市售酸奶中乳酸菌耐藥性及耐藥基因的檢測(cè)

于 濤，姜曉冰*，李 磊，王 輝，逯勝哲，張萌萌，祈真平，于明月（.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

市售酸奶中乳酸菌耐藥性及耐藥基因的檢測(cè)

于 濤1，姜曉冰2,*，李 磊1，王 輝1，逯勝哲1，張萌萌1，祈真平1，于明月1
（1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

為探討酸奶中乳酸菌所攜帶耐藥基因?qū)θ祟惤】档臐撛谟绊?，?duì)市售酸奶中的乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定，并通過(guò)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)確定菌株的耐藥譜，同時(shí)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)調(diào)查鏈霉素、慶大霉素、磺胺類和四環(huán)素等耐藥基因的分布情況。結(jié)果表明：25 份市售酸奶樣品中共分離得到56 株乳酸菌，包括26 株德氏乳桿菌保加利亞亞種、3 株植物乳桿菌、2 株嗜酸乳桿菌以及25 株嗜熱鏈球菌。藥敏結(jié)果顯示，31 株乳桿菌對(duì)鏈霉素（87.1%）、慶大霉素（80.6%）、環(huán)丙沙星（74.2%）和四環(huán)素（61.3%）的耐藥率較高，對(duì)頭孢菌素類則較為敏感；而25 株嗜熱鏈球菌同樣對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)76.0%；其次分別為萬(wàn)古霉素（32.0%）、環(huán)丙沙星（32.0%）和四環(huán)素（20.0%）。56 株乳酸菌中共檢出5 種不同的耐藥基因，分別為鏈霉素耐藥基因ant(6)（檢出率1.8%）、慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')（檢出率7.1%）、四環(huán)素耐藥基因tetM（檢出率5.4%）以及磺胺類耐藥基因sulⅠ（檢出率14.3%）和sulⅡ（檢出率1.8%）。受試的乳酸菌中共有13 株檢出耐藥基因，其中有4 株攜帶兩種不同的耐藥基因。長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為安全并廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品領(lǐng)域的乳酸菌可能成為潛在的耐藥基因貯存庫(kù)。

酸奶；乳酸菌；耐藥；耐藥基因

乳酸菌是指能夠發(fā)酵糖類，主要代謝產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[1]。除極少數(shù)外，絕大多數(shù)乳酸菌都是人體內(nèi)必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體腸道中。乳酸菌作為發(fā)酵劑或益生菌菌種被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、制藥等行業(yè)。長(zhǎng)期以來(lái)，發(fā)酵產(chǎn)品中所使用的乳酸菌普遍被人們認(rèn)為是安全菌株[2]，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌是目前酸奶生產(chǎn)工藝中的主要發(fā)酵劑。

隨著抗生素在臨床、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用甚至是濫用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重。早期有關(guān)細(xì)菌耐藥的研究主要集中于病原微生物[3-4]，但近年來(lái)對(duì)環(huán)境中共生細(xì)菌及乳酸菌的耐藥性研究越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注[5-9]。研究表明，乳酸菌對(duì)臨床使用的多種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，多數(shù)乳酸菌對(duì)氨基糖苷類、糖肽類、氟喹諾酮類以及磺胺類等抗生素具有天然耐受能力[10]。并且，已有學(xué)者在乳酸菌耐藥菌株中檢測(cè)到相應(yīng)的耐藥基因[8,11-12]。Thumu等[13]在分離自發(fā)酵食品的乳酸菌耐藥株中檢測(cè)到紅霉素和四環(huán)素耐藥基因。另外，研究者在生產(chǎn)酸奶用的乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌耐藥菌株中也檢測(cè)到相關(guān)的耐藥基因[8,14]。已有研究證實(shí)，在體外培養(yǎng)條件下耐藥基因能夠在不同種屬的乳酸菌菌株中發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。這就意味著，當(dāng)乳酸菌耐藥菌株經(jīng)食物攝入進(jìn)入人體后，可能會(huì)通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移等途徑將耐藥基因傳遞給腸道內(nèi)其他共生菌甚至是致病菌，從而對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。因此，是否攜帶耐藥基因可做為評(píng)價(jià)乳酸菌安全性的指標(biāo)之一。

