丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血后神經(jīng)元凋亡、NGF、BDNF表達(dá)的影響

朱　江，張玉坤，張　杰，郭　森，丁　萌

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丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血后神經(jīng)元凋亡、NGF、BDNF表達(dá)的影響

朱江1，張玉坤2，張杰2，郭森3，丁萌4

目的探索丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血后腦神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)表達(dá)的影響。方法將Wistar大鼠分為假手術(shù)組、丁苯酞氯化鈉注射液治療組(以下簡稱治療組)、缺血對照組。采用電凝雙側(cè)椎動脈和結(jié)扎右側(cè)頸總動脈的方法制造大鼠延髓缺血模型。分別給予治療組和缺血對照組丁苯酞氯化鈉注射液及等計量生理鹽水腹腔注射。大鼠于相應(yīng)時段灌注取材，每組標(biāo)本分別采用尼氏染色、Tunel染色，免疫組織化學(xué)方法顯示腦組織中的神經(jīng)元、凋亡神經(jīng)元數(shù)量、BDNF和NGF。光鏡下觀察腦組織中神經(jīng)元數(shù)量、神經(jīng)元凋亡的數(shù)量。同時觀察NGF和BDNF的變化，利用灰度值進(jìn)行分析。結(jié)果神經(jīng)元凋亡數(shù)量及NGF、BDNF灰度值治療組均低于缺血對照組。結(jié)論NGF、BDNF水平與神經(jīng)元數(shù)量密切相關(guān),丁苯酞可上調(diào)大鼠缺血腦組織中NGF、BDNF的表達(dá)，減輕腦組織損傷。

丁苯酞注射液；延髓缺血；神經(jīng)元；凋亡；神經(jīng)生長因子；腦源性神經(jīng)生長因子；大鼠

缺血性腦血管病病理機(jī)制復(fù)雜，是由多個病理環(huán)節(jié)導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能損傷[1]。腦組織血液供應(yīng)障礙勢必會對神經(jīng)元及神經(jīng)營養(yǎng)因子造成相應(yīng)影響。

近年來對缺血性腦血管病損傷機(jī)制的認(rèn)識已進(jìn)入分子水平[2]，其中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)可以明顯促進(jìn)缺血后神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化成熟，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中具有重要的作用[3]。

丁苯酞氯化鈉注射液(butylphthalide)具有清除自由基和神經(jīng)保護(hù)作用[4]，改善腦缺血后的能量代謝，減輕神經(jīng)功能損傷的程度[5]。

本研究從丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血腦組織中NGF和BDNF表達(dá)的改變及其最終對神經(jīng)元分布的影響的角度，對丁苯酞氯化鈉注射液在延髓缺血過程中起到的保護(hù)作用進(jìn)行深入的探討。

1　材料和方法

1.1動物與分組SPF級Wistar成年健康雄性大鼠，220～260 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。60只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、丁苯酞治療組、缺血對照組。其中假手術(shù)組每組6只大鼠，其余按時間點分為7 d、14 d兩個亞組，每組12只大鼠。

1.2方法

1.2.1延髓缺血模型制備結(jié)扎右側(cè)頸總動脈：10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側(cè)頸總動脈并結(jié)扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈：大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內(nèi)凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.2.2實驗動物的干預(yù)方法假手術(shù)組只暴露雙側(cè)椎動脈及右側(cè)頸總動脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對照組均在阻斷雙側(cè)椎動脈及右側(cè)頸總動脈后立即開始治療。治療組每天腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液兩次，時間間隔12 h，每次注射計量按3 mg/kg計算，到術(shù)后7 d和14 d兩個時間點分別處死，取延髓。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術(shù)后7 d和14 d兩個時間點分別處死，取延髓。

