2質(zhì)粒 pET-Stlac2 plasmid

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker Protein molecular weight marker；1：未誘導(dǎo)2 h Without IPTG induction for 2 h；2：未誘導(dǎo)4 h Without IPTG induction for 4 h；3：誘導(dǎo)2 h Cultivation with IPTG induction for 2 h；4：誘導(dǎo)4 h Cultivation with IPTG induction for 4 h。黑色箭頭所指為目的條帶 The black arrow indicated the obtained protein

在木質(zhì)素降解過程中，漆酶是發(fā)現(xiàn)最早的能夠降解木質(zhì)素的酶類，而且不同于LiP（lignin peroxidase）、MnP（mangnase peroxidase），漆酶在氧化降解木質(zhì)素的過程中不需要過氧化氫的參與[36-38]。在木質(zhì)素的發(fā)酵降解過程中，會(huì)產(chǎn)生一類含量遠(yuǎn)低于碳水化合物，但卻嚴(yán)重影響后續(xù)發(fā)酵的小分子芳香族化合物，例如香草醛、4-羥基苯甲醛、紫丁香醛、香草酸、4-羥基苯甲酸和紫丁香酸等[16-17]。由于漆酶氧化底物的廣譜特性，使其在木質(zhì)素降解過程中顯得尤為重要。

研究表明，與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元相似的芳香族小分子化合物或木質(zhì)素降解過程中的中間產(chǎn)物，如香草酸等對(duì)真菌漆酶的活性及產(chǎn)量均有一定的影響。香蘭素和丁香酸對(duì)spAH28-2漆酶的活性有明顯的誘導(dǎo)作用[21]，香草醛可使漆酶產(chǎn)量提高10倍[22]。

近些年來，對(duì)病原性真菌漆酶在木質(zhì)素降解中的作用研究的比較少，主要原因是在病原性真菌中，漆酶的產(chǎn)量及活性低于白腐真菌。本試驗(yàn)基于前人研究結(jié)果，在保證高產(chǎn)漆酶的條件下，在玉米大斑病菌中，根據(jù)與已知漆酶保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行ClustalX蛋白序列比對(duì)，并利用Neighbour joining方法聚類發(fā)現(xiàn)EOA90070（）與小麥黃斑病菌等致病漆酶同源性較高，屬于典型的子囊菌漆酶。再通過生物信息學(xué)對(duì)的生物學(xué)特性進(jìn)行了預(yù)測與比對(duì)，判斷其為漆酶基因。為研究其在木質(zhì)素降解過程中是否起到了一定的作用，對(duì)其在小分子物質(zhì)存在條件下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其在4-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲醛存在時(shí)表達(dá)量上升了5—8倍。已有研究表明，小分子物質(zhì)誘導(dǎo)漆酶基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制可能與漆酶基因啟動(dòng)子上游的異生物質(zhì)響應(yīng)元件（xenobiotic response element，XRE）相關(guān)。XRE是真核生物中參與芳香族化合物激活某些特定基因轉(zhuǎn)錄的重要順式作用元件[39-41]，而在Stlac2中是否有此響應(yīng)元件還有待研究。為了更深一步研究的功能，本研究對(duì)該基因進(jìn)行了克隆及原核表達(dá)，并成功表達(dá)出了相應(yīng)大小的蛋白條帶。表達(dá)出的目的蛋白在體外成功地檢測出漆酶活性，這種真核漆酶基因原核表達(dá)的方式報(bào)道的很少，為后期研究在真菌中的作用和功能打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

生物信息學(xué)分析表明具有漆酶基因的典型結(jié)構(gòu)，為玉米大斑病菌漆酶基因；該基因在4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸存在下表達(dá)量顯著提高，表明在木質(zhì)素降解過程中起到了一定作用；以pET-30a為表達(dá)載體框架，實(shí)現(xiàn)了玉米大斑病菌漆酶異源表達(dá)，胞外漆酶活性可達(dá)（40.7±0.3）U·L-1，該研究結(jié)果為后期研究蛋白性質(zhì)打下了基礎(chǔ)。

References：

[1] Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties., 2006, 30(2): 215-242.

