多肽體外抗氧化活性測(cè)定方法的比較

蔡 俊，陳季旺,2,*，王 茹，丁文平,2，吳永寧,3（.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3.國家食品安全風(fēng) 險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 0002）

多肽體外抗氧化活性測(cè)定方法的比較

蔡 俊1，陳季旺1,2,*，王 茹1，丁文平1,2，吳永寧1,3
（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3.國家食品安全風(fēng) 險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100021）

為確定適用于多肽體外抗氧化活性的測(cè)定方法，以丁基羥基茴香醚（butyl hydroxylanisole，BHA）、VC和生育酚（vitamin E，VE）為對(duì)照，測(cè)定大豆肽的還原能力、螯合Fe2＋能力、清除2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及抑制脂質(zhì)體氧化的活性。結(jié)果顯示：在質(zhì)量濃度為0～30 mg/mL時(shí)，大豆肽還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，與BHA、VE、VC類似，大豆肽最大還原能力僅為0.487。大豆肽抑制脂質(zhì)體氧化的活性弱于BHA和VE，但具有較穩(wěn)定的增加趨勢(shì)，最大抑制率達(dá)到20.6%；在質(zhì)量濃度為0～15 mg/mL時(shí)，大豆肽螯合Fe2＋能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，最大螯合率為38.7%。然而，未檢測(cè)出BHA、VE、VC具有螯合Fe2＋的能力；在質(zhì)量濃度為0～3.0 mg/mL時(shí)，大豆肽清除ABTS＋·活性與 VC基本相同，大于BHA和VE，ABTS＋·清除率最大為61.2%。大豆肽DPPH自由基清除率最大僅為2.1%，清除DPPH自由基活性遠(yuǎn)低于VC（45.0%）、BHA（10.1%）和VE（10.7%），表明螯合Fe2+能力、清除ABTS＋·及抑制脂質(zhì)體氧化活性的測(cè)定方法適合用于評(píng)價(jià)大豆肽體外抗氧化活性。

多肽；體外抗氧化活性；測(cè)定方法；適用性

蔡俊, 陳季旺, 王茹, 等. 多肽體外抗氧化活性測(cè)定方法的比較[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 52-57. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611010. http://www.spkx.net.cn

CAI Jun, CHEN Jiwang, WANG Ru, et al. Comparison of various methods for measuring antioxidant activities of polypeptide in vitro[J]. Food Science, 2016, 37(11): 52-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611010. http://www.spkx.net.cn

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，為了保證食品獨(dú)特的色、香、味等食用品質(zhì)，抗氧化劑已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。由于食品種類繁多、生產(chǎn)工藝不同、成品保存方式多樣化等均會(huì)影響食品氧化變質(zhì)，因此對(duì)適用于不同食品加工環(huán)境的抗氧化劑種類和品質(zhì)有了更高要求。同時(shí)，食品安全問題的產(chǎn)生及綠色健康的意識(shí)逐漸形成，使人們開始減少人工合成抗氧化劑的應(yīng)用，逐漸轉(zhuǎn)向安全無毒副作用的天然抗氧化劑，包括動(dòng)植物蛋白水解的多肽類等，這類抗氧化物質(zhì)具有活性強(qiáng)、安全性高、無毒副作用等特點(diǎn)。

已報(bào)道的多種應(yīng)用于抗氧化肽體外抗氧化活性的測(cè)定方法，例如硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）法[1]、油脂過氧化值（peroxide value of fat，POV）測(cè)定方法[2]反映多肽抑制脂質(zhì)氧化的能力，電子自旋共振捕集法（electron spin resonance，ESR）、化學(xué)發(fā)光法[3]、鄰苯三酚法[4]、抗氧化能力指數(shù)（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）[5]等反映多肽清除氧自由基的能力，鄰二氮菲法、水楊酸法[6]、比色法[3]等反映多肽清除羥自由基的能力，清除2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基[7]反映多肽清除自由基的能力，鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing/ antioxidant power，F(xiàn)RAP）法[8]、鐵氰化鉀法[9]測(cè)定多肽的還原能力，菲啰嗪（Ferrozine）法[10]測(cè)定多肽螯合Fe2＋的能力，鄰苯二酚紫[11]測(cè)定多肽螯合Cu2＋能力等。但具體實(shí)驗(yàn)中不同的方法測(cè)定多肽抗氧化活性的結(jié)果差別較大，所得結(jié)論甚至相反，對(duì)后續(xù)研究人員造成困擾。目前的研究大多直接沿用上述方法評(píng)價(jià)多肽的體外抗氧化活性，少有其適用性及適用原因的探討。