1.2.3實驗標(biāo)本制作應(yīng)用10%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預(yù)先處理為鈍圓的針頭插入左心室內(nèi)，快速輸入溫生理鹽水(37 ℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結(jié)束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4電鏡標(biāo)本制作將取得的標(biāo)本切成1×1×1 mm3的小塊，25%戊二醛固定4 h，0.1 mol/L的PBS沖洗3次，每次5 min，1%鋨酸固定1.5 h，0.1 mol/L的PBS漂洗12 h，丙酮梯度脫水，Epon812浸透包埋，超薄切片，鈾鉛染色。

1.2.5Tunel法操作步驟(1)組織切片至于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min，用無水乙醇洗2×3 min，95%乙醇、90%乙醇各洗一次，每次3 min，蒸餾水洗兩次；(2)將組織切片置于蛋白酶K(20 μg/ml，pH 7.4)溶液中，室溫孵育15 min；(3)0.01mol/L PBS (pH 7.4)沖洗3次；(4)擦干樣品周圍的水，滴加50 μl的Tunel反應(yīng)混合液溶液，在溫盒中37 ℃孵育60 min；(5)0.01 mol/L PBS (pH 7.4)沖洗3次；(6)擦干樣品周圍的水份，加入50 μl的轉(zhuǎn)化劑-POD，在溫盒中37 ℃孵育30 min；(7)0.01 mol/L PBS (pH 7.4)沖洗3次；(8)加入50 μl的DAB底物溶液，室溫孵育10 min；(9)0.01 mol/L PBS (pH 7.4)沖洗3次；(10)依次分別用70%、95%、100%乙醇脫水，干燥；(11)二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.6尼氏染色主要步驟(1)組織貼片自然晾干；(2)無水乙醇+氯仿(1∶1)4 h；(3)100%乙醇(Ⅰ)3 min；(4)100%乙醇(Ⅱ)3 min；(5)95%乙醇3 min；(6)70%乙醇3 min；(7)50%乙醇3 min；(8)雙蒸水1 min；(9)1%甲苯胺藍(lán)染液，60 ℃恒溫箱內(nèi)染色50 min；(10)雙蒸水浸泡數(shù)遍；(11)50%乙醇1 min；(12)70%乙醇(含1%冰醋酸)數(shù)秒鐘，注意觀察切片分色情況；(13)95%乙醇(Ⅰ)1 min；(14)95%乙醇(Ⅱ)1 min；(15)100%乙醇(Ⅰ)1 min；(16)100%乙醇(Ⅱ)1 min；(17)二甲苯(Ⅰ)5 min；(18)二甲苯(Ⅱ)5 min；(19)中性樹膠封片。

1.2.7觀察指標(biāo)(1)每只大鼠取3張切片(片厚20 μm)，每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個視野，輸入醫(yī)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(MiVnt)進(jìn)行圖像處理。計數(shù)神經(jīng)元及凋亡神經(jīng)元，取其平均值為這只大鼠的神經(jīng)元及凋亡神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)。其中，凋亡神經(jīng)元在光鏡下呈現(xiàn)棕黃色[6]。(2)神經(jīng)營養(yǎng)因子：NGF、BDNF蛋白表達(dá)的測定用SP免疫組織化學(xué)染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設(shè)陰性對照。陰性對照用PBS替代一抗孵育切片。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞的胞漿、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析：用Simple PCI-8圖像分析軟件對圖像進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。每張切片在光鏡下選5個視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級越高，說明反應(yīng)強(qiáng)度越低。

2　結(jié)　果

2.1各組腦組織中神經(jīng)元數(shù)量的變化通過對7 d、14 d后實驗動物的觀察，治療組及缺血對照組中神經(jīng)元的數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少。治療組神經(jīng)元減少幅度在各時段均低于缺血對照組。同時，治療組神經(jīng)元凋亡數(shù)量幅度較缺血對照組的幅度低。與假手術(shù)組相比較有統(tǒng)計學(xué)差異(見表1、表2)。

2.2各組腦組織中NGF、BDNF灰度值的變化通過對7 d、14 d后實驗動物的觀察，治療組及缺血對照組中灰度值較假手術(shù)組顯著增加。但是，治療組NGF、BDNF灰度值增加的程度低于缺血對照組NGF、BDNF灰度值增加的程度。其中，治療組各時段NGF、BDNF灰度值均低于缺血對照組。與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(見表3、表4)。

