拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌的篩選鑒定及抑菌特性

杜靜芳，繆璐歡，馬歡歡，呂欣然，李 瑩，白鳳翎*，李 春，勵(lì)建榮（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌的篩選鑒定及抑菌特性

杜靜芳，繆璐歡，馬歡歡，呂欣然，李 瑩，白鳳翎*，李 春，勵(lì)建榮
（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是引起新生兒敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎的條件致病菌，感染后死亡率高達(dá)80%。實(shí)驗(yàn)采用雙層瓊脂擴(kuò)散法從淡水魚腸道（19 株）和泡菜（7 株）中篩選出1 株來(lái)源于鯉魚腸道的對(duì)Enterobacter sakazakii（106CFU/mL）具有較強(qiáng)拮抗作用的乳酸菌菌株LY-4。結(jié)果表明，抑菌活性物質(zhì)存在于乳酸菌無(wú)細(xì)胞上清液（cell free supermatant，CFS）中，抑菌最佳培養(yǎng)時(shí)間為28 h。CFS經(jīng)胃蛋白酶處理可完全喪失抑菌活性，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后抑菌活性降至76.44%和54.38%，對(duì)α-淀粉酶不敏感；在pH 3.0～4.5范圍內(nèi)保持抗菌活性穩(wěn)定；經(jīng)40～80 ℃范圍內(nèi)處理2 h后其拮抗活性基本不變，100 ℃和121 ℃處理2 h后活性降至79.57%和75.71%。初步判定菌株LY-4產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為非糖基化類細(xì)菌素，并篩選出初步純化抑菌物質(zhì)的最佳萃取劑為乙酸乙酯，粗提物的最小抑菌濃度為6.0 mg/mL。經(jīng)生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

乳酸菌；阪崎腸桿菌；鯉魚腸道；篩選與鑒定；抑菌作用

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是近些年嬰兒配方食品中新發(fā)現(xiàn)的腸桿菌科的一種條件致病菌[1]，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌（E. sakazakii），由其引發(fā)的嬰兒和早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結(jié)腸炎的病例已在全球相繼出現(xiàn)，死亡率高達(dá)80%以上。研究證明，E. sakazakii可誘導(dǎo)腸壁上皮細(xì)胞產(chǎn)生NO引起IEC-6細(xì)胞死亡，增加壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)病率[2]。從1961年至今60多例關(guān)于E. sakazakii對(duì)不同人群感染率的報(bào)道顯示嬰兒屬于E. sakazakii感染的高危人群[3]。近幾年國(guó)內(nèi)也爆發(fā)了多起E. sakazakii的重大感染事件[4]，引起各界和研究人員的普遍關(guān)注。

乳酸菌通過(guò)形成乳酸、乙酸等有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、雙乙酰、乳酸菌素、羅伊菌素、羥基脂肪酸、環(huán)狀肽等抑菌物質(zhì)，有效地控制食品中致腐和致病微生物的生長(zhǎng)[5]。乳酸菌在自然界中分布廣泛，從發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵面團(tuán)、泡菜以及人畜胃腸道均可分離獲得對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、單核增生李斯特菌和大腸桿菌O157:H7等具有拮抗性的乳酸菌菌株[6-10]。Saddam等[11]研究分離自嬰兒糞便中的Lb. acidophilus和Lb. cas ei，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)E. sakazakii的抑菌圈直徑分別達(dá)到22.0 mm和32.0 mm，并鑒定出抑菌物質(zhì)為不耐熱的細(xì)菌素類。Shaker等[12]以牛奶為載體研究乳酸菌對(duì)E. sakazakii的抑制作用，發(fā)現(xiàn)5 h后E. sakazaki i數(shù)量開(kāi)始變化，實(shí)驗(yàn)組中E. sakazakii的數(shù)量開(kāi)始減少，7 d后降至3.08（lg（CFU/mL）），而對(duì)照組增加至5.40（lg（CFU/mL）），說(shuō)明乳酸菌可顯著抑制牛奶中E. sakazakii生長(zhǎng)繁殖。Hunter等[13]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lb. bulgaricus能夠減少腸壁中NO的產(chǎn)生，保護(hù)腸細(xì)胞的完整性，降低由E. sakazakii引起的壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病率。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)E. sakazakii拮抗性乳酸菌的篩選與研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從淡水魚腸道和泡菜中篩選對(duì)E. sakazakii具有拮抗作用的乳酸菌菌株，對(duì)其抑菌作用物質(zhì)進(jìn)行初步研究，為應(yīng)用乳酸菌生物制劑控制食品中E. sakazakii奠定理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