本實(shí)驗(yàn)采用還原能力、螯合Fe2＋能力、清除ABTS＋·、DPPH自由基及抑制大豆卵磷脂氧化活性5種常用的方法測(cè)定大豆肽的體外抗氧化活性，明確適用于大豆肽體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法并探討適用原因，以期為抗氧化活性肽的研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆肽粉（以干基計(jì)，蛋白質(zhì)含量90.0%、肽含量80%、灰分6.5%、粗脂肪1%） 中食都慶（山東）生物技術(shù)有限公司；丁基羥基茴香醚（butyl hydroxylanisole，BHA）（純度99.9%） 鄭州瑞佳食品添加劑有限公司；VC（純度99.9%） 河南盛之德商貿(mào)有限公司；VE（純度98%）、大豆卵磷脂（純度99.9%） 西亞試劑有限責(zé)任公司；ABTS、Ferrozine、DPPH Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、六水合三氯化鐵、無水乙醇、過硫酸鉀、氯化亞鐵、氯化鐵、硫代巴比妥酸、鹽酸、氯仿 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其中鹽酸為優(yōu)級(jí)純；其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16C高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌機(jī) 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子萬用爐 北京市光明醫(yī)療儀器廠；XH-C漩渦混合器 金壇市醫(yī)療儀器廠；WF J7200型可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；WHY-2（SHA-B）往返水浴恒溫振蕩器 金壇梅香儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽還原能力的測(cè)定

參照榮建華等[12]方法進(jìn)行測(cè)定。在比色管中依次添加1 mL樣品（對(duì)照組用1 mL去離子水代替）、2.5 mL l g/100 mL的鐵氰化鉀和2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液，混勻后50 ℃保溫20 min。快速冷卻10 min后加入2.5 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸（trichloroacetic，TCA），混勻后以4 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1 g/100 mL的FeCl3溶液，混勻靜置10 min，于700 nm波長處測(cè)定吸光度（A700nm）。

1.3.2 螯合Fe2＋能力的測(cè)定

參照Teheri等[13]的方法并稍作修改。取0.5 mL樣品，加入3.2 mL蒸餾水，然后加入0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液混勻，靜置3 min。加入0.2 mL 5 mmol/L的Ferrozine溶液混勻（以去離子水為空白組），反應(yīng)10 min后，于562 nm波長處測(cè)定吸光度。每組平行測(cè)定3次，取平均值計(jì)算樣品的清除率。按下式計(jì)算Fe2＋螯合率。

1.3.3 清除自由基活性

1.3.3.1 ABTS＋·清除率的測(cè)定

參照胥莉等[14]的方法并稍作修改。將7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和7.35 mmol/L的K2S208溶液5 mL混合后在室溫下避光放置12～16 h形成ABTS儲(chǔ)備液，使用前用無水乙醇稀釋成ABTS工作液，使其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。吸取50 μL樣品與ABTS工作液3 mL混合均勻，室溫反應(yīng)10 min后，于734 nm波長處測(cè)定其吸光度（A樣品），空白組以水代替樣品（A空白）。按下式計(jì)算ABTS＋·清除率。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Xie Zhengjun等[10]的方法并稍作修改。在試管中加入50 μL樣品和3 mL 50 μg/mL的 DPPH溶液（無水乙醇為溶劑），混勻后在室溫條件下避光放置30 min。在517 nm波長處測(cè)吸光度，以蒸餾水為空白。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4 抑制脂質(zhì)體氧化活性

1.3.4.1 脂質(zhì)體制備

將大豆卵磷脂添加到10 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液中，冰浴振蕩直至完全溶解[15]，配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的脂質(zhì)體。

1.3.4.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acidreactive substances，TBARS)的測(cè)定

