GABAARG2基因C588T多態(tài)性與癲癇的相關性研究

梁　維，許志恩，方洪明

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GABAARG2基因C588T多態(tài)性與癲癇的相關性研究

梁維1，許志恩1，方洪明2

目的探討中國粵西地區(qū)漢族人群GABAARG2基因C588T的單核苷酸多態(tài)性與癲癇的關系。方法采用病例-對照研究方法，收集粵西地區(qū)漢族人群189例癲癇患者，100例健康人作為正常對照組，根據(jù)患者對抗癲癇藥物的反應性分為耐藥組(92例)和藥物敏感組(97例)，提取所有研究對象外周血基因組DNA，采用PCR擴增后基因測序鑒定GABAARG2基因C588T多態(tài)性，測定該位點基因型頻率和等位基因頻率，并進行統(tǒng)計學分析。結果耐藥組與藥物敏感組、正常對照組的CC、CT、TT基因型頻率及C、T等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義；藥物敏感組與正常對照組的CC、CT、TT基因型頻率比較(χ2=6.468，P=0.039)差異有統(tǒng)計學意義，CC與CT優(yōu)勢比為1.669(95%CI=0.842～3.306，P= 0.141)，CC與TT的優(yōu)勢比為2.652(95%CI=1.240～5.668，P=0.011);C、T等位基因頻率比較(χ2=7.411，P=0.006)差異有統(tǒng)計學意義，C等位基因與T等位基因優(yōu)勢比為1.737(95%CI=1.166～2.588，P=0.006)。結論GABAARG2基因5號外顯子的C588T多態(tài)性與癲癇的易感性相關，但與癲癇的耐藥風險不相關。

GABAARG2基因；C588T；單核苷酸基因多態(tài)性；癲癇

癲癇是由不同原因引起的大腦神經(jīng)元異常放電中樞神經(jīng)功能失調綜合征。約1/3的癲癇患者在使用抗癲癇藥物(AEDs)治療后仍反復發(fā)作、難以控制，成為耐藥性癲癇[1]。耐藥機制近年來成為癲癇研究的重點和熱點。GABAARG2是γ2的編碼基因，定位于5q31.1～33.1區(qū)域，共85.7 kb，由9個外顯子及其間的8個內含子組成。研究證實GABAARG2基因的變異或者表達量的減少參與了熱性驚厥(FS)、全面性癲癇伴熱性驚厥疊加綜合征(GEFS+)等疾病的形成，GABAARG2基因C588T很可能是FS的易感因素[2～4]。孟海嬌等[5]發(fā)現(xiàn)C588T為國內GEFS+的患者的易感基因，C等位基因在GEFS+組中顯著高于其他類型癲癇。Goodkin發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)下海馬錐體細胞的GABAARβ2、β3、γ2表達減少，導致GABAAR對苯二氮卓類藥物敏感性下降，甚至失效，說明GABAARG2的基因變異與耐藥性癲癇可能存在聯(lián)系[6]。癲癇受到遺傳、種族和地域環(huán)境影響，國內目前關于GABAARG2基因多態(tài)性與癲癇關系的研究報道甚少，故在中國粵西地區(qū)漢族人群首次對GABAARG2基因第5外顯子上的C588T多態(tài)性與癲癇的相關性進行研究，為研發(fā)新型的抗癲癇藥提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象收集在我院就診的診斷明確且用藥合理的癲癇患者189例，患者均行24 h動態(tài)腦電圖，頭部CT或MRI。臨床有兩次時間相隔24 h以上的癇性發(fā)作。入選標準：(1)粵西漢族人;(2)臨床上有兩次時間相隔24 h以上癇性發(fā)作;(3)根據(jù)發(fā)作類型，正確合理用藥的癲癇患者。排除標準：(1)臨床診斷錯誤，分型不確切；(2)用藥不當或用藥不足的癲癇患者；(3)依從性差的癲癇患者；(4)因腦卒中、顱腦外傷、顱內占位性病變等有明確病因的癥狀性癲癇；(5)肝腎功能不全者。正常對照組為無癲癇病史的健康體檢者100例。根據(jù)2010年國際抗癲癇聯(lián)盟給出的耐藥性癲癇的定義[7]，我們將癲癇患者分為耐藥組和藥物敏感組，耐藥組92例，藥物敏感性組97例。所有研究對象均經(jīng)知情同意，本研究獲廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2研究方法

