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    小分子免疫分析技術(shù)及其研究進(jìn)展

    2016-11-12 06:21:11鄧省亮賀偉華江西省科學(xué)院微生物研究所江西南昌330096江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心江西南昌330046
    食品科學(xué) 2016年11期
    關(guān)鍵詞:免疫檢測(cè)噬菌體免疫學(xué)

    鄧省亮,李 平,賀偉華(.江西省科學(xué)院微生物研究所,江西 南昌 330096;.江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,江西 南昌 330046)

    小分子免疫分析技術(shù)及其研究進(jìn)展

    鄧省亮1,李 平2,賀偉華1
    (1.江西省科學(xué)院微生物研究所,江西 南昌 330096;2.江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,江西 南昌 330046)

    小分子物質(zhì)抗原表位單一,不能同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗體,限制了夾心法在小分子殘留檢測(cè)中的應(yīng)用,因此小分子免疫學(xué)分析方法主要采用競(jìng)爭(zhēng)模式。近年來,隨著生物合成全抗原、納米抗體、抗獨(dú)特型抗體等生物識(shí)別元件的成功應(yīng)用,開拓了小分子免疫分析技術(shù)的新領(lǐng)域。本文從生物識(shí)別元件的角度綜述了近幾年小分子免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展,并對(duì)小分子免疫分析的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

    小分子物質(zhì);免疫分析;生物識(shí)別元件

    近年來,小分子物質(zhì)(諸如藥物、激素、生物毒素、污染物等)殘留所引發(fā)的一系列環(huán)境安全、食品安全事件已引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注,在小分子物質(zhì)殘留檢測(cè)領(lǐng)域,免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、能實(shí)現(xiàn)通量及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。免疫學(xué)檢測(cè)方法可分為競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)兩種檢測(cè)模式,非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式中有足量抗體(一抗和酶標(biāo)二抗)可供目標(biāo)分析物結(jié)合,檢測(cè)信號(hào)與分析物的含量成正相關(guān)。通常,較之競(jìng)爭(zhēng)法,非競(jìng)爭(zhēng)法具有更優(yōu)的靈敏度、動(dòng)力學(xué)參數(shù)、檢測(cè)范圍[1-2]。由于小分子物質(zhì)分子質(zhì)量小,僅有一個(gè)抗原決定簇,不能提供2 個(gè)或2 個(gè)以上表位與抗體結(jié)合,限制了傳統(tǒng)夾心法在小分子物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。因此,小分子免疫檢測(cè)主要以競(jìng)爭(zhēng)法為主。由于基質(zhì)中小分子目標(biāo)分析物的殘留量通常處于痕量級(jí)別,這對(duì)免疫分析方法的靈敏度及檢測(cè)體系的穩(wěn)定性提出了更高的要求。近年來,隨著生物合成抗原、納米抗體、抗獨(dú)特型抗體等生物識(shí)別元件成功應(yīng)用于小分子免疫檢測(cè),開拓了小分子免疫分析技術(shù)的新領(lǐng)域。本文綜述了近年來國內(nèi)外建立的小分子物質(zhì)免疫分析的研究進(jìn)展,并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行初步展望。

    1 生物合成抗原

    小分子物質(zhì)本身不具有免疫原性,因此建立小分子免疫學(xué)檢測(cè)方法的關(guān)鍵是全抗原的合成。目前,小分子物質(zhì)全抗原的合成主要通過化學(xué)合成的方法將活化的小分子與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián),然而該方法存在合成步驟繁瑣、副產(chǎn)物多、批次差異大等缺陷。

    由于多肽分子具有蘊(yùn)含信息豐富、分子構(gòu)象特征明顯及易被受體識(shí)別等特點(diǎn),研究者們利用噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選可特異結(jié)合小分子單抗的多肽,并開展了將多肽作為小分子物質(zhì)的替代物應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)的研究,但肽模擬物通常以噬菌體展示肽的形式作為競(jìng)爭(zhēng)抗原[3-10],其作為固相生物識(shí)別元件的報(bào)道多集中于大分子物質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域(蛋白質(zhì)、病毒、酶等)。此外,由于噬菌體本身作為生物有機(jī)體,穩(wěn)定性不如普通生物試劑,因此不利于在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用。最近,Liu Xing等[11]淘選隨機(jī)環(huán)七肽庫得到伏馬毒素B1(fumonisin B1,F(xiàn)B1)的模擬表位,并進(jìn)一步將合成后的多肽與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)進(jìn)行偶聯(lián)作為包被原應(yīng)用于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),在玉米粉中的檢測(cè)限為1.18 ng/mL。在此研究基礎(chǔ)上,該課題組的Xu Yang等[12-13]將淘選肽庫獲取的抗原模擬表位的外源編碼基因克隆至含有麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein,MBP)的載體中,以模擬表位-融合蛋白的生物合成全抗原形式進(jìn)行大量表達(dá),構(gòu)建了不以噬菌體為展示介質(zhì)的新型模擬表位,并用于檢測(cè)赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)和FB1,其中將OTA-MBP 作為包被原應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光ELISA和膜基質(zhì)免疫分析法,其靈敏度與基于化學(xué)合成包被原(如OTA-偶聯(lián)卵清蛋白)的檢測(cè)方法靈敏度相似。而將FB1-MBP作為包被原應(yīng)用于膜基質(zhì)免疫分析法,閾值為2.5 ng/mL,相對(duì)于基于化學(xué)合成的包被原(如FB1-BSA)的檢測(cè)方法,靈敏度提升了10 倍。生物合成抗原避免了化學(xué)合成途徑所面臨的多種缺陷,對(duì)于提升小分子物質(zhì)免疫檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性、可持續(xù)性生產(chǎn)及促進(jìn)分析檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化具有積極意義。此外,真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,在一定程度上限制了免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用,生物合成抗原作為人工合成抗原的替代物可有效解決這一問題,并避免在免疫學(xué)檢測(cè)過程中真菌毒素可能對(duì)檢測(cè)人員和環(huán)境造成的毒害和污染。