參照吳瑕等[1]的測(cè)定方法并稍作修改。1 mL樣品溶液（對(duì)照用1 mL水代替1 mL樣品溶液）與5 mL的脂質(zhì)體溶液混合，脂質(zhì)的氧化由鐵的氧化還原反應(yīng)引發(fā)，將0.1 mL濃度為50 mmol/L的FeCl3和0.1 mL濃度為30 mmol/L的抗壞血酸加入脂質(zhì)體氧化體系中。樣品在37 ℃水浴中保溫l h后，并迅速測(cè)定TBARS值。

取1 mL樣品加入3 mL三氯乙酸-鹽酸溶液（2.5 g TCA與0.6 mL 0.6 mol/L HCl混合后稀釋到100 mL）、3 mL TBA溶液（0.02 mol/L），混勻后，沸水浴中反應(yīng)30 min，冷卻。取5 mL樣品加入等體積的氯仿，3 000 r/min下離心30 min，532 nm波長處測(cè)定吸光度值。TBARS值以每升脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛的毫克數(shù)表示。

式中：A532nm為樣品的吸光度值；Vs為樣品的體積（1 mL）；9.48為常量，與硫代巴比妥酸反應(yīng)物的稀釋倍數(shù)和摩爾消光系數(shù)有關(guān)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件Microsoft Offi ce Excel 97－2003作圖及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽還原能力

抗氧化劑的還原能力與抗氧化活性成正相關(guān)。根據(jù)還原能力的測(cè)定方法，在700 nm波長處測(cè)定的吸光度值越大，則抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)[12]。由圖1可知，在0.05～0.30 mg/mL范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度的增加，BHA、VC、VE的吸光度增大，還原能力增強(qiáng)，VC的增加幅度最大，其次是BHA，VE的增加幅度不明顯，最大質(zhì)量濃度時(shí)吸光度僅為0.153，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于相同質(zhì)量濃度下的VC和BHA。0.05 mg/mL時(shí)，VC的還原能力是BHA的1.4 倍，隨著質(zhì)量濃度的增大，兩者還原能力的差別越來越明顯，0.30 mg/mL時(shí)，VC的還原能力是BHA的3.2倍，增加了1.8 倍。

在5～30 mg/mL的范圍內(nèi)，大豆肽的還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增大，增加程度與BHA相當(dāng)。當(dāng)吸光度約為0.5時(shí)，大豆肽、BHA和VC的質(zhì)量濃度依次為30、0.20、0.1 mg/mL，大豆肽的質(zhì)量濃度分別為BHA、VC的150、300 倍。由圖1可知，大豆肽的還原能力約是VE的2～3 倍，但質(zhì)量濃度是VE的100 倍，說明相同質(zhì)量濃度時(shí)大豆肽的還原能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VE、BHA和VC。

圖1 大豆肽還原能力Fig. 1 Reducing power of soybean peptide

VC的強(qiáng)還原能力可能與其分子結(jié)構(gòu)中的二烯醇式結(jié)構(gòu)和內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)，該結(jié)構(gòu)使得VC性質(zhì)極為活潑，分子中的二烯醇基具有極強(qiáng)的還原性，易被氧化為二酮基，成為去氫VC[16]。BHA與VE較低的還原能力可能其自身或反應(yīng)體系的極性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為水溶液反應(yīng)體系，使用的BHA與VE均為脂溶性抗氧化劑，導(dǎo)致混合后BHA或VE不能與鐵氰化鉀充分接觸，使最終生成的顯色物質(zhì)濃度低，呈現(xiàn)較低的還原能力。大豆肽較低的還原能力可能與本身含有的或暴露出的含硫氨基酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸[17]的數(shù)量太少有關(guān)。

因此，還原能力的測(cè)定方法不適合用于評(píng)價(jià)大豆肽的體外抗氧化能力。

2.2 多肽螯合Fe2＋能力

啡咯嗪是一種發(fā)色螯合劑，能強(qiáng)烈螯合Fe2＋，形成一種穩(wěn)定的紅色配合物，在562 nm波長處有強(qiáng)吸收，當(dāng)有螯合試劑存在時(shí)，啡咯嗪螯合Fe2＋形成的配合物質(zhì)量濃度下降，導(dǎo)致紅色減退，通過測(cè)定顏色的減退可以估計(jì)共存的螫合劑螯合金屬離子的能力[18]。