2.3各組腦組織中組織學(xué)觀察在假手術(shù)組中，神經(jīng)元胞體中央有大而圓的細(xì)胞核，胞體的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、高爾基復(fù)合體等。神經(jīng)元尼氏體豐富。線粒體膜完整，線粒體嵴清晰。缺血對照組實驗7 d時，可觀察到神經(jīng)元數(shù)量減少，核固縮、碎裂、溶解，膜結(jié)構(gòu)模糊。核仁偏位，核膜內(nèi)陷。線粒體體積較前增大，線粒體嵴變短。實驗14 d時可觀察到，神經(jīng)元數(shù)量較前進(jìn)一步減少，神經(jīng)元溶解消失。

表1　各組大鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)量比較±s)

與假手術(shù)組比較#P<0.05,##P<0.01

表2　各組大鼠腦組織中神經(jīng)元凋亡數(shù)量比較±s)

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01

表3　各組大鼠腦組織中NGF蛋白陽性表達(dá)灰度值比較±s)

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01

表4　各組大鼠腦組織中BDNF蛋白陽性表達(dá)灰度值比較±s)

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01

3　討　論

BDNF、NGF是NT家族的成員，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及促進(jìn)再生等方面具有重要作用[7],可調(diào)控氨基酸和小分子的攝入，增強(qiáng)功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的合成，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生功能[8]。有研究表明，BDNF、NGF對缺血損傷的神經(jīng)元有保護(hù)作用，能阻斷腦缺血時神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[9]。腦缺血后，BDNF、NGF均增加[10]，通過拮抗興奮性氨基酸毒性，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，增強(qiáng)蛋白激酶活性，保護(hù)神經(jīng)元作用[11]。

在延髓缺血后，出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量減少，凋亡神經(jīng)元數(shù)量增加。在缺血條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生填充于壞死區(qū)域，引起局部微循環(huán)障礙，即微血管凋亡的數(shù)量大于其新生的數(shù)量[12,13]，更促進(jìn)了神經(jīng)元的凋亡。腦缺血后，腦神經(jīng)元損傷的程度與BDNF和NGF的表達(dá)水平密切相關(guān)[14]。

丁苯酞是一種新型抗腦缺血藥物，可通過解除微血管痙攣、抑制血小板聚集、抑制TXA2的合成等多個環(huán)節(jié)阻斷腦缺血引起的病理過程。丁苯酞能清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高BDNF、NGF水平，進(jìn)一步促進(jìn)對神經(jīng)元的保護(hù)作用，有效抑制其凋亡的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，在延髓缺血狀態(tài)下，與假手術(shù)組相比較，治療組神經(jīng)元數(shù)量降低程度明顯低于缺血對照組；治療組NGF、BDNF的灰度值增加的程度明顯低于缺血對照組；與缺血對照組相比較，丁苯酞氯化鈉注射液治療7 d、14 d時，神經(jīng)元凋亡降低趨勢與BDNF、NGF灰度值降低趨勢呈正相關(guān)。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在腦組織慢性缺血的前提下，治療組中NGF、BDNF表達(dá)水平升高，提示丁苯酞氯化鈉注射液可以減少自由基產(chǎn)生等一系列機(jī)制保護(hù)神經(jīng)元，更重要的是，可促進(jìn)NGF、BDNF的表達(dá)，通過激發(fā)神經(jīng)生長因子途徑對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。

[1]董為偉.神經(jīng)保護(hù)的基礎(chǔ)[M].北京:科學(xué)出版社,2002.239-245.

[2]Hsu CY,An G,Liu JS,et al.Expression of immediate early gene and growth factor mRNAs in a focal cerebral ischemia model in the rat[J].Stroke,2001,24(12):178-181.