[2] Mot A C, Silaghi-Dumitrescu R. Laccases: complex architectures for one-electron oxidations., 2012, 77(12): 1395-1407.

[3] 鈔亞鵬, 錢世鈞. 真菌漆酶及其應(yīng)用. 生物工程進(jìn)展, 2001, 21(5): 23-27.

Chao Y P, Qian S J. Fungal laccase and its applications., 2001, 21(5): 23-27. (in Chinese)

[4] Brijwani K, Rigdon A, Vadlani P V. Fungal laccases: production, function, and applications in food processing., 2010(2010): Article ID 149748.

[5] Alexandre G, Zhulin I B. Laccases are widespread in bacteria., 2000, 18(2): 41-42.

[6] Martins L O, Soares C M, Pereira M M, Teixeira M, Costa T, Jones G H, Henriques A O. Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of theendospore coat., 2002, 277(21): 18849-18859.

[7] Claus H. Laccases and their occurrence in prokaryotes., 2003, 179(3): 145-150.

[8] Givaudan A, Effosse A, Faure D, Potier P, Bouillant M L, Bally R. Polyphenol oxidase inisolated from rice rhizosphere: evidence for a laccase in non-motile strains of., 1993, 108(2): 205-210.

[9] Sterjiades R, Dean J F D, Eriksson K E L. Laccase from sycamore maple () polymerizes monolignols., 1992, 99(3): 1162-1168.

[10] Liu L, Dean J F D, Friedman W E, Eriksson K E L. Laccase-like phenoloxidase is correlated with lignin biosynthesis instem tissue, 1994, 6(2): 213-224.

[11] Boudet A M. Lignins and lignification: selected issues., 2000, 38(1/2): 81-96.

[12] Ranocha P, Chabannes M, Chamayou S, Danoun S, Jauneau A, Boudet A M, Goffner D. Laccase down- regulation causes alterations in phenolic metabolism and cell wall structure in poplar., 2002, 129(1): 145-155.

[13] Hoopes J T, Dean J F D. Ferroxidase activity in a laccase-like multicopper oxidase from., 2004, 42(2): 27-33.

[14] Thurston C F. The structure and function of fungal laccases., 1994, 140(1): 19-26.

[15] Dwivedi U N, Singh P, Pandey V P, Kumar A. Structure-function relationship among becterial, fungal and plant laccases.:, 2011, 68(2): 117-128.

[16] Ando S, Arai I, Kiyoto K, HanaiS. Identification of aromatic monomers in steam-exploded poplar and their influences on ethanol fermentation by., 1986, 64(6): 567-570.

[17] Tran A V, Chambers R P. Lignin and extractives derived inhibitors in the 2, 3-butanediol fermentation of mannose-rich prehydrolysate., 1986, 23(3): 191-197.

[18] d’Acunzo F, Galli C, Gentili P, Sergi F. Mechanistic and steric issues in the oxidation of phenolic and non-phenolic compounds by laccase or laccase-mediator systems. The case of bifunctional substrates., 2006, 30(4): 583-591.

[19] Mayer A M, Staples R C. Laccase: new functions for an old enzyme., 2002, 60(6): 551-565.

[20] 趙敏, 楊謙, 宋小雙, 劉桂豐. 真菌漆酶及其研究進(jìn)展. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2005, 25(1): 115-120.

Zhao M, Yang Q, Song X S, Liu G F. Advances of research on molecular biology of laccase from fungi., 2005, 25(1): 115-120. (in Chinese)

[21] 洪宇植. 新型真菌漆酶基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制[D]. 合肥: 安徽大學(xué), 2005.

Hong Y Z. Molecular cloning and regulatory expression mechanism of novel fungal laccase genes[D]. Hefei: Anhui University, 2005. (in Chinese)

[22] Souza C G, Zilly A, Peralta R M. Production of laccase as the sole phenoloxidase by a Brazilian strain ofin solid state fermentation., 2002, 42(2): 83-90.

[23] Chen S C, Ge W, Buswell J A. Biochemical and molecular characterization of a laccase from the edible straw mushroom,, 2004, 271(2): 318-328.