表1 大豆肽螯合FFee22＋能力Table 11 FFee22＋-chelating capacity of soybean peptidee

由表1可知，測(cè)定BHA、VE螯合Fe2＋能力時(shí)，最低質(zhì)量濃度（0.05 mg/mL）的吸光度分別為0.641、0.662，略大于未添加任何抗氧化劑的空白組的吸光度。然而，隨著質(zhì)量濃度的增大，兩者吸光度未見降低反而越來越大。吸光度增加的原因可能是脂溶性抗氧化劑如BHA、VE與水溶液體系混合后導(dǎo)致整個(gè)反應(yīng)體系變渾濁，該現(xiàn)象隨質(zhì)量濃度的增大而加劇，因此該方法不能用于BHA、VE的體外抗氧化活性測(cè)定。

在0.05～0.30 mg/mL的范圍內(nèi)，VC的吸光度變化不明顯。低質(zhì)量濃度處吸光度減小，說明VC具有微弱的螯合Fe2＋能力，質(zhì)量濃度的增大并未增加該抗氧化能力，說明該方法不適合用于評(píng)價(jià)VC的體外抗氧化能力。

在質(zhì)量濃度為2.5～15.0 mg/mL時(shí)，大豆肽呈現(xiàn)良好的螯合Fe2＋的能力。隨著質(zhì)量濃度的增大，螯合能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，螯合率為36.2%，繼續(xù)增加大豆肽質(zhì)量濃度，其螯合Fe2＋能力較為穩(wěn)定，最大為38.7%。大豆肽具有良好的螯合Fe2＋能力，其可能的原因有三點(diǎn)：一是大豆肽中含有組氨酸，組氨酸是金屬結(jié)合氨基酸；二是大豆肽的側(cè)鏈氨基酸具有能與螯合Fe2＋的COO－結(jié)構(gòu)；三是大豆肽或其組成氨基酸具有—CH＝N:結(jié)構(gòu)，能螯合Fe2＋[19]。

因此，螯合Fe2＋離子能力的測(cè)定方法適合用于大豆肽的體外抗氧化活性測(cè)定。

2.3 多肽清除自由基能力

2.3.1 清除ABTS＋·能力

ABTS＋·清除法已廣泛用于抗氧化劑的體外抗氧化活性的測(cè)定。在反應(yīng)體系中，ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS＋·，抗氧化劑與ABTS＋·發(fā)生反應(yīng)使反應(yīng)體系褪色，在ABTS＋·的特征吸收波長下（734 nm）檢測(cè)吸光度的變化，能反映抗氧化劑清除ABTS＋·能力的高低[20]。

圖2 大豆肽清除ABBTTSS＋·能力Fig. 2 ABTS radical scavenging capacity of soybean peptide

由圖2可知，質(zhì)量濃度在0.05～0.30 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，3 種抗氧化劑對(duì)ABTS＋·的清除率增大，并且BHA對(duì)ABTS＋·的清除能力高于VE，VC的清除能力顯著高于BHA。VC對(duì)ABTS＋·的清除能力是BHA的1.9～2.2 倍，是VE的4.7 倍左右。質(zhì)量濃度為0.5～3.0 mg/mL時(shí)，大豆肽清除ABTS＋·的能力也隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，清除能力與VC相當(dāng)。

大豆肽具有良好的清除ABTS＋·能力是因?yàn)楦缓潴w，具有提供氫質(zhì)子的能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的目的[12]。大豆肽的抗氧化性可能與其氨基酸組成有關(guān)，許多氨基酸都表現(xiàn)出抗氧化性，例如胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和色氨酸等[21]。

2.3.2 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm波長處有強(qiáng)烈吸收。在有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)而使其褪色，褪色程度與其接受的電子成定量關(guān)系[22]。

圖3 大豆肽清除DPPPPHH 自由基能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of soybean peptide

由圖3可知，在0.05～0.30 mg/mL的范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，BHA、VE、VC清除DPPH自由基的活性增強(qiáng)，BHA、VE清除DPPH自由基活性的增加趨勢(shì)幾乎一致，但都小于VC。相同質(zhì)量濃度時(shí)VC清除DPPH自由基的能力是BHA、VE的4.5 倍左右。在0.5～3.0 mg/mL的范圍內(nèi)，大豆肽清除DPPH自由基的能力極低，最大清除率僅為2.1%。