應(yīng)試菌株：Enterobacter sakazakii ATCC29004，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，由渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院保藏；供試菌株：7 株乳酸菌分離自遼西地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜，19 株乳酸菌分離自鯉魚、鳙魚、鯽魚和鏡鯉等淡水魚腸道。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基、LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA Marker-D、Taq PCR Master mix 生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；賽福智能生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)艾本德股份有限公司；DYY-8C電泳儀北京市六一儀器廠；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LabconcoFreeZone 2.5臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)美國(guó)Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌株的拮抗實(shí)驗(yàn)

分別取渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏的分離自淡水魚腸道和泡菜中的乳酸菌，在MRS液體中活化3 代后取菌株24 h MRS發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、8 000 r/min離心5 min的菌體和上清液，上清液經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾獲無(wú)細(xì)胞上清液（cell free supernatant，CFS）；E. sakazakii ATCC29004在LB肉湯中活化（37 ℃恒溫、靜置培養(yǎng)12 h）至3 代，濃度維持在107CFU/mL水平（通過(guò)菌落計(jì)數(shù)得出），以稀釋10 倍后濃度達(dá)到106CFU/mL的E. sakazakii菌懸液為指示菌，參照文獻(xiàn)[14]利用雙層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行拮抗性實(shí)驗(yàn)，篩選拮抗性強(qiáng)的乳酸菌菌株，設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.2 拮抗性乳酸菌的篩選與鑒定

參照方法1.2.1節(jié)篩選效果較好的乳酸菌菌株。

生理生化鑒定：對(duì)篩選的乳酸菌菌株參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中乳酸菌的鑒定方法進(jìn)行生理生化鑒定[15-16]。

分子生物學(xué)鑒定：選取篩選出的乳酸菌菌株對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物用DNA快速抽提試劑盒提取菌株DNA。采用通用引物，正向引物為27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物為1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物大小經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得序列登錄GenBank進(jìn)行BLAST同源性比較，應(yīng)用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 乳酸菌生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

取0.3 mL乳酸菌菌懸液接種于15 mL MRS液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔4 h取菌株CFS按照1.2.1節(jié)測(cè)定抑菌活性。同時(shí)，在580 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌株細(xì)胞生長(zhǎng)量和pH值。

1.2.4 乳酸菌拮抗性能研究

酶敏感性實(shí)驗(yàn)：在菌株CFS中分別加入胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，使最終質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL，37 ℃水浴中孵育2 h，參照1.2.1節(jié)測(cè)定抑菌活性。未經(jīng)酶處理的菌株CFS為對(duì)照組。并計(jì)算抑菌活性喪失率。

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將菌株CFS分別在40、60、80、100 ℃和121 ℃條件下處理2 h后，按照1.2.1節(jié)測(cè)定抑菌活性。

pH值實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用1.0 mol/L的HCl和1.0 mol/L的NaOH將菌株CFS的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，參照1.2.1節(jié)測(cè)定抑菌活性。

1.2.5 乳酸菌拮抗物質(zhì)的初步提取

根據(jù)分子質(zhì)量大小及耐熱性可將乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素分為4 類[17]，本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌素的初步分離純化分2 步進(jìn)行，先采用硫酸銨沉淀法確定分子質(zhì)量的大致范圍，后用有機(jī)溶劑來(lái)進(jìn)行萃取初步純化細(xì)菌素[18]。

