重組PEDV-S干酪乳桿菌的構(gòu)建及其表達(dá)

岳璐，李昆鵬，侯喜林，余麗蕓，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶　163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

重組PEDV-S干酪乳桿菌的構(gòu)建及其表達(dá)

岳璐1，李昆鵬1，侯喜林2，余麗蕓1，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）可引起豬的嘔吐、腹瀉及脫水。通過將其S1片段逆轉(zhuǎn)錄連接到干酪乳桿菌表面表達(dá)載體pLA上，使其表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步研究其特性及免疫原性奠定基礎(chǔ)。采用TRIzol的方法從PEDV中提取RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)獲得該病毒的S1片段，然后將該基因連接到載體pLA中并表達(dá)。重組菌經(jīng)過培養(yǎng)表達(dá)之后，利用Western blot檢測融合蛋白大小約為81 kDa；重組蛋白可被兔源的抗PgsA血清和鼠源的抗PEDV血清所識別。表明重組干酪乳桿菌成功的表達(dá)了融合蛋白。

豬流行性腹瀉病毒；干酪乳桿菌；RT-PCR技術(shù)；Western blot技術(shù)

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種接觸性傳染?。?］。其主要引起仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水，死亡率高，給我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以研制PEDV新型疫苗是十分必要的。S蛋白是PEDV一個(gè)表面的結(jié)構(gòu)蛋白，它既含有介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞的受體結(jié)合域，又擁有介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位。所以，PEDV S蛋白在介導(dǎo)感染宿主產(chǎn)生中和抗體的過程中發(fā)揮重要作用。

乳酸菌是食品級安全菌［2］，利用乳酸菌為表達(dá)載體研制口服疫苗安全無毒，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。乳酸菌口服疫苗通過胃腸粘膜進(jìn)行抗原呈遞，使用方便而且較傳統(tǒng)注射途徑的免疫效果和依從性好，是理想的疫苗，有廣闊的發(fā)展前景［3-5］。

實(shí)驗(yàn)所用的載體為本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的pLA表達(dá)型載體［6-7］，目的蛋白能夠在細(xì)胞外表達(dá)，而且重組乳酸菌在表達(dá)過程中不需要誘導(dǎo)劑，如果使用誘導(dǎo)型啟動子，構(gòu)建的重組菌應(yīng)用于本體動物會受到誘導(dǎo)劑使用限制，增加了應(yīng)用的困難?，F(xiàn)設(shè)計(jì)的載體很好地解決了這個(gè)問題，突破了應(yīng)用的瓶頸。PEDV S1片段上包括了S抗原的所有4個(gè)抗原表位，因此，為了更好地表達(dá)S抗原，選擇了S1片段作為克隆目的基因。利用RT-PCR獲得PEDV全長cDNA，通過PCR擴(kuò)增出DNA，然后連接到大腸桿菌-干酪乳桿菌穿梭表達(dá)載體pLA上，電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌中，利用pLA/L.casei系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，為進(jìn)一步研究其特性及免疫原性奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）由實(shí)驗(yàn)室保存；PEDV CH/HLJHRB/2011由實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；大腸桿菌（E. coli）-干酪乳桿菌（L.casei）穿梭表達(dá)質(zhì)粒pLA由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，該質(zhì)粒含有pgsA融合蛋白基因。

1.1.2主要試劑和儀器

TRIzol試劑購自Intrivigen公司；M-MLV RNase H購自Fermentas公司；rTaq購自TaKaRa公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）或羊抗兔IgG-HRP抗體及FITC標(biāo)記的羊抗兔（IgG-FITC）或羊抗鼠IgGFITC均購自Sigma公司；鼠源抗PEDV或兔源抗PgsA多克隆陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；CR21型高速立式離心機(jī)，日本日立公司（HITACHI）；ABI Veriti PCR儀，美國Applied Biosystems公司；TDL-5M臺式大容量冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司，DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠，powerpac universal電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)兩對特異性引物，擴(kuò)增PEDV-S1（1 086 bp）。引物序列為：P1 5′-CGCGGATCCGATGTCACCAGGTGCTCAG（BamHⅠ）、P2 5-CGCGTCGACTTAAGTGGAGTTGTAAGTATC（SalⅠ），引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56.5℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.2PEDV的擴(kuò)繁