自由基均含有未配對(duì)電子，使DPPH自由基或ABTS＋·具有強(qiáng)氧化性，VC對(duì)這2 種自由基較高的清除活性是因?yàn)槠渥陨硭邆錁O強(qiáng)的還原能力。VE對(duì)DPPH自由基或ABTS＋·的清除能力與其他酚類抗氧劑類似，都是與活性較高的自由基ROO?相結(jié)合，形成穩(wěn)定的化合物，起到鏈終止的作用[23]。BHA是通過自身脫氫，與活性DPPH自由基或ABTS＋·結(jié)合達(dá)到清除目的[24]。

大豆肽對(duì)DPPH自由基和ABTS＋·清除活性的差異可能原因：一是ABTS采用去離子水為溶劑配制儲(chǔ)備液，以無水乙醇稀釋成工作液，DPPH采用無水乙醇配制溶液，加入相同質(zhì)量濃度、微量體積的大豆肽溶液時(shí)，大豆肽不能充分接觸DPPH自由基，顯示出較低的活性；二是大豆肽與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)后，未參與反應(yīng)的大豆肽和DPPH自由基及兩者反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物留在各自溶液體系中，當(dāng)溶劑量不足時(shí)，局部濃度過高引起的渾濁程度要比大豆肽與DPPH自由基作用產(chǎn)生的褪色程度高，使吸光度變大（50 μL 30 mg/mL的大豆肽與3 mL DPPH混合溶液的吸光值為0.716，空白組為0.673）。三是DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以N為中心的自由基，相對(duì)于DPPH自由基，活化后的ABTS＋·更敏感[25]。

因此，清除ABTS＋·測(cè)定方法更適合評(píng)價(jià)大豆肽的體外抗氧化能力。

2.4 多肽抑制脂質(zhì)氧化能力

TBARS法測(cè)定的是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物之一的丙二醛（malondialdehyde，MDA）及其他可以與TBA反應(yīng)的物質(zhì)的質(zhì)量濃度。在較低pH值（pH 3.0左右）和高溫下，丙二醛等可以與TBA生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532 nm波長處有特征吸收。吸光度越小，說明生成的丙二醛等物質(zhì)的含量越少[26]。

圖4 大豆肽的TBARRSS值Fig. 4 TBARS value of soybean peptide

由圖4可知，添加了BHA和VE的脂質(zhì)體具有明顯的抑制脂質(zhì)氧化的能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增大，脂質(zhì)體的吸光度值越來越小。添加了0.10 mg/mL BHA后脂質(zhì)體的TBARS值為4.92 mg/L，與未添加任何抗氧化劑的脂質(zhì)體TBARS值12.93 mg/L相比，抑制率達(dá)到了62.0%。繼續(xù)增加BHA質(zhì)量濃度，BHA抑制脂質(zhì)氧化能力的增加趨勢(shì)開始變緩，添加了0.30 mg/mL BHA后脂質(zhì)體的TBARS值為3.55 mg/L，抑制率為72.5%。

添加了0.10 mg/mL VE后脂質(zhì)體TBARS值為6.98 mg/L，與未添加任何抗氧化劑的脂質(zhì)體TBARS值12.93 mg/L相比，抑制率達(dá)到了46.0%。繼續(xù)增加VE的質(zhì)量濃度，抑制脂質(zhì)氧化能力的增加趨勢(shì)也開始變緩，最終添加0.30 mg/mL VE后脂質(zhì)體的TBARS值為4.98 mg/L，抑制率為61.5%。

低質(zhì)量濃度的VC具有較低的抑制脂質(zhì)氧化活性，然而，繼續(xù)增大質(zhì)量濃度，脂質(zhì)體TBARS值開始增加，并且維持在12.58～13.21 mg/L，與未添加抗氧化劑的脂質(zhì)體TBARS值12.93 mg/L幾乎相同。

隨著大豆肽質(zhì)量濃度的增大，脂質(zhì)體TBARS值減小，抗氧化能力增強(qiáng)，但與BHA相比，增幅較平緩。當(dāng)大豆肽質(zhì)量濃度從5 mg/mL增加到30 mg/mL時(shí)，脂質(zhì)體的TBARS值由12.10 mg/L減少到10.30 mg/L，與未添加任何抗氧化劑的脂質(zhì)體相比（TBARS值12.93 mg/L），抑制率分別為6.4%、20.6%，說明大豆肽具有較好的抑制脂質(zhì)氧化的能力。