硫酸銨沉淀法：采用二次鹽析法，加硫酸銨粉末到CFS中使其飽和度達(dá)到30%，4 ℃放置12 h后4 ℃、8 000 r/min離心30 min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80%，放置12 h后離心取沉淀，用無(wú)菌水溶解后測(cè)抑菌活性[18]。

有機(jī)溶劑萃?。喝绻蛩徜@沉淀效果不佳，則可以認(rèn)為該細(xì)菌素為小分子蛋白，采用有機(jī)溶劑萃取法來(lái)獲取細(xì)菌素。選取乙酸乙酯、石油醚、乙醚作為萃取劑，參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取乳酸菌CFS 100 mL于干凈的分液漏斗中，有機(jī)溶劑100 mL分5 次每次加入20 mL進(jìn)行萃取，加入溶劑后沿同一方向輕輕振蕩，使兩者充分混勻后靜置，待分層明顯取有機(jī)相于另一個(gè)三角瓶中，將5 次萃取液合并，于45 ℃、100 r/min真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至溶液中無(wú)有機(jī)溶劑氣味，將殘留液轉(zhuǎn)存于滅菌的離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 乳酸菌最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

MIC測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]兩倍微量稀釋肉湯法并稍作修改進(jìn)行測(cè)定。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將乙酸乙酯萃取后的粗提物蒸發(fā)至無(wú)有機(jī)溶劑氣味，真空冷凍干燥制成粉末，置于－18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ肔B液體培養(yǎng)基將粗提物粉末稀釋至終濃度為24.0、12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.25、0.375 mg/mL。取5.0 mL為實(shí)驗(yàn)組，以不加粗提物的LB培養(yǎng)基為對(duì)照組，分別加入200 μL、106CFU/mL指示菌菌懸液，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，無(wú)混濁現(xiàn)象的最低濃度為粗提物的最小抑菌濃度，每組重復(fù)3 次。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)平行3 次，結(jié)果表示為±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗性乳酸菌的篩選

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法從2 種乳酸菌菌源中篩選出1 株對(duì)E. sakazakii抑菌效果較好的菌株見(jiàn)表1（其中乳酸菌菌體無(wú)抑制作用，未列出），指示菌菌懸液濃度調(diào)節(jié)至106CFU/mL。從中可以看出26 株乳酸菌均能夠拮抗E. sakazakii，魚源乳酸菌總體效果優(yōu)于泡菜源乳酸菌，其中分離自鯉魚腸道的菌株LY-4效果最好，抑菌圈直徑為19.89 mm，因此，選取菌株LY-4進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 乳酸菌CFS對(duì)阪崎腸桿菌的抑制作用Table 1 Antagonistic effect of CFS from lactic acid bacteria against E. sakazakii

2.2 拮抗性乳酸菌的鑒定

菌株LY-4的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，依照文獻(xiàn)[16]可初步判定菌株LY-4為乳桿菌屬的Lb. plantarum。

表2 菌株LY-4的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identifi cation of strain LY-4

圖1 菌株LY-4的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 PCR amplifi cation of the 16S rRNA gene of strain LY-4

圖1 是菌株LY-4的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖，可以看到在1 500 bp處出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，獲得菌株LY-4的16S rDNA核苷酸序列。將菌株測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的幾株菌的16S rDNA序列，用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見(jiàn)圖2。菌株LY-4與Lb. plantarum FJ378889.1在同一個(gè)分支上，置信度為99%，因此菌株LY-4被鑒定為植物乳桿菌（Lb. plantarum），此結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致。

圖2 菌株LY-4的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain LY-4 based on 16S rDNA sequence