將PEDV病毒接種于細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%的Vero單層細(xì)胞，37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱感作1 h后，倒掉病毒液，加入2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)到75%以上時(shí)，收獲病毒懸液，反復(fù)凍融三次，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液即為病毒液。

1.2.3病毒基因組RNA提取

采用TRIzol法提取PEDV病毒基因組RNA。首先取經(jīng)Vero細(xì)胞擴(kuò)繁的PEDV病毒液200 μL加在1.5 mL的eppendorf管中，再加入800 μL Trizol試劑，充分混勻，放置10 min；加入200 μL氯仿，用力震蕩離心管，室溫放置10 min；4℃，13 000 r·min-1離心15 min，將上層RNA吸到另一新的eppendorf管中；加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫放置10 min；4℃，13 000 r·min-1離心15 min，小心棄去上清；用75%乙醇清洗一遍，4℃，10 000 r·min-1離心15 min，小心棄去上清，室溫放置10 min，待乙醇揮發(fā)干凈后；向管內(nèi)加入10 μL的DEPC水，進(jìn)行RT-PCR。

1.2.4目的基因的RT-PCR擴(kuò)增

以基因組RNA為模板，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄說明書操作方法利用下游引物特異性反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在滅菌的無RNA酶的PCR eppendorf管內(nèi)，加入RNA模板12.5 μL，下游引物1 μL，70℃水浴5 min，立即冰上放置2 min，取出后加入5× Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，37℃水浴5 min，然后加入MMLV RNase 1 μL，混勻后42℃2.5 h，70℃滅活10 min，終止反應(yīng)，冰上放置2 min。然后以cDNA為模板，通過PCR方法合成DNA。

1.2.5重組L.casei的構(gòu)建

通過設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出S1片段，然后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收S1片段，利用酶BamHⅠ和SalⅠ分別對S1片段和pLA載體進(jìn)行雙酶切，酶切之后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；然后將回收的S1片段與pLA載體相連接。得到的重組質(zhì)粒命名為pLAPEDV-S1載體。采用常規(guī)方法制備L.casei感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒對照在2.5 kV、200 Ω、25 μF的電擊條件下電轉(zhuǎn)化，電擊時(shí)間約為4～5 ms，電轉(zhuǎn)之后將其涂布于MRS固體培養(yǎng)基上（含氯霉素34 μg·mL-1），37℃厭氧倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，用PCR的方法進(jìn)行陽性克隆鑒定。

1.2.6Western blot檢測

將重組菌pLA-PEDV-S1/L.casei和pLA/L.casei分別按2%接種于含有氯霉素的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃靜置過夜。第二日，取昨天的菌液接種于含氯霉素抗性的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，取表達(dá)8 h的菌液1 mL，4 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，收集沉淀后加入500 μL的10 mg·mL-1溶菌酶37℃孵育35 min，4 500 r·min-1離心5 min，棄上清，收集沉淀，然后加入80 μL的SDS-PAGE Loading Buffer（含β-巰基乙醇）重懸，沸水浴煮沸10 min，12 000 r·min-1離心3 min，取上清20 μL點(diǎn)樣，以10%的SDS-PAGE檢測重組蛋白。然后將跑完的膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，以鼠源PEDV和兔源PgsA陽性血清為一抗，以相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG（1∶5 000）為二抗，對重組菌進(jìn)行Western blot鑒定重組表達(dá)蛋白。

2　結(jié)果

2.1PEDV S1基因反轉(zhuǎn)錄的PCR結(jié)果

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果可見1條約為1 086 bp的特異性條帶，與預(yù)期DNA片段大小一致。結(jié)果如下圖1所示。

圖1　RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1Agarose gel electrophoresis of RT-PCR product

2.2重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果和PCR結(jié)果

①重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，結(jié)果切出了大小約為1 086 bp和6 346 bp的兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相符，篩選出陽性重組子pLA-PEDV-S1（見圖2）。

圖2　重組質(zhì)粒pLA-PEDV-S1的酶切產(chǎn)物Fig.2Identification of pLA-PEDV-S1 by enzyme digestion

②以重組質(zhì)粒為模板，通過PCR鑒定，得到一條大小約為1086 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖3）。

圖3　重組質(zhì)粒pLA-PEDV-S1的PCR產(chǎn)物Fig.3Identification of recombinant plasmid by PCR