    2 納米抗體

    羊駝血液中存在天然缺失輕鏈的抗體,克隆其可變區(qū)得到只由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH),即為納米抗體[14]。VHH由單一的基因編碼,分子質(zhì)量約15 kD,為普通抗體的十幾分之一,其易通過酵母菌、大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大量制備,非常適于建立抗體庫或通量篩選。VHH是自然存在的可與抗原結(jié)合的最小片段,這使它比普通的抗體分子更容易接近靶標(biāo)表面的裂縫或者被隱藏的抗原表位,所以它可以識(shí)別很多普通抗體不能識(shí)別的抗原,尤為適于小分子物質(zhì)的分子模擬[15]。此外,VHH還具有耐熱、耐酸堿、耐有機(jī)試劑等特性[16]。

    噬菌體展示肽庫所具有的組成多樣性、制備快捷、基因型與表型統(tǒng)一的特點(diǎn)非常適于作為生物識(shí)別元件應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域,通過構(gòu)建VHH天然或免疫抗體庫,再以相應(yīng)小分子抗原為靶標(biāo)進(jìn)行親和淘選,得到特異的噬菌體展示納米抗體,通過DNA測(cè)序及翻譯即可獲得VHH抗體的氨基酸組成信息,經(jīng)表達(dá)、純化可以制備大量的特異VHH抗體?;诳贵w庫的VHH抗體已經(jīng)應(yīng)用于大量小分子間接競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)檢測(cè),包括藥物、食品中的毒素、環(huán)境污染物等,如咖啡因[17]、三硝基甲苯[18]、3-羥基苯甲酸[19]、四溴化二苯醚[20]、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[21]、赭曲霉毒素[22]、黃曲霉毒素[23]、四溴雙酚A[24]。最近,Wang Jia等[25]將特異VHH抗體與堿性磷酸酶在大腸桿菌融合表達(dá)建立了一步競(jìng)爭(zhēng)法用于檢測(cè)四溴雙酚A,提升靈敏度的同時(shí)減少了傳統(tǒng)ELISA的反應(yīng)步驟。Liu Xing等[26]在淘選VHH免疫抗體庫得到特異噬菌體展示VHH抗體的基礎(chǔ)上結(jié)合實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)用于檢測(cè)赭曲霉毒素(圖1),檢測(cè)限達(dá)3.7×10-6ng/mL。在此研究基礎(chǔ)上,Liu Xing等[27]將VHH抗體與堿性磷酸酶融合表達(dá)建立了直接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫檢測(cè)法,并應(yīng)用于谷物檢測(cè),檢測(cè)限達(dá)0.04 ng/mL。納米抗體在小分子物質(zhì)免疫檢測(cè)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用較晚,但已成為新的研究熱點(diǎn),尤其是近年來涌現(xiàn)出的基于噬菌體展示肽庫技術(shù)的研究和應(yīng)用成果,顯示出納米抗體在該領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力。

    圖1 基于噬菌體納米抗體的實(shí)時(shí)免疫PCR用于檢測(cè)赭曲霉毒素A[26]Fig. 1 VHH-phage based real-time immuno-PCR for the detection of ochratoxin A[26]

    3 抗獨(dú)特型抗體

    圖2 2 α型、β型抗獨(dú)特型抗體識(shí)別小分子抗體不同獨(dú)特部位原理[34][34]Fig. 2 Schematic representation of how α-type and β-type antiidiotype antibodies (α-Ids and β-Ids) recognize their idiotopes on an anti-hapten antibody[34]