1.2.1提取DNA早晨空腹取肘部靜脈血5 ml，至含有EDTA-K2的抗凝試管，用血液基因組DNA快速提取試劑盒提取外周血白細胞的基因組DNA，在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增GABAARG2外顯子5 C588T位點引物設計:上游引物5’-TGTGTTTTCAATCAGAATGTGAG-3’；下游引物5’-GGCAATCAGAAAGACTGTAGG-3’，引物由上海生工生物技術有限公司合成。取50 μl PCR反應管，PCR反應條件：94 ℃預變性2 min(94 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s) 34個循環(huán)后再于72 ℃延伸8 min，終止反應。所有經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后的PCR產物均送上海生工生物技術有限公司進行基因測序。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 19．0軟件完成統(tǒng)計處理，首先應用χ2檢驗分析耐藥組和藥物敏感組、正常對照組的基因型頻率和等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，如P>0.05，則樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，有群體代表性。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組研究對象一般資料及臨床資料比較耐藥組92例，其中男性45例，女性47例，年齡10～52歲；藥物敏感組97例，其中男性47例，女性50例，年齡8～55歲；正常對照組100例，其中男性52例，女性48例，年齡16～45歲；研究對象的年齡、性別構成在各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。而耐藥組與藥物敏感組患者的起病年齡、總病程、治療前發(fā)作次數(shù)、既往FS史、癲癇持續(xù)狀態(tài)、24 h腦電圖中度以上異常差異有統(tǒng)計學意義(見表2)。

2.2PCR產物電泳結果GABAARG2基因5號外顯子的C588T位點PCR擴增產物為單一條帶，產物大小符合預先設計，片段長度為268 bp，其基因測序圖如下(見圖1)。

2.3GABAARG2外顯子5 C588T基因型及等位基因頻率的分布經(jīng)χ2檢驗，在耐藥組、藥物敏感組和正常對照組中，GABAARG2外顯子5的C588T多態(tài)位點基因型、等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。耐藥組與藥物敏感組CC、CT、TT基因型比較(χ2=1.292,P=0.524)及等位基因C、T頻率比較(χ2=1.429,P=0.232)差異無統(tǒng)計學意義。耐藥組與正常對照組的基因型比較(χ2=2.027,P=0.363)及等位基因頻率比較(χ2=2.214,P=0.137)差異亦無統(tǒng)計學意義。而藥物敏感組和正常對照組的CC、CT、TT基因型比較(χ2=6.468,P=0.039),等位基因C、T頻率比較(χ2=7.411,P=0.006)差異均有統(tǒng)計學意義，在藥物敏感組中與CT相比，CC引起的癲癇風險度為1.669。與TT相比，CC引起癲癇的風險度為2.652，與T等位基因相對比，C等位基因的癲癇患病風險度為1.737(見表3)。

表1　耐藥組、藥物敏感組與正常對照組一般資料對比

表2　耐藥組與藥物敏感組患者臨床資料的比較

表3　藥物敏感組與正常對照組C588T的基因型及等位基因頻率

圖1A.CC純合子基因型;B.CT雜合子基因型;C.TT純合子基因型

3　討　論

目前癲癇耐藥機制的藥物作用靶點假說，認為抗癲癇藥物作用靶點分子結構改變是導致患者對抗癲癇藥物的敏感性降低的原因[8]，GABAAR是抗癲癇藥物一個重要的作用靶點，是5個亞基組成的多肽大分子配體門控離子通道受體，由苯二氮卓類藥物識別點、GABA識別點和氯離子門控通道組成，其亞基包括：α1～6、β1～4、γ1～3、δ、ε、θ、π、ρ1～3[9]。戚月鳳[10]在顳葉癲癇模型中發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后GABAARγ2表達減少，并可能導致癲癇進一步發(fā)展，隨著時間推移，GABAARγ2表達逐漸增多，加強抑制作用，利于防止癲癇反復發(fā)作，推測此可能是顳葉癲癇的內源性保護機制。研究顯示，GABAAR亞基的表達在抗癲癇藥物敏感的大鼠與耐藥組的大鼠中比較有明顯的差異，這提示GABAAR亞基的變化可能與耐藥性癲癇有關[11]。

研究表明熱性驚厥(FS)可能更容易導致耐藥性癲癇[12，13]，F(xiàn)S和癲癇存在著一定的共同遺傳基礎[14]。Kananura等[15]首先探索了GABAARG2 基因5號外顯子上的C588T(NCBI對應編號：rs211037)與熱性驚厥(FS)的相關性，但并未發(fā)現(xiàn)C588T為德國人群FS的易感因素，Chou等[2]對臺灣人群中104名FS患者及83名正常人研究，發(fā)現(xiàn)CC基因型的個體數(shù)明顯多于對照組，C等位基因高于正常人，等位基因C與等位基因T的優(yōu)勢比為2.56，表明C588T是臺灣人群FS的易感因素。而Nakayama[16]在日本的94例FS患者中未發(fā)現(xiàn)C588T與FS存在關聯(lián)。Salam等[3]發(fā)現(xiàn)C588T是埃及人群中FS的易感因素，他們選取了100名FS患者與120名健康人作為研究對象，結果和Chou[2]的研究結論一致，與T等位基因對比，C等位基因患FS的風險為2.15，以上的不同結果說明了C588T多態(tài)性具有明顯的地域性，和種族遺傳有關。