2.3PCR擴(kuò)增干酪乳桿菌轉(zhuǎn)化子的結(jié)果

將鑒定好的重組質(zhì)粒pLA-PEDV-S1電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌中，提取質(zhì)粒，通過PCR方法進(jìn)行鑒定，可見明顯的目的條帶（1 086 bp），與插入片段的大小一致，而對照組未見目的條帶（圖4）。

2.4重組蛋白表達(dá)的Western blot鑒定

以PgsA陽性血清為一抗，以羊抗兔為二抗進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示，PgsA陽性血清能夠與pLA-PEDV-S1/L.casei和空載體轉(zhuǎn)化的對照菌發(fā)生反應(yīng)，表達(dá)的重組菌分別為81kDa和41 kDa（圖5）。

圖4　重組干酪乳桿菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.4Identification of recombinant L.casei by PCR

3　討論

PEDV可引起仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水，致死率高，主要是通過感染豬排出的糞便或其他污染物經(jīng)口感染，新生仔豬的潛伏期為1～2 d，育肥豬為2天以上。PEDV感染之后引起的相關(guān)疾病為豬腸壁變薄、水樣腹瀉及脫水等等。在過去的30年里，豬流行性腹瀉病毒在亞洲尤其是我國豬場感染非常嚴(yán)重，其感染率明顯高于豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒。其危害之大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV S蛋白由1 383個(gè)氨基酸組成，S蛋白具有識別靶細(xì)胞，促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜的融合的作用［8］。S蛋白被人為劃分為受體結(jié)合區(qū)（S1）和膜融合區(qū)（S2），即使S蛋白不被切割成S1和S2兩個(gè)亞基，但是在相應(yīng)的位置上存在這兩個(gè)基因序列，所以這為其劃分為S1區(qū)和S2區(qū)提供了依據(jù)。

研究以食品級的干酪乳桿菌Lactobacillus casei作為遞送疫苗抗原的活載體，利用質(zhì)粒pLA即PHCE1LB-pgsA，它是一種大腸桿菌和干酪乳桿菌穿梭表達(dá)載體［9］，構(gòu)建了細(xì)胞表面表達(dá)PEDV S1融合蛋白的重組干酪乳桿菌系統(tǒng)，以期利用該重組菌作為口服疫苗，達(dá)到預(yù)防PEDV感染的目的。對構(gòu)建的重組干酪乳桿菌表達(dá)的融合蛋白經(jīng)Western blot免疫學(xué)檢測分析，外源重組蛋白能夠被相應(yīng)的血清所識別，表明所構(gòu)建的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠有效的表達(dá)外源目的蛋白，重組蛋白與天然抗原一樣具有相同的免疫原性［10-13］。

圖5　重組菌的anti-pgsA（A）、anti-PEDV（B）Western blot檢測結(jié)果Fig.5Western blot analysis of recombinant protein by using anti-pgsA（A）and anti-PEDV（B）antibody

4　結(jié)論

利用RT-PCR技術(shù)從PEDV獲得了1 086 bp的S1片段，連接到大腸桿菌和乳酸菌之間穿梭的表面表達(dá)載體pLA上，并電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌中，成功構(gòu)建了重組干酪乳桿菌，并且在干酪乳桿菌上成功表達(dá)了目標(biāo)蛋白，為后續(xù)的免疫原性研究奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression of PEDV-S on Lactobacillus casei

Yue Lu1，Li Kunpeng1，Hou Xilin2，Yu Liyun1，2
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

Porcine epidemic diarrhea（PEDV）can cause vomit，diarrhea and dehydration.The gene fragments encoding PEDV S1 protein was cloned into Lactobacillus casei surface expression vector pLA to express the protein，which laid the foundation for further study of characteristics and immunogenicity.By TRIzol method of extracting RNA from PEDV template，it got the virus by RT-PCR technique of S1 fragments，and then connected the gene to carry and express in the pLA.After expressing recombinant bacteria culture，the results showed that the molecular weight of about 81 kDa was detected.According to the result of Western-blot，the expressed protein possessed the antigenic specificity，which could be recognized by Rabbit anti-PgsA and Mouse anti-PEDV serum. The recombinant strains were successfully induced to express protein.

PEDV；lactobacillus casei；RT-PCR；western blot

S482

A

1002-2090（2016）02-0076-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.015

2014-12-26

農(nóng)墾總局攻關(guān)項(xiàng)目（HNK11A-08-03-03）。

岳璐（1988-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2012級碩士研究生。

余麗蕓，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：xly_hou@yahoo，com.cn。