2.3 乳酸菌生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

圖3 乳酸菌LY-4生長(zhǎng)和拮抗活性曲線Fig. 3 Growth and antagonistic activity curves of strain LY-4

菌株LY-4對(duì)E. sakazakii ATCC29004的抑菌活性、生長(zhǎng)和pH值變化曲線如圖3所示，菌株LY-4對(duì)ATCC29004的抑菌活性與細(xì)胞生長(zhǎng)量之間呈現(xiàn)同步增長(zhǎng)趨勢(shì)，在穩(wěn)定期表現(xiàn)為平穩(wěn)狀態(tài)。隨著抑菌活性和細(xì)胞生長(zhǎng)量的增加，pH值呈現(xiàn)迅速下降在16 h后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。LY-4對(duì)ATCC29004的最大抑菌活性為28 h的CFS，說(shuō)明在穩(wěn)定后期菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，因此28 h時(shí)菌株發(fā)酵液的CFS是作為研究抑菌作用的最佳選擇。

2.4 乳酸菌拮抗性能結(jié)果

2.4.1 酶處理的影響

菌株LY-4的CFS經(jīng)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和α-淀粉酶37 ℃處理2 h后對(duì)ATCC29004的抑菌結(jié)果見(jiàn)表3，與對(duì)照組相比，經(jīng)蛋白酶處理后對(duì)E. sakazakii的抑菌活性均降低，對(duì)胃蛋白酶的敏感性最高，抑菌活性完全喪失，其次是木瓜蛋白酶，活性喪失率為45.62%，變化最小的為中性蛋白酶。經(jīng)α-淀粉酶處理后，菌株LY-4的活性基本不變。從酶處理的結(jié)果來(lái)看，可知LY-4的抑菌活性物質(zhì)具有蛋白性質(zhì)，可初步判定LY-4所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為非糖基化類蛋白[20]。Jang等[21]研究分離自泡菜的Pediococcus pentosaceus T1對(duì)Listeria monocytogenes有很好的抑制作用，對(duì)抑菌物質(zhì)進(jìn)一步分離純化后發(fā)現(xiàn)為含有LysM結(jié)構(gòu)域的蛋白，其分子質(zhì)量為23 kD。Miao Jianyin等[22]用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-associated laser desorption-ionization time of fl ight mass spectrmtry，MALDI-TOF/MS）方法研究出分離自西藏藏靈菇中的Lb. paracase所產(chǎn)生的細(xì)菌素F1分子質(zhì)量為2.1 kD，且有封閉的N末端，對(duì)真菌和細(xì)菌有抑制作用。

表3 酶處理對(duì)菌株LY-4拮抗阪崎腸桿菌活性的影響Table 3 Effect of enzymatic treatment on antagonistic activity of strain LY-4 against E. sakazakii

2.4.2 熱處理的影響

圖4 熱處理對(duì)菌株CFS拮抗阪崎腸桿菌活性的影響Fig. 4 Effect of th ermal treatment on antagonistic activity of CFS against E. sakazakii

不同溫度熱處理后，菌株LY-4的CFS抑菌活性變化結(jié)果如圖4所示。菌株LY-4的代謝產(chǎn)物經(jīng)40、60 ℃和80 ℃處理2 h后，抑菌活性基本不變，經(jīng)100 ℃和121 ℃處理2 h后E. sakazakii的抑菌活性仍保留原活性的79.57%和75.71%，表明其代謝產(chǎn)物具有較好的穩(wěn)定性。這和Miao Jianyin[22]、Lü Xin[23]及Todorov[24]等的研究結(jié)果一致。