鑒于此，本研究對(duì)市售酸奶中的乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定，通過(guò)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)確定菌株的耐藥譜，同時(shí)調(diào)查鏈霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素和磺胺等耐藥基因在這些菌株中的分布情況，為乳酸菌的安全評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

實(shí)驗(yàn)所用樣品采購(gòu)于河南省新鄉(xiāng)市區(qū)4 個(gè)大型超市，共選購(gòu)8 個(gè)廠家生產(chǎn)的保質(zhì)期內(nèi)酸奶25 份。樣品在2 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作。

藥敏實(shí)驗(yàn)用質(zhì)控菌株Escherichia coli ATCC 25922、Staphylococcus aureus ATCC 25923和Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853由中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

MRS培養(yǎng)基、MC瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、乳酸菌生化鑒定試劑盒 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；11 種藥敏紙片：慶大霉素（gentamicin，GEN，10 μg）、鏈霉素（streptomycin，STR，10 μg）、萬(wàn)古霉素（vancomycin，VAN，30 μg）、紅霉素（erythromycin，ERY，15 μg）、四環(huán)素（tetracycline，TET，30 μg）、復(fù)方新諾明（trimethoprim/ sulfamethoxazole，SXT，1.25 μg＋23.75 μg）、氨芐西林（ampicillin，AMP，10 μg）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP，5 μg）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO，30 μg）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ，30 μg）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX，30 μg） 杭州天和微生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)緩沖液、10×Loading Buffer 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bactron I厭氧培養(yǎng)箱 美國(guó)Shellab公司；XSP-4C光學(xué)顯微鏡 上海宇隆儀器有限公司；ETC-811基因擴(kuò)增儀 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Universal Hood II凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與鑒定

參照GB 4789.35—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》中的檢驗(yàn)方法：取酸奶樣品25 mL（g）置于裝有225 mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。吸取樣品勻液1 mL，用生理鹽水按10 倍遞增進(jìn)行梯度稀釋，選取3 個(gè)適宜的稀釋度分別涂布于MRS和MC固體培養(yǎng)基上，36 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。挑取典型單菌落劃線于MRS或MC平板上進(jìn)行純化，純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。利用乳酸菌生化鑒定試劑盒對(duì)所分離菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.3.2 DNA模板的制備

乳酸菌DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書方法進(jìn)行。

1.3.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以提取的基因組DNA為模板，選用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物27F：5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’[16]。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在Ribosomal Database Project（RDP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// rdp.cme.msu.edu）進(jìn)行比對(duì)確定菌株的種屬。

1.3.4 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)菌株對(duì)抗生素的敏感性，結(jié)果判定依照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015版方法手冊(cè)[17]進(jìn)行。目前關(guān)于乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥折點(diǎn)濃度尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，在本研究中乳酸菌對(duì)氨芐西林、萬(wàn)古霉素、紅霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的抑菌圈直徑解釋參照腸球菌屬的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)頭孢類、慶大霉素和復(fù)方新諾明的抑菌圈直徑解釋參考葡萄球菌屬的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)鏈霉素的抑菌圈直徑解釋參考腸桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)（CLSI中沒有腸球菌屬和葡萄球菌屬對(duì)鏈霉素的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)）。藥敏結(jié)果分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）3 種。每批實(shí)驗(yàn)均用Escherichia coli ATCC 25922、Staphylococcus aureus ATCC 25923和Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3.5 PCR擴(kuò)增耐藥基因

所有菌株分別經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)鏈霉素耐藥基因strA、strB、ant(6)，喹諾酮類（環(huán)丙沙星）質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS，慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')，四環(huán)素耐藥基因tetM、tetS，萬(wàn)古霉素耐藥基因vanA、vanB和磺胺甲基異噁唑耐藥基因sulⅠ、sulⅡ，引物序列及擴(kuò)增條件見表1。選擇部分PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果在GenBank基因庫(kù)中比對(duì)分析。