    4 基于抗體片段的開放夾心式免疫檢測(cè)法

    開放夾心式免疫檢測(cè)法(open sandwich immunoassay,OS-IA)是一種基于抗體可變區(qū)片段的非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法,其檢測(cè)原理是游離的抗體可變區(qū)片段,即重鏈可變區(qū)片段(variable region of heavy chain,VH)和輕鏈可變區(qū)片段(variable region of light chain,VL)在加入相應(yīng)的抗原后,VH與VL會(huì)提高它們間的相互結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性?;贓LISA或phage-ELISA的檢測(cè)原理見圖3。OS-IA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境等領(lǐng)域的多種小分子物質(zhì)的殘留檢測(cè)[37-42],與競(jìng)爭(zhēng)法相比,OS-IA在提升檢測(cè)靈敏度的同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,既能應(yīng)用于非均相又能應(yīng)用于均相檢測(cè),具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

    Jerne[28]建立的“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”將抗體(antibody,Ab)分子可變區(qū)上的抗原決定簇稱為獨(dú)特型,獨(dú)特型由若干表位組成,稱為獨(dú)特位。它可在異種、同種異體以及自身體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,稱為抗獨(dú)特型抗體(anti-idiotype antibody,Id)。根據(jù)這一學(xué)說,機(jī)體在外界抗原的刺激下首先產(chǎn)生抗體Ab1,抗體Ab1上的獨(dú)特位又刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體Ab2,抗體Ab2上的獨(dú)特位再刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體Ab3,以此類推。因此,免疫網(wǎng)絡(luò)也就可以被看成是由獨(dú)特型和抗獨(dú)特型形成的閉合型、多層次級(jí)聯(lián)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。Ab1上不同的獨(dú)特型決定位可刺激產(chǎn)生4 種不同類型的Ab2,即Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε。目前研究最多的是Ab2α和Ab2β,原理見圖2。Ab2α是Abl中遠(yuǎn)離抗原結(jié)合部位的獨(dú)特型決定簇產(chǎn)生的抗體,它能識(shí)別Abl上與骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)的獨(dú)特位,Ab2α與Abl的結(jié)合不影響Abl再與產(chǎn)生Abl的抗原結(jié)合。Ab2β可識(shí)別Abl上與抗原互補(bǔ)的決定簇,能完全抑制抗原與Abl的結(jié)合,其可模擬抗原,產(chǎn)生與抗原相同的生物學(xué)效應(yīng),被稱為外部抗原在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的“內(nèi)影像”。因此,Ab2β可作為小分子抗原的替代物(如劇毒毒素)應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè),既能有效保障實(shí)驗(yàn)操作人員安全,又能解決毒素標(biāo)準(zhǔn)品來源困難的問題,尤其噬菌體展示技術(shù)及納米抗體在小分子免疫檢測(cè)中的應(yīng)用為抗獨(dú)特型抗體的制備提供了新的選擇[29]。Wang Yanru等[16]以抗黃曲霉毒素單抗免疫羊駝建立抗體庫用于淘選特異的抗獨(dú)特型VHH抗體,以其作為包被原替代化學(xué)合成的包被原建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA并應(yīng)用于樣品檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA對(duì)照,相關(guān)性R2=0.89。Qiu Yulou等[30]應(yīng)用相同的方法以抗獨(dú)特型納米抗體作為包被原建立異源性間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,靈敏度是常規(guī)化學(xué)合成包被原檢測(cè)方法的18 倍。Lei Jiawen等[31]將噬菌體展示抗獨(dú)特型VHH抗體與RT-PCR相結(jié)合用于檢測(cè)黃曲霉毒素,檢測(cè)限達(dá)0.02 ng/mL。Xu Yang等[32]淘選天然VHH噬菌體抗體庫獲得抗獨(dú)特型VHH抗體,并建立間接競(jìng)爭(zhēng)噬菌體ELISA 檢測(cè)桔霉素,靈敏度較傳統(tǒng)ELISA提升了9 倍。Xu Yang等[33]進(jìn)一步表達(dá)抗獨(dú)特型VHH抗體,建立不依賴于噬菌體的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA,靈敏度是傳統(tǒng)ELISA的2 倍,并成功應(yīng)用于谷物樣品檢測(cè)。

    此外,當(dāng)Ab2β與抗體結(jié)合形成復(fù)合物后,由于空間阻礙的存在,Ab2α不能結(jié)合Ab2β/Ab1復(fù)合物,基于此特性建立的非競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)檢測(cè)方法已被應(yīng)用于醫(yī)療診斷領(lǐng)域檢測(cè)皮質(zhì)醇[34]、11-脫氧皮質(zhì)[35]、膽烷酸[36]等。然而,該方法的建立需同時(shí)制備3 種抗體(Ab1、Ab2α和Ab2β),其制備過程繁瑣、成本高,需要進(jìn)行大量篩選,且抗體分型鑒定、純化難度很大,目前研究較少。

    圖3 基于ELISA或phage-ELISA的開放夾心免疫檢測(cè)小分子物質(zhì)原理[388--4422]]Fig. 3 ELISA or phage-ELISA based open-sandwich enzyme immunoassay for noncompetitive detection of hapten[38-42]