BHA通過化學(xué)鍵的斷裂，釋放出體積小、親和力強(qiáng)的氫自由基，氫自由基可以迅速與脂類等化合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的自由基結(jié)合，生成穩(wěn)定的化合物，從而終止脂類等的氧化還原反應(yīng)，達(dá)到抑制脂質(zhì)過氧化的目的[24,27]。VE能將一個(gè)自由基中間體氧化成醌，將ROO·轉(zhuǎn)變成化學(xué)性質(zhì)不活潑的ROOH，中斷脂類過氧化的連鎖反應(yīng)起到抗氧化的作用[28]。

Minotti等[29]認(rèn)為Fe2＋被完全氧化為Fe3＋或Fe3＋被完全還原為Fe2＋均不能使脂質(zhì)過氧化啟動(dòng)，因此，凡是能影響鐵離子氧化還原過程的因素均會(huì)影響脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，VC能引起鐵離子氧化還原反應(yīng)啟動(dòng)脂質(zhì)的氧化，VC在脂質(zhì)體系中不僅沒有表現(xiàn)出對(duì)脂質(zhì)的抗氧作用，反而引起脂質(zhì)的加速氧化過程，使TBARS值升高，與實(shí)驗(yàn)后期結(jié)果相吻合。同時(shí)，低質(zhì)量濃度下的VC表現(xiàn)出的抑制脂質(zhì)過氧化的能力可能與其螯合Fe2＋有關(guān)，當(dāng)Fe2＋被螯合，催化脂質(zhì)氧化的Fe3＋減少，一定程度上能抑制脂質(zhì)的過氧化。螯合Fe2＋實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低質(zhì)量濃度VC具有螯合Fe2＋的能力。

大豆肽在脂質(zhì)體系中的具有抑制脂質(zhì)過氧化的能力可能有以下原因：一是與大豆肽含有的疏水性氨基酸有關(guān)，Chen Huaming[30]和Rajapakse[31]等認(rèn)為多肽的N-端為疏水性氨基酸（例如纈氨酸或亮氨酸）時(shí)，抗氧化活性較高。因?yàn)槭杷园被崮苁箍寡趸呐c脂肪酸的相互作用增強(qiáng)，提高了其捕捉脂質(zhì)自由基的能力；二是大豆肽分子會(huì)包裹住脂質(zhì)分子，阻止其氧化；三是大豆肽側(cè)鏈氨基酸能提供氫自由基；四是大豆肽具有良好的螯合Fe2＋能力[19]。Hernándezledesma等[32]將等摩爾的氨基酸混合物與相應(yīng)肽的抗氧化性比較，前者的抗氧化能力要高，說明肽鍵或者肽的空間結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化活性有負(fù)面影響。這也可能是大豆肽抑制脂質(zhì)氧化能力較低的原因。

考慮到抑制脂質(zhì)體氧化活性方法是直觀反應(yīng)大豆肽對(duì)脂質(zhì)氧化的抑制效果，因此，該方法較適合評(píng)價(jià)大豆肽的體外抗氧化能力。

3 結(jié) 論

采用還原能力、螯合Fe2＋能力、清除ABTS＋·或DPPH自由基活性及抑制脂質(zhì)體氧化活性方法測(cè)定大豆肽的體外抗氧化活性，結(jié)果表明這些測(cè)定方法對(duì)多肽體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)具有適用性，選擇較適合的測(cè)定方法能更準(zhǔn)確測(cè)定多肽的抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)中，大豆肽的體外抗氧化活性主要表現(xiàn)為螯合Fe2＋能力、清除ABTS＋·及抑制脂質(zhì)體氧化能力；3 種抗氧化劑中VC具有較好的還原能力和清除自由基能力，BHA具有較好的還原能力、清除ABTS＋·活性及較強(qiáng)的抑制脂質(zhì)氧化能力，VE具有良好的抑制脂質(zhì)氧化能力。說明螯合Fe2＋能力、清除ABTS＋·及抑制脂質(zhì)體氧化活性的測(cè)定方法更適用于多肽體外抗氧化能力的評(píng)價(jià)，還原能力及清除DPPH自由基能力不適合評(píng)價(jià)大豆肽的體外抗氧化能力。

[1] 吳瑕, 江連洲, 王鑫, 等. 大豆蛋白酶水解物抗氧化活性的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào), 2010, 25(11): 37-42.