表1 PCR擴(kuò)增耐藥基因所用引物及擴(kuò)增條件Table 1 Primers for screening antimicrobial resistance genes and PCR conditions used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶樣品乳酸菌的分離與鑒定

本研究共采集市售酸奶樣品25 份，每份樣品對(duì)應(yīng)的平板上均有細(xì)菌生長(zhǎng)。從MRS和MC平板上挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果顯示菌體呈紫色，可判定為革蘭氏陽(yáng)性。在顯微鏡下可觀察到乳桿菌屬的菌體形態(tài)多樣，呈長(zhǎng)桿狀、彎曲桿狀和短桿狀；嗜熱鏈球菌的菌體呈球形。通過(guò)生化鑒定和16S rDNA序列比對(duì)可知，分離得到的56 株乳酸菌中26 株為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、3 株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、2 株為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、25 株為嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 株質(zhì)控菌株對(duì)11 種抗生素的抑菌圈直徑均在質(zhì)控范圍內(nèi)，表明藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。56 株乳酸菌對(duì)11 種抗生素的藥物敏感性結(jié)果見表2（本研究中耐藥率為耐藥和中介耐藥的菌株所占的比例），31 株乳桿菌對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)87.1%；其次分別為慶大霉素（80.6%）、環(huán)丙沙星（74.2%）、四環(huán)素（61.3%）和萬(wàn)古霉素（48.4%）；對(duì)頭孢噻肟最敏感，無(wú)耐藥菌株出現(xiàn)。25 株嗜熱鏈球菌對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)76.0%；其次分別為萬(wàn)古霉素（32.0%）、環(huán)丙沙星（32.0%）和四環(huán)素（20.0%）。

表2 乳酸菌藥物敏感性結(jié)果Table 2 Antimicrobial resistance phenotypes of LAB strains

總體而言，本研究分離得到的56 株乳酸菌對(duì)供試的抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對(duì)鏈霉素（82.1%）、環(huán)丙沙星（55.4%）、慶大霉素（50.0%）、四環(huán)素（42.9%）、萬(wàn)古霉素（41.1%）和復(fù)方新諾明（25.0%）的耐藥情況較為嚴(yán)重；頭孢噻肟和頭孢曲松的對(duì)受試菌株表現(xiàn)出較好的抑菌效果（圖1）。Zhou Ning等[8]從我國(guó)多個(gè)地區(qū)采集的酸奶樣品中分離得到43 株乳酸菌，藥敏結(jié)果顯示這些菌株對(duì)鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素和氯霉素的耐藥率較高。石磊等[21]對(duì)廣州市售酸奶中乳酸菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)48 株乳酸菌對(duì)卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素和環(huán)丙沙星的耐藥水平較高。本研究中乳酸菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素和環(huán)丙沙星的高耐藥率與先前報(bào)道的結(jié)果相似。

圖1 分離菌株對(duì)11 種抗生素的耐藥率Fig. 1 Frequency of drug resistance in all isolates

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

圖2 乳酸菌中耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplifi cation of PCR products of antimicrobial resistance genes from LAB strains

如圖2和表3所示，56 株乳酸菌中有13 株攜帶耐藥基因，占受試菌株的23.2%。其中，1 株德氏乳桿菌保加利亞亞種攜帶鏈霉素耐藥基因ant(6)；2 株植物乳桿菌、1 株德氏乳桿菌保加利亞亞種和1 株嗜熱鏈球菌攜帶慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')；磺胺甲基異噁唑耐藥基因sulⅠ在受試菌株中的檢出率最高（8/56，14.3%），而sulⅡ基因僅在1 株嗜熱鏈球菌中檢出；3 株德氏乳桿菌保加利亞亞種攜帶四環(huán)素耐藥基因tetM，而tetS基因在受試菌株中沒有檢出。所有菌株中均未檢出環(huán)丙沙星和萬(wàn)古霉素相關(guān)耐藥基因。

鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，能夠與細(xì)菌核糖體結(jié)合從而抑制蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。細(xì)菌對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制是通過(guò)產(chǎn)生多種作用于特定氨基或羥基的鈍化酶，抑制藥物與細(xì)菌核糖體結(jié)合，使藥物無(wú)法干擾菌體蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，從而導(dǎo)致耐藥。編碼修飾鏈霉素鈍化酶的耐藥基因主要包括strA、strB、ant(6)和aadA，其中aadA主要分布于革蘭氏陰性菌中。本研究中所有菌株均未檢測(cè)到strA和strB，僅在1 株保加利亞乳桿菌中檢出ant(6)，這與先前的報(bào)道一致[8]。

aac(6')-aph(2'')編碼雙功能酶AAC(6')-APH(2'')，該酶具有乙酰轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶兩種活性，可介導(dǎo)除鏈霉素外的大多數(shù)氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥。許多文獻(xiàn)表明，aac(6')-aph(2'')基因與腸球菌對(duì)慶大霉素耐藥具有高度相關(guān)性，并且該基因常位于耐藥質(zhì)粒上[22]。

表3 乳酸菌中耐藥基因的檢出情況Table 3 Determination of antimicrobial resistance genes from LAB strains

磺胺類耐藥基因編碼二氫葉酸合成酶，介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)此類藥物的耐藥。本研究中sulⅠ的陽(yáng)性率最高，并且有一株嗜熱鏈球菌同時(shí)攜帶sulⅠ和sulⅡ。研究表明，磺胺耐藥基因多位于可移動(dòng)遺傳元件上，如整合子、質(zhì)粒等，能夠通過(guò)水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌種內(nèi)甚至種間傳播，從而加速耐藥以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)[23]。

目前已發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素耐藥基因達(dá)40多種，其中tetM和tetS在革蘭氏陽(yáng)性菌中分布較為廣泛，而在本研究中未檢出tetS基因。Nawaz等[24]在22 株乳酸菌中檢出tetM陽(yáng)性菌株8 株，tetS陽(yáng)性菌株3 株；Zhou Ning等[8]對(duì)23 株乳酸菌四環(huán)素耐藥菌株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有3 株攜帶tetM，未檢出其他種類的四環(huán)素耐藥基因。以上研究表明，在乳酸菌四環(huán)素耐藥菌株中tetM基因的分布可能更為普遍。報(bào)道顯示tet基因常與質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、接合型轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)成分相連，通過(guò)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子在菌群之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移[25]。

本研究中，菌株攜帶的耐藥基因與耐藥表型之間呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，保加利亞乳桿菌1R-1和10R-2均攜帶sulⅠ和tetM基因，相應(yīng)的這兩株菌均對(duì)復(fù)方新諾明和四環(huán)素表現(xiàn)耐藥；植物乳桿菌3R-3攜帶aac(6')-aph(2'')和sulⅠ基因，該菌株對(duì)慶大霉素和復(fù)方新諾明耐藥。值得注意的是，在部分耐藥菌株中并沒有檢出相應(yīng)的耐藥基因，表明在這些耐藥菌株中可能還存在其他的耐藥機(jī)制。本研究中，菌株對(duì)環(huán)丙沙星和萬(wàn)古霉素耐藥率較高，但是擴(kuò)增結(jié)果顯示在環(huán)丙沙星和萬(wàn)古霉素耐藥菌株中均未檢出相關(guān)耐藥基因。環(huán)丙沙星為第3代喹諾酮類抗菌藥物，目前普遍認(rèn)為細(xì)菌對(duì)此類藥物的耐藥機(jī)制主要有3 種，即藥物靶蛋白突變、主動(dòng)外排系統(tǒng)表達(dá)增強(qiáng)及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥[18]。乳酸菌環(huán)丙沙星耐藥菌株中未檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因，表明這些菌株的耐藥性可能由其他機(jī)制介導(dǎo)。萬(wàn)古霉素為糖肽類抗生素，主要通過(guò)抑制細(xì)胞壁的合成實(shí)現(xiàn)殺菌作用。細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥機(jī)制包括基因突變導(dǎo)致細(xì)胞壁變厚或成分改變和耐藥基因的獲得。研究顯示，萬(wàn)古霉素耐藥基因vanA和vanB能夠在腸球菌和葡萄球菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的高水平耐藥[26]。而在本研究中，所有萬(wàn)古霉素耐藥菌株均未攜帶vanA和vanB，說(shuō)明這些菌株的耐藥不是由這兩個(gè)基因所介導(dǎo)的。