2.4.3 pH值處理的影響

不同pH值條件下菌株LY-4的CFS對(duì)阪崎腸桿菌的抑菌活性變化情況如圖5所示。乳酸菌CFS的抑菌活性隨著pH值的升高呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，其中，當(dāng)pH 3.0時(shí)，抑菌效果最好；當(dāng)pH值大于3.94（菌株CFS的pH值）時(shí)，抑菌活性基本不變；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，抑菌活性變?yōu)樵瓉?lái)的87.28%；當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，抑菌活性消失（數(shù)據(jù)未列出），表明菌株CFS中除含有乳酸等酸性代謝物質(zhì)，還具有其他抑菌活性成分，且該抑菌成分在酸性條件下活性較好。Lü Xin等[23]研究分離自中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中的Lb. coryniformis MXJ32可產(chǎn)生Lactocin MXJ32A，能夠抑制多種食源性致病菌，且具有很好的pH值耐受性和熱穩(wěn)定性。Casaburi等[25]對(duì)分離自意大利傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中的Lactobacillus curvatus 54M16所產(chǎn)乳酸菌素經(jīng)反相高效液相色譜（reversed phase highperformance liquid chromatography，RP-HPLC）純化，通過(guò)MALDI-TOF/MS后得出分子質(zhì)量為2.5 kD，該乳酸菌素具有很好的pH值耐受性。

圖5 pH值處理對(duì)菌株CFS拮抗阪崎腸桿菌活性的影響Fig. 5 Effect of pH on antagonistic activity of CFS against E. sakazakii

2.5 乳酸菌拮抗物質(zhì)的初步純化菌株LY-4的CFS經(jīng)二次鹽析后收集的沉淀基本無(wú)抑菌效果，而CFS（pH值為3.94）的抑菌效果顯著，結(jié)果如圖6所示，硫酸銨沉淀無(wú)法初步純化細(xì)菌素，認(rèn)為該株菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為小分子質(zhì)量的蛋白，采用有機(jī)溶劑萃取法初步純化細(xì)菌素。

圖6 菌株LY-4的CFS硫酸銨沉淀抑菌效果Fig. 6 Antibacterial effect of CFS after ammonium sulfate precipitation

2.5.1 最佳萃取劑選擇

選用乙酸乙酯、乙醚、石油醚3 種有機(jī)溶劑萃取，細(xì)菌素在有機(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，因此抑菌活性物質(zhì)大部分被萃取到有機(jī)相中，將有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)有機(jī)溶劑氣味后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4和圖7所示。相比對(duì)照組的抑菌效果（抑菌圈直徑（18.35±0.41） mm），乙酸乙酯的萃取效果最好，萃取后抑菌圈直徑明顯大于乙醚、石油醚和未經(jīng)萃取的CFS，乙醚效果次之，石油醚效果最差。乙酸乙酯初步純化細(xì)菌素效果較為明顯，粗提蛋白后的上層溶液抑菌效果微弱，可見(jiàn)初步粗提較為完全。因此選擇乙酸乙酯為最佳萃取劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表4 菌株LY-4抑菌物質(zhì)的有機(jī)溶劑粗提取抑菌效果Table 4 Antimicrobial substances extracted from strain LY-4 mm

圖7 有機(jī)溶劑萃取后抑菌效果Fig. 7 Antibacterial effect of fractions obtained from successive organic solvent extraction of CFS