[24] Solé M, Müller I, Pecyna M J, Fetzer I, Harms H, Schlosser D. Differential regulation byorganic compounds and heavy metals of multiple laccase genes in the aquatic hyphomycete., 2012, 78(13): 4732-4739.

[25] 孫淑琴, 溫雷蕾, 董金皋. 玉米大斑病菌的生理小種及交配型測定. 玉米科學(xué), 2005, 13(4): 112-113, 123.

Sun S Q, Wen L L, Dong J G. Identification of physiological races and mating type of., 2005, 13(4): 112-113, 123. (in Chinese)

[26] Degefu Y, Lohtander K, Paulin L. Expression patterns and phylogenetic analysis of two xylanase genes (and) from, the cause of northern leaf blight of maize., 2004, 86(2): 83-90.

[27] 曹志艷. 玉米大斑病菌黑色素合成途徑相關(guān)基因的克隆及功能分析[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

Cao Z Y. Characterization and function analysis of the genes involved in melanin biosynthesis pathway in the phytopathogenic fungus[D]Baoding: Agricultural University of Hebei, 2009. (in Chinese)

[28] 曹可可. 大斑剛毛座腔菌漆酶基因功能驗(yàn)證及高產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

Cao K K.the function of laccase genes and optimization of fermentation condition for laccase production in[D]Baoding: Agricultural University of Hebei, 2015. (in Chinese)

[29] 詹旭, 曹志艷, 邢繼紅, 董金皋. 植物病原真菌產(chǎn)漆酶菌株的篩選. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(4): 723-729.

Zhan X, Cao Z Y, Xing J H, Dong J G. Screening of laccase-producing isolates among plant pathogenic fungi., 2011, 44(4): 723-729. (in Chinese)

[30] 曹可可, 劉寧, 馬雙新, 曹志艷, 梁東旭, 柴江婷, 董金皋. 大斑剛毛座腔菌高產(chǎn)漆酶條件的響應(yīng)面優(yōu)化及酶學(xué)特性. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(11): 2165-2175.

Cao K K, Liu N, Ma S X, Cao Z Y, Liang D X, Chai J T, Dong J G.Optimization of fermentation condition for laccase production byusing the response surface methodology and the enzymatic characters., 2015, 48(11): 2165-2175. (in Chinese)

[31] Germann U A, Müller G, Hunziker P E, Lerch K. Characterization of two allelic forms oflaccase. Amino- and carboxyl-terminal processing of a precursor., 1988, 263(2): 885-896.

[32] Thurston C F. The structure and function of fungal laccases., 1994, 140(1): 19-26.

[33] Pihet M, Vandeputte P, Tronchin G, Renier G, Saulnier P, Georgeault S, Mallet R, Chabasse D, Symoens F, Bouchara J P. Melanin is an essential component for the integrity of the cell wall ofconidia., 2009, 9(1): 177.

[34] Lin S Y, Okuda S, Ikeda K, Ikeda K, Okuno T, Takano Y.encoding a secreted laccase is involved in appressorial melanization and conidial pigmentation in., 2012, 25(12): 1552-1561.

[35] Morris-JonesR, Gomez B L, Diez S, Uran M, Morris- Jones S D, Casadevall A, Nosanchuk J D, Hamilton A J. Synthesis of melanin pigment byin vitro and during infection., 2005, 73(9): 6147-6150.

[36] 劉浩, 付時(shí)雨, 劉夢(mèng)茹, 詹懷宇, 陳元彩. 白腐菌胞外酶降解木素的機(jī)制及其協(xié)同作用. 中國造紙學(xué)報(bào), 2007, 22(4): 96-101.

Liu H, Fu S Y, Liu M R, Zhan H Y, Chen Y C. Mechanism of delignification of cetoenzym from white rot fungi., 2007, 22(4): 96-101. (in Chinese)

[37] 馮曉靜, 謝益民, 洪衛(wèi). 白腐菌木素降解酶的作用機(jī)理及其在中段廢水處理的應(yīng)用. 湖南造紙, 2008(1): 21-23.