[2] 周柏玲, 李蕾, 孫秋雁, 等. 玉米醇溶蛋白復(fù)合膜包衣對(duì)核桃仁酸敗抑制效果的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2004, 20(3): 180-183. DOI:10.3321/j.issn:1002-6819.2004.03.043.

[3] 陳海光, 葉丹杰. 氧自由基及其清除劑[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 15(1): 53-60.

[4] 陳金娥, 豐惠君, 張海容. 紅茶、綠茶、烏龍茶活性成分抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(3): 62-66. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.03.013.

[5] 續(xù)潔琨, 姚新生, 栗原博. 抗氧化能力指數(shù)(ORAC)測(cè)定原理及應(yīng)用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(8): 1015-1021. DOI:10.3321/ j.issn:1001-1978.2006.08.029.

[6] 馬震雷, 鄭萍. 海參多肽提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(34): 16815-16817. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2012.34.107.

[7] WANG Bin, LI Zhongrui, CHI Changfeng, et al. Preparation and evaluation of antioxidant peptides from ethanol-soluble proteins hydrolysate of sphyrna lewini muscle[J]. Peptides, 2012, 36(2): 240-250. DOI:10.1016/j.peptides.2012.05.013.

[8] 趙文恩, 李茜倩. FRAP法測(cè)定大棗棗皮紅色素的總抗氧化能力[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版), 2011, 32(3): 28-35. DOI:10.3969/ j.issn.1671-6833.2011.03.007.

[9] 黃海蘭, 徐波, 李增新, 等. 嶗山蘑菇抗氧化成分提取及其活性研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 61-66. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2005.09.009.

[10] XIE Zhengjun, HUANG Junrong, XU Xueming, et al. Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2008, 111(2): 370-376. DOI:10.1016/ j.foodchem.2008.03.078.

[11] WANG L L, XIONG Youling L.. Inhibition of lipid oxidation in cooked beef patties by hydrolyzed potato protein is related to its reducing and radical scavenging ability[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(23): 9186-9192. DOI:10.1021/jf051213g.

[12] 榮建華, 李小定, 謝筆鈞. 大豆肽體外抗氧化效果的研究[J]. 營養(yǎng)衛(wèi)生, 2002, 23(11): 118-120. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2002.11.031.

[13] TEHERI A, SABEENA FARVIN K H, CHARLOTTE J, et al. Antioxidant activities and functional properties of protein and peptide fractions isolated from salted herring brine[J]. Food Chemistry, 2014(142): 318-326. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.06.113.

[14] 胥莉, 李陽, 劉學(xué)波. 車前子總黃酮和總多糖粗提物的體外抗氧化性能對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 142-146.

[15] 劉明, 羅遠(yuǎn)栩, 倪輝, 等. 固態(tài)發(fā)酵大豆制備的抗氧化肽的活性分析[J]. 大豆科學(xué), 2007, 26(3): 381-385. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9841.2007.03.020.

[16] 王春利, 李京東. 荼多酚和維生素C對(duì)橄欖油抗氧化性的影響[J]. 化學(xué)工程師, 2012(9): 57-59.

[17] 張暉, 唐文婷, 王立, 等. 抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 32(7): 673-679. DOI:10.3969/ j.issn.1673-1689.2013.07.001.

[18] SILVA B A, MALVA J O, DIAS A C P. St. John’s Wort (Hypericum perforatum) extracts and isolated phenolic compounds are effective antioxidants in several in vitro models of oxidative stress[J]. Food Chemistry, 2008, 110(3): 611-619. DOI:10.1016/ j.foodchem.2008.02.047.

[19] KONG B H, XIONG Youling L.. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action+[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54: 6059-6068. DOI:10.1021/jf060632q.

[20] 鄭善元, 陳填烽, 鄭文杰, 等. 單叢茶水提物清除DPPH和ABTS自由基的光譜學(xué)研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2010, 30(9): 2417-2423. DOI:10.3964/j.issn.1000-0593(2010)09-2417-07.

[21] 何慧, 謝筆鈞, 楊卓, 等. 大豆蛋白和玉米蛋白酶解肽及其活性研究[J]. 糧油食品科技, 2002, 10(1): 14-16. DOI:10.3969/ j.issn.1007-7561.2002.01.007.