    為了進(jìn)一步提升檢測(cè)方法的靈敏度,研究者們將OS-IA應(yīng)用于多種檢測(cè)體系。Ihara等[43]將OS-ELISA與微流控芯片系統(tǒng)相結(jié)合,建立了一種新快速的非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)體系,稱為micro OS-ELISA,用于檢測(cè)骨鈣素,檢測(cè)限為1 ng/mL,分析時(shí)間只需要12 min。Minami等[44]將OS-ELISA與分子印跡技術(shù)結(jié)合,通過表面等離子共振傳感器檢測(cè)小分子的結(jié)合和解離過程。Dong Jinhua等[45]建立基于噬菌體的開放夾心式免疫PCR(open-sandwich immuno-PCR,OS-IPCR)檢測(cè)骨鈣素和17β-雌二醇,檢測(cè)限分別達(dá)0.058 ng/mL和9.8 ng/mL。但DNA作為探針應(yīng)用于immuno-PCR,加熱提取噬菌體中DNA,方法的重現(xiàn)性一般,且噬菌體需新鮮制備,這些因素影響了OS-IPCR的實(shí)際應(yīng)用。為了解決上述問題,Hasan等[46]建立了基于鏈霉親和素(streptavidin,SA)的OS-IPCR用于檢測(cè)骨鈣素,包被MBP-VH,加入抗原、SA-VL及生物素化的DNA進(jìn)行孵育,通過PCR以生物素化的DNA測(cè)定結(jié)合的SA-VL,實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的定量,檢測(cè)限達(dá)1×10-4ng/mL。

    OS-IA以其良好的檢測(cè)性能成為小分子非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法的熱點(diǎn),由于該方法的檢測(cè)原理是基于抗原存在與否下的VH、VL強(qiáng)弱結(jié)合能力,因此其檢測(cè)靈敏度主要取決于抗體的親和力,即需要高親和力的抗體。此外,需進(jìn)一步減小方法的背景值,如通過定點(diǎn)突變技術(shù)減弱VH與塑性材料表面的非特異性結(jié)合、抗原不存在時(shí)VH和VL的非特異性結(jié)合來提升OS-IA的檢測(cè)靈敏度[47]。

    5 基于抗異型抗體的噬菌體抗免疫復(fù)合物檢測(cè)法

    抗異型抗體(anti-metatype antibody)是針對(duì)復(fù)合物中抗原與抗體之間形成的特定表位,即抗原與抗體結(jié)合而引起抗體活性位點(diǎn)發(fā)生構(gòu)想改變而形成的位點(diǎn)而產(chǎn)生的[48]??巩愋涂贵w與小分子半抗原不會(huì)結(jié)合,與未結(jié)合小分子半抗原的抗體也基本不結(jié)合或結(jié)合力很差,基于這種特性若制備出此種抗體可建立小分子的非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法。但由于抗原和抗體結(jié)合后,大于85%的抗原表面積被包埋,只有極小部分與抗體形成異型表位,因此抗異型抗體的制備非常繁瑣、困難[49]。而應(yīng)用噬菌體展示肽庫技術(shù)可有效解決上述難題,商業(yè)化肽庫對(duì)于淘選抗異型抗體提供了非常便利的選擇,淘選過程為:包被特異性單抗,加入目標(biāo)小分子分析物與單抗結(jié)合,再加入肽庫孵育,進(jìn)行3~5 輪親和淘選后得到基于噬菌體的抗免疫復(fù)合物多肽。基于此建立的噬菌體抗免疫復(fù)合物檢測(cè)法(phage anti-immune complex assay,PHAIA)已經(jīng)應(yīng)用于多種小分子物質(zhì)檢測(cè)(檢測(cè)基本原理見圖4),如孔雀石綠[2]、異噁草松[50]、草達(dá)滅[49]、苯氧基苯甲酸[51]、溴聯(lián)苯醚47[52]等,較之相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)法,靈敏度均有較大提升。

    圖4 噬菌體抗免疫復(fù)合物檢測(cè)方法基本原理[[5522]]Fig. 4 Schematic diagram for phage anti-immune complex assay[52]