Feng X J, Xie Y M, Hong W. Lignin degradation mechanisms of ligninolytic enzyme system produced by wood white rot fungi and its application to bleaching effluents., 2008(1): 21-23. (in Chinese)

[38] Matera I, Gullotto A, Tilli S, Ferraroni M, Scozzafava A, Briganti F. Crystal structure of the blue multicopper oxidase from the whiterot funguscomplexed with-toluate., 2008, 361(14/15): 4129-4137.

[39] RushMore T H, MORTON M R, PICKETT C B. The antioxidant response element activation by oxidative stress and identification of the DNA consensus sequence required for functional activity., 1991, 266(18): 11632-11639.

[40] Collins P J, Dobson A D W. Regulation of laccase gene transcription in, 1997, 63(9): 3444-3450.

[41] Alvarez J M, Canessa P, Mancilla R A, Polanco R, Santibnez P A, VICUNA R. Expression of genes encoding laccase and manganese-dependent peroxidase in the fungusis mediated by an ACE1-like copper-fist transcription factor., 2009, 46(1): 104-111.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Analysis and expression of laccase gene

MA Shuang-xin, LIU Ning, Jia Hui, DAI Dong-qing, XU Miao-miao, CAO Zhi-yan, DONG Jin-gao

(The Key Laboratory of Hebei Province for Molecular Plant-Microbe Interaction, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to analyze the bioinformatics and infer the functions of, research on the effects of substrates generated in the process of lignin degradation on the relative expression ofFor further study on the function ofin the growth, development, and pathogenicity, thewas successfully expressed by prokaryotic expression system. 【Method】The protein sequences ofwere obtained through NCBI and aligned with the known laccases such as(PMAA_082060),(AFUA_2G17530),and(AN6635) by ClustalX for the Cu ion binding sites. The secondary structure and biochemicalproperties were predicted online by online softwares SOPMA and ProtParam, and the three-dimensional structure was modelled by SWISS-MODEL, and analyzed by SAVES. The effects of lignin degradation substrates on the expression of extracellular laccase were measured by oxidazing ABTS and the effect on the relative expression of specific genewas analyzed by using RT-qPCR.was fused into the pET-30a plasmid and expressed by prokaryotic expression system. The protein Stlac2 expressed by prokaryotic cell was extracted and the laccase activity was detected using ABTS as substrate at 420 nm.【Result】had typical sites bonding with Cu ion. The proportion of-helix, extended strand,-turn and random coil were 18.59%, 25.63%, 11.91% and 43.86%, respectively. The protein molecular weight is 61.64 kD, pI is 5.00, grand average of hydropathicity is -0.37, indicating Stlac2 is a hydrophilic protein. The effect of lignin degradation substrates on the production of extracellular laccase was vanillic acid＞vanillin＞4-hydroxybenzaidehyde＞4-hydroxybenzoic acid＞syringaldehyde＞CK. The relative expression ofwas increased about 5-8 folds compared with CK under the substrates 4-hydroxybenzoic acid and 4-hydroxybenzaidehyde conditions. Stlac2 protein was successfully expressed by prokaryotic expression system and a specific protein band of 67 kD was induced. The laccase activity of this specific protein is (40.7±0.3) U·L-1.【Conclusion】The biochemical properties ofwere analyzed systematically and predicted thatis a laccase gene. 4-Hydroxybenzoic acid and 4-hydroxybenzaidehyde could increase the relative expression ofsignificantly, indicating it plays a role in the process of lignin degradation. Stlac2 protein can be expressed by the prokaryotic expression systems of pET-30a and the laccase activity is (40.7±0.3) U·L-1, thus laid a foundation for further study.

;; bioformatic analysis; RT-qPCR; prokaryotic expression

2016-07-11；接受日期：2016-08-30

國家自然科學(xué)基金（31101402）、國家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02-12）、河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD2014053，QN2014091）

聯(lián)系方式：馬雙新，E-mail：msx0214@126.com。劉寧，E-mail：lning121@126.com。馬雙新和劉寧為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者曹志艷，E-mail： caoyan208@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com