[22] 樊梓鸞, 王振宇. 紅豆越橘體外抗氧化和抗細(xì)胞增殖活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(10): 1081-1086. DOI:10.3969/ j.issn.1673-9078.2010.10.011.

[23] 李良, 王鑒, 祝寶東, 等. 生育酚的高效抗氧化性及其應(yīng)用[J]. 四川化工, 2006, 9(4): 16-19.

[24] 劉曉輝, 解慶柱, 劉剛, 等. 簡述抗氧化劑的作用機(jī)理及其應(yīng)用[J]. 2011年山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)委員會(huì)年會(huì)論文集, 2011:108-111.

[25] 王會(huì), 郭立, 謝文磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測(cè)定方法(一)[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(3): 92-98. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2006.03.026.

[26] OHKAWA H, OHISHI N, YAGI K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J]. Analytical Biochemistry, 1979, 95(2): 351-358. DOI:10.1016/0003-2697(79)90738-3.

[27] 朱雪梅, 吳俊鋒, 胡蔣寧, 等. α-生育酚在花生油、芝麻油和菜籽油中的抗氧化效能[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(10): 85-90.

[28] 劉嶺, 陳復(fù)生, 薛靜玉. 復(fù)配抗氧化劑的研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑, 2013, 2(21): 172-176. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2012.02.021.

[29] MINOTTI G, AUST S D. The role of iron in the initiation of lipid peroxidation[J]. Chemistry and Physics of Lipids, 1987, 44(2/3/4): 191-208. DOI:10.1016/0009-3084(87)90050-8.

[30] CHEN H M, MURAMOTO K, YAMAUCHI F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43(3): 574-578.

[31] RAJAPAKSE N, MENDIS E, JUNG W K, et al. Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properti es[J]. Food Research International, 2005, 38(2): 175-182. DOI:10.1016/j.foodres.2004.10.002.

[32] HERNáNDEZLEDESMA B, DáVALOS A, BAR TOLOMEB, et al. Preparation of antioxidant enzymatic hydrolysates from α-lactalbumin and β-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(3): 588-593. DOI:10.1021/jf048626m.

Comparison of Various Methods for Measuring Antioxidant Activities of Polypeptide in Vitro

CAI Jun1, CHEN Jiwang1,2,*, WANG Ru1, DING Wenping1,2, WU Yongning1,3
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China; 3. National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China)

Various methods including reducing power, Fe2+-chelating, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) radical scavenging, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging and liposome oxidation inhibition capacity assays were used for evaluating the antiox idant activities of soybean peptide employing butyl hydroxylanisole (BHA), VC and VE as controls, aiming to investigate the applicability of these assays for measuring the antioxidant activities of polypeptide in vitro. The results showed that the reducing power of soybean peptide increased with its concentration in the range of 0–30 mg/mL, attaining a maximum value of only 0.487, and BHA, VC, and VE similarly exhibited reducing power in a concentration-dependent manner. The inhibitory activity of soybean peptide against liposome oxidation was lower than that of BHA and VE, and this antioxidant activity exhibited a stable upward trend with increasing concentration of soybean peptide, reaching maximum percentage inhibition of 20.6%. Fe2+-chelating capacity of soybean peptide increased up to 38.7% with its con centration in the range of 0–15 mg/mL, whereas BHA, VE and VC had no such activity. Soybean peptide in the concentration range of 0–3.0 mg/mL possessed ABTS radical scavenging activity very similar to that of VC and higher than that of BHA and VE, and the maximum scavenging percentage was 61.2%. However, the maximum DPPH radical scavenging percentage of soybean peptide was only 2.1%, which was much lower than that of VC (45.0%), BHA (10.1%), and VE (10.7%). Therefore, Fe2+-chelating capacity, ABTS radical scavenging, and liposome oxidation inhibition c apacity assays can be used to investigate the antioxidant activity of soybean peptide in vitro.

polypeptide; antioxidant activity in vitro; assay; applicability

10.7506/spkx1002-6630-201611010

TS201.4

A

2015-07-20

糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201513006-3）；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014CFB888）；

武漢市國際合作項(xiàng)目（201231234466）；武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014cx013）

蔡俊（1989—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：cai7413@126.com

*通信作者：陳季旺（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：jiwangchen1970@126.com