56 株乳酸菌中共檢出5 種不同的耐藥基因，其中有4 株菌株攜帶兩種不同的耐藥基因。已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，某些耐藥基因能夠在腸道正常菌之間以及腸道正常菌與致病菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]，而食品鏈就是耐藥基因在腸道內(nèi)傳播的主要途徑。雖然大部分與食品有關(guān)的乳酸菌都已經(jīng)獲得相對(duì)安全認(rèn)證，但是它們?nèi)匀淮嬖跐撛诘陌踩[患。Nawaz等[24]在分離自發(fā)酵食品的乳酸菌中檢測(cè)到多種耐藥基因的存在，并通過(guò)接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證明紅霉素耐藥基因emrB和四環(huán)素耐藥基因tetM能夠從乳桿菌轉(zhuǎn)移至受體菌Enterococcus faecalis 181。我國(guó)學(xué)者也對(duì)杭州地區(qū)發(fā)酵乳制品中乳酸菌發(fā)生耐藥傳播的安全性進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示18.8%的乳酸菌能夠通過(guò)質(zhì)粒接合將耐藥基因轉(zhuǎn)移至受體菌Escherichia coli J53[27]。這些研究表明分離自發(fā)酵食品的乳酸菌很有可能會(huì)扮演耐藥基因貯存宿主的角色，并通過(guò)食品鏈將耐藥性轉(zhuǎn)移到腸道其他正常菌群或者致病菌中，造成耐藥性的傳播[28]。本研究中乳酸菌攜帶的耐藥基因能否在不同種屬的細(xì)菌間發(fā)生轉(zhuǎn)移則需要進(jìn)一步的深入研究。

3 結(jié) 論

本研究從25 份酸奶樣品中分離得到56 株乳酸菌，包括31 株乳桿菌和25 株嗜熱鏈球菌。藥敏結(jié)果顯示，這些菌株對(duì)鏈霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥率較高。56 株乳酸菌中共檢出5 種不同的耐藥基因，即鏈霉素耐藥基因ant(6)、慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')、四環(huán)素耐藥基因tetM以及磺胺類耐藥基因sulⅠ和sulⅡ。本研究中多種耐藥基因的存在表明用于發(fā)酵食品的乳酸菌可能成為潛在的耐藥基因貯存庫(kù)。由于這些耐藥基因多位于可移動(dòng)遺傳元件上，這就意味著它們可能會(huì)轉(zhuǎn)移到腸道中的其他正常菌群或者致病菌中，進(jìn)而造成耐藥性的傳播，最終威脅人類健康。因此，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)乳酸菌等食品工業(yè)用菌的耐藥監(jiān)測(cè)，合理評(píng)估其安全性，保證食品質(zhì)量與安全。

[1] BOURDICHON F, CASAREGOLA S, FORROKH C, et al. Food fermentations: microorganisms with technological beneficial use[J]. International Journal of Food Microbiology, 2012, 154: 87-97. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.12.030.

[2] MATHUR S, SINGH R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria: a review[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 105: 281-295. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2005.03.008.

[3] DALLAL M M S, DOYLE M P, REZADEHBASHI M, et al. Prevalence and antimicrobial resistance profiles of Salmonella serotypes, Campylobacter and Yersinia spp. isolated from retail chicken and beef, Tehran, Iran[J]. Food Control, 2010, 21: 388-392. DOI:10.1016/j.foodcont.2009.06.001.