    González-Techera等[53]將PHAIA與電化學(xué)免疫傳感器相結(jié)合,建立一種新的噬菌體抗免疫復(fù)合物電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)方法用于檢測(cè)莠去津,檢測(cè)限達(dá)2×10-4ng/mL,靈敏度比相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA提升了200倍。Kim等[51]將PHAIA與RT-PCR相結(jié)合用于檢測(cè)3-苯氧基苯甲酸,檢測(cè)限為6×10-2ng/mL,較之PHAIA,靈敏度提升了10 倍。為了進(jìn)一步消除噬菌體作為生物有機(jī)體給實(shí)驗(yàn)帶來的問題,Vanrell等[54]通過化學(xué)合成抗草達(dá)滅和廣滅靈抗免疫復(fù)合物多肽(納米肽適配子),建立了基于納米肽適配子的非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法,用于檢測(cè)草達(dá)滅和廣滅靈,檢測(cè)限分別達(dá)到1.2 ng/mL和3.2 ng/mL。Carlomagno等[55]合成抗異噁草松的納米肽適配子,依據(jù)相同檢測(cè)方法檢測(cè)異噁草松,檢測(cè)限為0.48 ng/mL。最近,Omi等[56]通過體外抗體制備體系(Autonomously Diversifying Library System)制備抗異型抗體,建立非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法檢測(cè)雌二醇和25-羥基維生素D,檢測(cè)限分別達(dá)3.13×10-3ng/mL和2.1 ng/mL。噬菌體抗免疫復(fù)合物檢測(cè)方法幾乎能將所有的競(jìng)爭(zhēng)ELISA轉(zhuǎn)變?yōu)榉歉?jìng)爭(zhēng)模式,并伴隨了靈敏度的大幅提升。此外,與其他檢測(cè)體系的聯(lián)合應(yīng)用,能有效提升小分子免疫分析方法的靈敏度。

    6 展 望

    小分子物質(zhì)的免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全控制等領(lǐng)域具有重大意義,亟須完善相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)手段來有效監(jiān)控目標(biāo)分析物的殘留。然而,免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)中仍有一些問題需要加以解決:如果目標(biāo)小分子分析物是劇毒物,亟需找到相應(yīng)的有效替代物來減少分析過程中對(duì)操作人員及環(huán)境的污染;化學(xué)合成全抗原(免疫抗原及檢測(cè)抗原)帶來的批間差異導(dǎo)致免疫分析法難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化;小分子物質(zhì)非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法的建立,我國還鮮有這方面的報(bào)道。針對(duì)以上問題,模擬表位肽及基于模擬表位肽的生物合成全抗原的應(yīng)用能有效替代游離及偶聯(lián)蛋白形式的小分子,而開放式夾心分析法及噬菌體抗免疫復(fù)合物分析法作為非競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法開拓了小分子檢測(cè)的新領(lǐng)域,是今后小分子免疫分析的主要發(fā)展方向,其中噬菌體抗體庫技術(shù)因其能實(shí)現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)被視為制備高親和力抗體和抗免疫復(fù)合物抗體的有效途徑,且基于分子改造技術(shù)進(jìn)行抗體庫的構(gòu)建將使噬菌體展示技術(shù)不斷用于優(yōu)化特異性抗體的淘選。此外,除了從構(gòu)建新型生物識(shí)別元件的角度來提高小分子免疫分析方法的靈敏度外,新型信號(hào)放大技術(shù)和多重信號(hào)放大技術(shù)的應(yīng)用范圍也越來越廣泛,如納米材料放大策略、酶標(biāo)記放大策略、底物催化放大策略及底物循環(huán)放大策略,尤其是新型材料(量子點(diǎn)、熒光微球、納米金、納米磁珠、高分子材料等)與不同檢測(cè)體系(如免疫傳感器、免疫層析、免疫PCR等)之間的組合應(yīng)用,從不同角度優(yōu)化免疫學(xué)檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏、多殘留快速檢測(cè),將是今后小分子免疫分析方法發(fā)展的趨勢(shì)。

    [1] YAN Zhongdan, XIONG Ping, GAN Ning, et al. A novel sandwich-type noncompetitive immunoassay of diethylstilbestrol using β-cyclodextrin modified electrode and polymer-enzyme labels[J]. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2015, 736: 30-37. DOI:10.1016/j.jelechem.2014.10.016.

    [2] DONG Jiexiang, XU Chao, WANG Hong, et al. Enhanced sensitive immunoassay: noncompetitive phage anti-immune complex assay for the determination of malachite green and leucomalachite green[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(34): 8752-8758. DOI:10.1021/jf5019824.

    [3] HUA Xiude, LIU Xiaofeng, SHI Haiyan, et al. Development of a heterologous enzyme-linked immunosorbent assay for organophosphorus pesticides with phage-borne peptide[J]. RSC Advances, 2014, 4(80): 42445-42453. DOI:10.1039/C4RA07059C.

    [4] HE Zhenyun, HE Qinghua, XU Yang, et al. Ochratoxin A mimotope from second-generation peptide library and its application in immunoassay[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(21): 10304-10311. DOI:10.1021/ac402127t.

    [5] WANG Yanru, WANG Hong, LI Peiwu, et al. Phage-displayed peptide that mimics aflatoxins and its application in immunoassay[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(10): 2426-2433. DOI:10.1021/jf4004048.

    [6] WANG Jia, LIU Zhiping, LI G Q, et al. Simultaneous development of both competitive and noncompetitive immunoassays for 2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether using phage-displayed peptides[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405(29): 9579-9583. DOI:10.1007/s00216-013-7364-5.

    [7] HE Q H, XU Y, HUANG Y H, et al. Phage-displayed peptides that mimic zearalenone and its application in immunoassay[J]. Food Chemistry, 2011, 126(3): 1312-1315. DOI:10.1016/ j.foodchem.2010.11.085.