2.5.2 最小抑菌濃度MIC的測(cè)定結(jié)果

用無(wú)菌LB液體將粗提物粉末制成終質(zhì)量濃度分別為24.0、12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.25、0.375 mg/mL的溶液。取5.0 mL加入100 μL的106CFU/mL指示菌菌懸液，37 ℃靜置、恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼觀察6.0 mg/mL及其以上質(zhì)量濃度的試管無(wú)混濁現(xiàn)象，確定6.0 mg/mL為粗提物對(duì)E. sakazakii的MIC。Lu Xin等[17]研究分離自駱駝乳中的Lb. casei TN-2所產(chǎn)生的類細(xì)菌素物質(zhì)對(duì)Escherichia coli ATCC25922和Staphylococcus aureus ATCC25923的MIC分別為2.5 mg/mL和5.0 mg/mL。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分離的乳酸菌是一類對(duì)其他微生物有拮抗作用的細(xì)菌類群。本實(shí)驗(yàn)從淡水魚腸道和泡菜中篩選出1 株拮抗E. sakazakii效果較好的乳酸菌菌株LY-4，其抑菌活性物質(zhì)主要來(lái)自于菌株的CFS中，恒溫靜置培養(yǎng)28 h后的CFS抑菌活性最高。低酸環(huán)境能夠協(xié)同抑菌活性，pH值在4.5以下均能抑制E. sakazakii生長(zhǎng)。經(jīng)121 ℃處理2 h后抑菌活性仍保留75.71%，說(shuō)明該抑菌物質(zhì)有較好的熱穩(wěn)定性。菌株CFS經(jīng)不同蛋白酶處理后抑菌活性均有下降，對(duì)α-淀粉酶不敏感，可初步判定抑菌活性物質(zhì)為非糖基化的細(xì)菌素類。對(duì)抑菌物質(zhì)采用硫酸銨沉淀和有機(jī)溶劑萃取進(jìn)行初步純化，選出乙酸乙酯為該抑菌物質(zhì)的最佳萃取劑，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空冷凍干燥后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)得出該粗提物的最小抑菌濃度為6.0 mg/mL。經(jīng)生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lb. plantarum）。

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Screening and Identifi cation of Lactic Acid Bacteria Antagonistic against Enterobacter sakazakii

DU Jingfang, MIAO Luhuan, MA Huanhuan, Lü Xinran, LI Ying, BAI Fengling*, LI Chun, LI Jianrong
(National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, College of Food Science and Technology, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Enterobacter sakazakii is an opportunistic pathogen that can cause neonatal septicemia and cephalomeningitis and necrotizing enterocolitis with mortality rate of 80%. Lactic acid bacteria with inhibitory activity against E. sakazakii were isolated from the intestine of freshwater fi sh and pickles by double-layer agar diffusion method. The lactic acid bacterial strain isolated from the intestine of common carp, named as LY-4, showed the highest inhibitory activity, which was mainly derived from its cell-free culture supernatant (CFS). The CFS showed the strongest antagonistic activity when the strain was cultured for 28 h. The antagonistic activity was lost entirely after treatment with pepsin, and degraded sharply to 76.44% and 54.38% by treatment with neutral protease and papain, respectively, but it was not sensitive to α-amylase, and was stable at pH 3.0–4.5. The antagonistic activity remained basically unchanged after thermal treatment at temperatures between 40 and 80 ℃ for 2 h, but declined to 79.57% and 75.71% of its original value after incubation at 100 ℃ and 121 ℃ for 2 h, respectively. The inhibitory substance was determined as a non-glycosylated bacteriocin, which was found to be the most extractable with ethyl acetate. The minimum inhibitory concentration (MIC) of this bacteriocin was 6.0 mg/mL. The strain LY-4 was identifi ed as Lactobacillus plantarum by physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence.

lactic acid bacteria; Enterobacter sakazakii; common carp intestine; screening and identifi cation; antagonism

10.7506/spkx1002-6630-201611022

TS201.3

A

1002-6630（2016）11-0125-06

杜靜芳, 繆璐歡, 馬歡歡, 等. 拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌的篩選鑒定及抑菌特性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 125-130.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611022. http://www.spkx.net.cn DU Jingfang, MIAO Luhuan, MA Huanhuan, et al. Screening and identifi cation of lactic acid bacteria antagonistic against Enterobacter sakazakii[J]. Food Science, 2016, 37(11): 125-130. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611022. http://www.spkx.net.cn

2015-07-18

遼寧省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目“海水魚加工副產(chǎn)物的高值化利用關(guān)鍵技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化”（2015103020）；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題（LT2014024）

杜靜芳（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：dujingfang2013@163.com

*通信作者：白鳳翎（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制和食品微生物學(xué)。E-mail：baifl ing@163.com