[3]孫春艷,胡豫,王雅丹,等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中的表達(dá)增高及其意義的初步探討[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2005,13(1):104-109.

[4]Kalaria RN.The role of cerebral ischemia in Alzheimer’s disease[J].Neurobiol Aging,2000,21(2):321-330.

[5]Takeda A,Onddera H,Sugimoto A,et al.Coordinated expression of messenger RNAs for nerve growth factor,brain-derived neurotrophic factor and nerotrophin-3 in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia [J].Neuroscience,1993,55(1):23-31.

[6]Blondeau N,Lauritzen I,Widmannc,et al.A potent protective role of lysophospho lipids against global cerebral ischemia and glutamate excite toxicity in neuronal cultures[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(10):1205-1211.

[7]Aloe L,Levi-Montalcini R.The discovery of nerve growth factor past and present studies[J].Neurol Res,2010,3(7):139-143.

[8]Diensthuber M,Lenarz T.Neurotrophic factor expression in vestibular schwannoma[J].Laiyngorhinootologie,2006,85(10):731-739.

[9]Kirland RA,Saavedra GM.Rapid activation of antioxidant degenses by nerve growth factor suppresses reactive oxygen species during neuronal apoptois[J].J Neurosci,2007,27(42):1115-1126.

[10]Gura T.Inna immunity Ancient system gets new respect[J].Science,2001,291(5511):2068-2071.

[11]Lemaitre B,Reichhart JM.Drosophilia host defense differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganism[J].Proc Natl A Cad Sci USA,1997,94(26):14614-14619.

[12]Barde YA,Edgar D,Thoenen M.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain[J].EMBO J,1982,1(5):549-530.

[13]Ferrer I,Krupinski J,Goutan E,et al.Induction of brain-derived neurotrophic factor and the receptor trkB mRNA following middle cerebral artery occlusion in rat[J].Neurosci Lett,1996,211(1):57-60.

[14]Wolters FJ,Rinkel GJ,Vergouwen MD.Clinical course and treament of vertebrobasilar dolichoectasia:a systematic review of the literature[J].Neurol Res,2013,35(2):131-137.

The effect of butylphthalide on neuron apoptosis,expression of NGF and BDNF in ischemia stroke tissue of rat cerebrum

ZHUJiang,ZHANGYukun，ZHANGJie,etal.

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

ObjectiveTo study the effect of butylphthalide on neurons apoptosis,expression of NGF and BDNF in medullary ischemia of rat cerebrum.MethodsThe Wistar rats were divided randomly into three groups,sham-operated group,butylphthalide-creating and medullary ischemia group.The model of medullary ischemia in rats were ligated the right common carotid artery and blocked the bilateral vertebral by electrocoagulation.The rats in the butylphthalide treatment group and ischemia control group respectively received butylphthalide and normal saline by intraperitoneal injections.Nissl staining and Tunel method were used to show the neurons and apoptotic cells respectively.The immunohistochemistry was used to evaluate effects of Butylphthalide on NGF and BDNF expression.We observed brain neuron apoptosis density through the optical microscope to observe brain neuron apoptosis density,grayscale values of NGF and BDNF plays,using the grey value were analyzed.ResultsTreatment group of neurons apoptosis,model NGF and BDNF grayscale values were lower than control group ischemia.ConclusionModel NGF,BDNF level are closely associated with neurons density.Comparing to control group,butylphthalide can significantly up-regulate the expressions of NGF and BDNF in genetic transcription level,and protect from the medullary ischemia injury.

Butylphthalide;Medullary ischemia;Neurons;Apoptosis;Nerve growth factor(NGF);Brain-derived neurotrophic factor(BDNF);Rats

1003-2754(2016)02-0165-03

治療

2015-10-23；

2016-01-28

2013年度河北省教育廳河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目(No.QN20131075)

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000；2.承德縣醫(yī)院，河北 承德 067400；3.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000；4.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，河北 承德 067000)

丁萌，E-mail：2270065 ding @126.com

R743.3

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