    [8] LIU R R, YU Z, HE Q H, et al. An immunoassay for ochratoxin A without the mycotoxin[J]. Food Control, 2007, 18(7): 872-877. DOI:10.1016/j.foodcont.2006.05.002.

    [9] SELLRIE F, SCHENK J A, BEHRSING O, et al. A competitive immunoassay to detect a hapten using an enzyme-labelled peptide mimotope as tracer[J]. Journal of Immunological Methods, 2002, 261(1/2): 141-144. DOI:10.1016/S0022-1759(01)00561-0.

    [10] WANG Y, HU X F, PEI Y F, et al. Selection of phage-displayed minotopes of ochratoxin A and its detection in cereal by ELISA[J]. Analytical Methods, 2015, 7(5): 1849-1854. DOI:10.1039/ C4AY02290D.

    [11] LIU X, XU Y, HE Q H, et al. Application of mimotope peptides of fumonisin B1in peptide ELISA[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(20): 4765-4770. DOI:10.1021/jf400056p.

    [12] XU Y, HE Z Y, HE Q H, et al. Use of cloneable peptide-MBP fusion protein as a mimetic coating antigen in the standardized immunoassay for mycotoxin ochratoxin A[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(35): 8830-8836. DOI:10.1021/jf5028922.

    [13] XU Y, CHEN B, HE Q H, et al. New approach for development of sensitive and environmentally friendly immunoassay for mycotoxin fumonisin B(1) based on using peptide-MBP fusion protein as substitute for coating antigen[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(16): 8433-8440. DOI:10.1021/ac502037w.

    [14] HAMERS-CASTERMAN C, ATARHOUCH T, MUYLDERMANS S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains[J]. Nature, 1993, 363: 446-448. DOI:10.1038/363446a0.

    [15] KOL S, KALLEHAUGE T B, ADEMA S, et al. Development of a VHH-based erythropoietin quantification assay[J]. Molecular Biotechnology, 2015, 57(8): 692-700. DOI:10.1007/s12033-015-9860-7.

    [16] WANG Y R, LI P W, MAJKOVA Z, et al. Isolation of alpaca antiidiotypic heavy-chain single-domain antibody for the aflatoxin immunoassay[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(17): 8298-8303. DOI:10.1021/ac4015885.

    [17] LADENSON R C, CRIMMINS D L, LANDT Y, et al. Isolation and characterization of a thermally stable recombinant anti-caffeine heavy-chain antibody fragment[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(13): 4501-4508. DOI:10.1021/ac058044j.

    [18] ANDERSON G P, GOLDMAN E R. TNT detection using llama antibodies and a two-step competitive fluid array immunoassay[J]. Journal of Immunological Methods, 2008, 339(1): 47-54. DOI:10.1016/j.jim.2008.08.001.

    [19] KIM H J, MCCOY M R, MAJKOVA Z, et al. Isolation of alpaca anti-hapten heavy chain single domain antibodies for development of sensitive immunoassay[J]. Analytical Chemistry, 2011, 84(2): 1165-1171. DOI:10.1021/ac2030255.

    [20] BEVER C R, MAJKOVA Z, RADHAKRISHNAN R, et al. Development and utilization of camelid VHH antibodies from alpaca for 2,2’,4,4’-tetrabrominated diphenyl ether detection[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(15): 7875-7882. DOI:10.1021/ac501807j.

    [21] DOYLE P J, ARBABI-GHAHROUDI M, GAUDETTE N, et al. Cloning, expression, and characterization of a single-domain antibody fragment with affinity for 15-acetyl-deoxynivalenol[J]. Molecular Immunology, 2008, 45(14): 3703-3713. DOI:10.1016/ j.molimm.2008.06.005.

    [22] van HOUWELINGEN A, de SAEGER S, RUSANOVA T, et al. Generation of recombinant alpaca VHH antibody fragments for the detection of the mycotoxin ochratoxin A[J]. World Mycotoxin Journal, 2008, 1(4): 407-417. DOI:10.3920/WMJ2008.1070.

    [23] HE T, WANG Y R, LI P W, et al. Nanobody-based enzyme immunoassay for aflatoxin in agro-products with high tolerance to cosolvent methanol[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(17): 8873-8880. DOI:10.1021/ac502390c.

    [24] WANG J, BEVER C R, MAJKOVA Z, et al. Heterologous antigen selection of camelid heavy chain single domain antibodies against tetrabromobisphenol A[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(16): 8296-8302. DOI:10.1021/ac5017437.

    [25] WANG J, MAJKOVA Z, BEVER C R, et al. One-step immunoassay for tetrabromobisphenol A using a camelid single domain antibodyalkaline phosphatase fusion protein[J]. Analytical Chemistry, 2015, 87(9): 4741-4748. DOI:10.1021/ac504735p.