[4] GOUSIA P, ECONOMOU V, SAKKAS H, et al. Antimicrobial resistance of major fooborne pathogens from major meat products[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2011, 8: 27-38. DOI:10.1089/ fpd.2010.0577.

[5] BOK E, MAZUREK J, STOSIK M, et al. Prevalence of virulence determinants and antimicrobial resistance among commensal Escherichia coli derived from dairy and beef cattle[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2015, 12: 970-985. DOI:10.3390/ijerph120100970.

[6] D’AIMMO M R, MODESTO M, BIAVATI B. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 115: 35-42. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2006.10.003.

[7] FRAQUEZA M J. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from dry-fermented sausages[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015, 212: 76-88. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2015.04.035.

[8] ZHOU Ning, ZHANG Jianxin, FAN Mingtao, et al. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Chinese yogurts[J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95: 4775-4783. DOI:10.3168/jds.2011-5271.

[9] ZHANG Hongmei, XIE Lisi, ZHANG Wenyan, et al. The association of biofi lm formation with antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented foods[J]. Journal of Food Safety, 2013, 33: 114-120. DOI:10.1111/jfs.12030.

[10] 張灼陽(yáng), 劉暢, 郭曉奎. 乳酸菌耐藥性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2007, 19(5): 478-480. DOI:10.13381/j.cnki.cjm.2007.05.015.

[11] HUMMEL A S, HERTEL C, HOLZAPTEL W H, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73: 730-739. DOI:10.1128/AEM.02105-06.

[12] TOOMEY N, BOLTON D, FANNING S. Characterisation and transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs[J]. Research in Microbiology, 2010, 161: 127-135. DOI:10.1016/ j.resmic.2009.12.010.

[13] THUMU S C R, HALAMI P M. Presence of erythromycin and tetracycline resistance genes in lactic acid bacteria from fermented foods of Indian origin[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2012, 102: 541-551. DOI:10.1007/s10482-012-9749-4.

[14] 秦宇軒, 李晶, 王秋涯, 等. 市售酸奶中乳酸菌的鑒定與耐藥性[J].微生物學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 53(8): 889-897. DOI:10.13343/j.cnki. wsxb.2013.08.010.

[15] MIELE A, BANDERA M, GOLDSTEIN B P. Use of primers selective for vancomycin resistance genes to determine van genotype in enterococci and to study gene organization in VanA isolates[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 39(8): 1772-1778. DOI:10.1128/aac.39.8.1772.

[16] MORENO C, ROMERO J, ESPEJO R T. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology, 2002, 148: 1233-1239. DOI:10.1099/00221287-148-4-1233.

[17] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 25th Informational Supplement, M100-S25[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2015.

[18] JIANG X, YU T, WU N, et al. Detection of qnr, aac(6')-Ib-cr and qepA genes in Escherichia coli isolated from cooked meat products in Henan, China[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 187: 22-25. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.06.026.

[19] NG L K, MARTIN I, ALFO M, et al. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistance genes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2001, 15: 209-215. DOI:10.1006/mcpr.2001.0363.

[20] CHEN S, ZHAO S, WHITE D G, et al. Characterization of multipleantimicrobial-resistant Salmonella serovars isolated from retail meats[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70: 1-7. DOI:10.1128/aem.70.1.1-7.2004.

[21] 石磊, 李艷莉, 梁暖意, 等. 廣州市售酸奶中乳酸菌的耐藥性評(píng)估[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(10): 250. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2014.10.041.

[22] 馮霞, 王蓉, 單斌, 等. 高耐慶大霉素腸球菌多重耐藥性與aac(6')-aph(2'')基因的相關(guān)性研究[J]. 實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志, 2011, 3(4): 210-214. DOI:10.3969/j.issn.1674-7151.2011.04.005.