    [26] LIU X, XU Y, XIONG Y H, et al. VHH phage-based competitive realtime immuno-polymerase chain reaction for ultrasensitive detection of ochratoxin A in cereal[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(15): 7471-7477. DOI:10.1021/ac501202d.

    [27] LIU X, XU Y, WANG D B, et al. Development of a nanobody-alkaline phosphatase fusion protein and its application in a highly sensitive direct competitive fluorescence enzyme immunoassay for detection of ochratoxin A in cereal[J]. Analytical Chemistry, 2015, 87(2): 1387-1394. DOI:10.1021/ac504305z.

    [28] JERNE N K. Towards a network theory of the immune system[J]. Annales Dimmunologie, 1974, 125C(1/2): 373-389 .

    [29] HE J, LIANG Y, FAN M T, et al. Preparation of anti-idiotype antibodies of O, O-dimethyl organophosphorus pesticides by phage display technology[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2011, 39(2): 178-182. DOI:10.1016/S1872-2040(10)60415-X.

    [30] QIU Y L, HE Q H, XU Y, et al. Deoxynivalenol-mimic nanobody isolated from a na?ve phage display nanobody library and its application in immunoassay[J]. Analytica Chimica Acta, 2015, 887: 201-208. DOI:10.1016/j.aca.2015.06.033.

    [31] LEI J W, LI P W, ZHANG Q, et al. Anti-idiotypic nanobody-phage based real-time immuno-PCR for detection of hepatocarcinogen aflatoxin in grains and feedstuffs[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(21): 10841-10846. DOI:10.1021/ac5029424.

    [32] XU Y, XIONG L, LI Y P, et al. Citrinin detection using phagedisplayed anti-idiotypic single-domain antibody for antigen mimicry[J]. Food Chemistry, 2015, 177: 97-101. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.01.007.

    [33] XU Y, XIONG L, LI Y P, et al. Anti-idiotypic nanobody as citrinin mimotope from a naive alpaca heavy chain single domain antibody library[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(18): 5333-5341. DOI:10.1007/s00216-015-8693-3.

    [34] NIWA T, KOBAYASHI T, SUN P, et al. An enzyme-linked immunometric assay for cortisol based on idiotype-anti-idiotype reactions[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 638(1): 94-100. DOI:10.1016/j.aca.2009.02.010.

    [35] KOBAYASHI N, IWAKAMI K, KOTOSHIBA S, et al. Immunoenzymometric assay for a small molecule, 11-deoxycortisol, with attomole-range sensitivity employing an scFv-enzyme fusion protein and anti-idiotype antibodies[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(7): 2244-2253. DOI:10.1021/ac051858f.

    [36] KOBAYASHI N, KUBOTA K, OIWA H, et al. Idiotype-anti-idiotypebased noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay of ursodeoxycholic acid 7-N-acetylglucosaminides in human urine with subfemtomole range sensitivity[J]. Journal of Immunological Methods, 2003, 272(1): 1-10. DOI:10.1016/S0022-1759(02)00115-1.

    [37] ISLAM K N, IHARA M, DONG J, et al. Direct construction of an open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of thyroid hormone T4[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(3): 1008-1014. DOI:10.1021/ac102801r.

    [38] HARA Y, DONG J, UEDA H. Open-sandwich immunoassay for sensitive and broad-range detection of a shellfish toxin gonyautoxin[J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 793: 107-113. DOI:10.1016/ j.aca.2013.07.024.

    [39] SHIRASU N, ONODERA T, NAGATOMO K, et al. Noncompetitive immunodetection of benzaldehyde by open sandwich ELISA[J]. Analytical Sciences, 2009, 25(9): 1095-1100. DOI:10.2116/ analsci.25.1095.

    [40] IHARA M, SUZUKI T, KOBAYASHI N, et al. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(20): 8298-8304. DOI:10.1021/ac900700a.

    [41] LIM S L, ICHINOSE H, SHINODA T, et al. Noncompetitive detection of low molecular weight peptides by open sandwich immunoassay[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(16): 6193-6200. DOI:10.1021/ ac070653z.

    [42] LIU X B, EICHENBERGER M, FUJIOKA Y, et al. Improved detection sensitivity and selectivity attained by open-sandwich selection of an anti-estradiol antibody[J]. Analytical Sciences, 2012, 28(9): 861-867. DOI:10.2116/analsci.28.861.

    [43] IHARA M, YOSHIKAWA A, WU Y, et al. Micro OS-ELISA: rapid noncompetitive detection of a small biomarker peptide by opensandwich enzyme-linked immunosorbent assay (OS-ELISA) integrated into microfluidic device[J]. Lab on a Chip, 2010, 10(1): 92-100. DOI:10.1039/B915516C.

    [44] MINAMI K, IHARA M, KURODA S, et al. Open-sandwich molecular imprinting: making a recognition matrix with antigen-imprinted antibody fragments[J]. Bioconjugate Chemistry, 2012, 23(7): 1463-1469. DOI:10.1021/bc3000782.

    [45] DONG J H, HASAN S, FUJIOKA Y, et al. Detection of small molecule diagnostic markers with phage-based open-sandwich immuno-PCR[J]. Journal of Immunological Methods, 2012, 377(1/2): 1-7. DOI:10.1016/j.jim.2012.01.005.

    [46] HASAN S, DONG J, HARA Y, et al. Protein-based open sandwich immuno-PCR for sensitive detection of small biomarkers[J]. Analytical Sciences, 2013, 29(9): 871-876. DOI:10.2116/analsci.29.871.

    [47] SAKATA T, IHARA M, MAKINO I, et al. Open sandwich-based immuno-transistor for label-free and noncompetitive detection of low molecular weight antigen[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(18): 7532-7537. DOI:10.1021/ac900457m.

    [48] VOSS E W J, MIKLASZ S D, PETROSSIAN A, et al. Polyclonal antibodies specific for liganded active site (metatype) of a high affinity anti-hapten monoclonal antibody[J]. Molecular Immunology, 1988, 25(8): 751-759. DOI:10.1016/0161-5890(88)90111-3.

    [49] GONZáLEZ-TECHERA A, VANRELL L, LAST J A, et al. Phage anti-immune complex assay (PHAIA): a general strategy for noncompetitive immunodetection of small molecules[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(20): 7799-7806. DOI:10.1021/ac071323h.

    [50] ROSSOTTI M, CARLOMAGNO M, GONZALEZ-TECHERA A, et al. Phage anti-immunocomplex assay for clomazone: two-site recognition increasing assay specificity and facilitating adaptation into an on-site format[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(21): 8838-8843. DOI:10.1021/ac101476f.

    [51] KIM H J, McCOY M, GEE S J, et al. Noncompetitive phage antiimmunocomplex real-time polymerase chain reaction for sensitive detection of small molecules[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(1): 246-253. DOI:10.1021/ac102353z.

    [52] KIM H J, ROSSOTTI M A, AHN K C, et al. Development of a noncompetitive phage anti-immunocomplex assay for brominated diphenyl ether 47[J]. Analytical Biochemistry, 2010, 401(1): 38-46. DOI:10.1016/j.ab.2010.01.040.

    [53] GONZALEZ-TECHERA A, ZON M A, MOLINA P G, et al. Development of a highly sensitive noncompetitive electrochemical immunosensor for the detection of atrazine by phage antiimmunocomplex assay[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 64: 650-656. DOI:10.1016/j.bios.2014.09.046.

    [54] VANRELL L, GONZALEZ-TECHERA A, HAMMOCK B D, et al. Nanopeptamers for the development of small-analyte lateral flow tests with a positive readout[J]. Analytical Chemistry, 2012, 85(2): 1177-1182. DOI:10.1021/ac3031114.

    [55] CARLOMAGNO M, LASSABE G, ROSSOTTI M, et al. Recombinant streptavidin nanopeptamer anti-immunocomplex assay for noncompetitive detection of small analytes[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(20): 10467-10473. DOI:10.1021/ac503130v.

    [56] OMI K, ANDO T, SAKYU T, et al. Noncompetitive immunoassay detection system for haptens on the basis of antimetatype antibodies[J]. Clinical Chemistry, 2015, 61(4): 627-635. DOI:10.1373/ clinchem.2014.232728.

    Recent Advances in Immunoassays for Small Molecules

    DENG Shengliang1, LI Ping2, HE Weihua1
    (1. Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China; 2. Agricultural Products Quality and Safety Center of Jiangxi, Nanchang 330046, China)

    The detection of small molecules mainly employs competitive immunoassay format due to their single epitopes that cannot be simultaneously recognized by two antibodies, which has limited the application of the sandwich immunoassay in the detection of small molecules. In recent years, the successful application of novel recognition receptors, such as biosynthetic antigen, nanobody, anti-idiotypic antibody, has opened up a new field of small molecule immunoassay technology. In this paper, an overview of the latest development and application of these approaches is presented from the perspective of recognition receptors. Furthermore, future development trend is also discussed.

    small molecules; immunoassay; recognition receptor

    10.7506/spkx1002-6630-201611048

    TS207.3

    A

    1002-6630(2016)11-0277-06

    鄧省亮, 李平, 賀偉華. 小分子免疫分析技術(shù)及其研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 277-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611048. http://www.spkx.net.cn

    DENG Shengliang, LI Ping, HE Weihua. Recent advances in immunoassays for small molecules[J]. Food Science, 2016, 37(11): 277-282. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611048. http://www.spkx.net.cn

    2015-08-27

    江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20141BBF60041;20121BBF60050);江西省科學(xué)院對(duì)外科技合作項(xiàng)目(H2014003);江西省科學(xué)院“省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地”計(jì)劃項(xiàng)目(贛科院字[2013]19號(hào)-08);江西省科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(2013-XTPH1-09)

    鄧省亮(1980—),男,副研究員,博士,研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)。E-mail:dslzdy@163.com

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