[23] ENNE V I, LIVERMORE D M, STEPHENS P, et al. Persistence of sulphonamide resistance in Escherichia coli in the UK despite national prescribing restriction[J]. Lancet, 2001, 357: 1325-1328. DOI:10.1016/ S0140-6736(00)04519-0.

[24] NAWAZ M, WANG J, ZHOU A, et al. Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products[J]. Current Microbiology, 2011, 62: 1081-1089. DOI:10.1007/s00284-010-9856-2.

[25] KOO H, WOO G. Distribution and transferability of tetracycline resistance determinants in Escherichia coli isolated from meat and meat products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 145: 407-413. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.01.003.

[26] 王敬華. 攜帶vanA基因萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 32(6): 658-660. DOI:10.3969/ j.issn.1673-4130.2011.06.020.

[27] 劉傳杰, 談千千, 朱凱妮, 等. 杭州地區(qū)發(fā)酵乳制品中乳酸菌發(fā)生耐藥傳播的安全性研究[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2014, 26(5): 526-533. DOI:10.13381/j.cnki.cjm.201405008.

[28] van REENEN C A, DICKS L M T. Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota: what are the possibilities? A review[J]. Archives of Microbiology, 2011, 193: 157-168. DOI:10.1007/s00203-010-0668-3.

Antimicrobial Resistance and Resistance Genes in Lactic Acid Bacteria Isolated from Commercial Yogurt

YU Tao1, JIANG Xiaobing2,*, LI Lei1, WANG Hui1, LU Shengzhe1, ZHANG Mengmeng1, QI Zhenping1, YU Mingyue1
(1. School of Life Science and Technology, Xinxiang University, Xinxiang 453000, China; 2. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

In order to investigate the potential public health risk of resistance genes in lactic acid bacteria (LAB), LAB strains isolated from commercial yogurts were identified and investigated for antibiotic resistance profiles and the prevalence of streptomycin, gentamycin, sulfamethoxazole, and tetracycline resistance genes by PCR amplifi cation. A total of 56 LAB strains were isolated from 25 yogurt samples, including Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (n = 26), Lactobacillus plantarum (n = 3), Lactobacillus acidophilus (n = 2), and Streptococcus thermophilus (n = 25). Antimicrobial susceptibility tests showed that 31 Lactobacillus strains were frequently resistant to streptomycin (87.1%), gentamycin (80.6%), ciprofl oxacin (74.2%), and tetracycline (61.3%), whereas cephalosporin exhibited good activity against the strains. 25 Streptococcus thermophilus also showed the highest resistance rate to streptomycin (76.0%), followed by vancomycin (32.0%), ciprofl oxacin (32.0%) and tetracycline (20.0%). Five different resistance genes were detected among the tested strains, including ant(6) (accounting for 1.8% of the strains), aac(6')-aph(2'') (7.1%), tetM (5.4%), sul I (14.3%), and sul II (1.8%). Of the 56 LAB strains, thirteen were positive for resistance genes, among which four strains harbored two different resistance genes, indicating LAB strains which have been recognized as safe and widely used in fermented foods for a long time may act as a reservoir of resistance genes.

yogurt; lactic acid bacteria; antimicrobial resistance; resistance gene

10.7506/spkx1002-6630-201611023

TS252.7

A

1002-6630（2016）11-0131-06

于濤, 姜曉冰, 李磊, 等. 市售酸奶中乳酸菌耐藥性及耐藥基因的檢測(cè)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 131-136. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611023. http://www.spkx.net.cn

YU Tao, JIANG Xiaobing, LI Lei, et al. Antimicrobial resistance and resistance genes in lactic acid bacteria isolated from commercial yogurt[J]. Food Science, 2016, 37(11): 131-136. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611023. http://www.spkx.net.cn

2015-07-24

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A180006）；新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（ZG15007）；河南師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)費(fèi)支持課題；河南師范大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目

于濤（1977—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸镂廴九c控制。E-mail：yutao@xxu.edu.cn

*通信作者：姜曉冰（1984—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸镂廴九c控制。E-mail：jxb841001@163.com