盡管C588T在不同種族中有著不同的等位基因頻率，但在2010年，Kumari[17]在北印度人群中檢測了C588T與癲癇耐藥的相關性，但未發(fā)現(xiàn)C588T是北印度人群的耐藥性的高危因素。2013年Balan[18]在實驗中發(fā)現(xiàn)C588T與南印度人群癲癇的易感性相關，而未檢測出C588T與耐藥性癲癇有關聯(lián)。這更說明單SNP的功能相對有限，在藥物敏感性癲癇中可能發(fā)揮一定作用。但耐藥性癲癇中，單SNP的影響則相對顯得微弱，可能是多個SNP的微效果聯(lián)合疊加，甚至要在特定的環(huán)境、特定的誘因的情況下才表現(xiàn)出對藥物的耐受甚至抵抗。

本研究對中國粵西漢族人群GABAARG2基因5號外顯子的C588T多態(tài)性進行分析，發(fā)現(xiàn)耐藥組與藥物敏感組、正常對照組C588T基因型、等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義，但在藥物敏感組與正常對照組C588T的基因型分布、等位基因頻率明顯有差異，在藥物敏感組中CC、CT、TT基因型分別占36.1%、42.3%、21.6%；正常對照組中分別占22.0%、43.0%、35.0%，在藥物敏感組中與CT雜合子相比，CC純合子引起的癲癇風險度為1.669，與TT純合子相比，CC純合子引起癲癇的風險度為2.652，藥物敏感組等位基因C、T頻率分別為57.2%、42.8%，正常對照組患者分別為43.5%、56.5%，在藥物敏感組中與T等位基因相對比，C等位基因的癲癇患病風險度為1.737，CC基因型、C等位基因頻率在藥物敏感組中顯著高于正常對照組，提示GABAARG2基因5號外顯子的C588T多態(tài)性與癲癇的易感性相關，但與癲癇的耐藥風險不相關，研究結果與Kumari[17]、Balan[18]的實驗結果是相一致的。

GABAARG2基因第5外顯子上的C588T是一個同義突變，雖然不改變γ2的性狀，但可以影響蛋白的表達和功能，主要通過以下的機制：(1)同義突變改變了mRNA的堿基組成，導致mRNA的二級結構發(fā)生變化，從而影響mRNA結構的穩(wěn)定性，如G/C含量增加時，mRNA的結構穩(wěn)定性增強;(2)同義突變有可能產生新的隱藏剪接位點或者影響調控元件，如沉默子、外顯子剪接增強子等，從而導致mRNA剪接的異常;(3)同義突變可以影響翻譯速率。孟海嬌[5]曾用MFOLD預測了C588T的mRNA的二級結構，結果顯示C588T在不同的等位基因中,野生型與變突變型的mRNA的二級結構有很大的差異。Balan[18]的實驗中也表明C588T在轉錄調控與剪接調控中起著重要的作用。綜上所述，C588T的變異很可能在一定程度上影響了γ2亞基的功能或者使γ2亞基表達水平降低，鑒于γ2亞基對其他亞基具有組裝作用，導致GABAAR的整體功能受到抑制，導致中樞系統(tǒng)興奮-抑制的失衡，從而更容易出現(xiàn)癲癇發(fā)作。

目前多數(shù)研究認為耐藥性癲癇可能是多種因素疊加造成的，耐藥性癲癇患者有著起病年齡早，病程較長，發(fā)作頻率高，癥狀性癲癇或者隱源性癲癇、腦電圖異常程度高，F(xiàn)S病史、癲癇持續(xù)狀態(tài)病史、精神病和癲癇家族史等特征[12,13,19]，從實驗中耐藥組與藥物敏感組的臨床資料對比，可以看出，粵西地區(qū)的耐藥性癲癇患者中6歲以前發(fā)病率、病程、發(fā)作頻率、既往FS史比例、癲癇持續(xù)狀態(tài)史比例明顯較藥物敏感組高，同時中度以上異常腦電圖的概率增高，差異有統(tǒng)計學意義。有研究證明高熱、持續(xù)狀態(tài)以及反復發(fā)作容易導致耐藥性癲癇[6,19～21]。此外，社會的歧視和焦慮抑郁、不規(guī)律服藥的癲癇患者更容易出現(xiàn)耐藥性[22,23]。

耐藥性癲癇與藥物敏感癲癇的判定標準、入選標準、樣本量大小對實驗結果有一定的影響，本實驗排除了目前影像學上具備明顯病灶的癥狀性癲癇，更注重與遺傳相關的非癥狀性癲癇。但由于目前影像學技術及患者的經(jīng)濟承受能力，尚不能排除潛在誘因的隱源性癲癇，這對實驗結果也造成了一定的影響。

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Association study between the C588T polymorphism of GABAARG2 gene and epilepsy

LIANGWei,XUZhien,FANGHongming.

(AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

ObjectiveTo investigate the association between the C588T polymorphism of GABAARG2 gene and drug-resistant epilepsy in Chinese Han population of the Western Guangdong province.Methods189 patients with epilepsy were classified into drug-resistant group (n=92) and drug-responsive group (n=97),according to their responses of antiepileptic drug treatment,and 100 healthy controls were chosen as normal control group.DNA samples were obtained from all these people,the C588T polymorphism of GABAARG2 gene was determined by polymerase chain reaction(PCR) and Gene sequencing.The genotype and allele frequency of the C588T among the three groups was analyzed by Chi-square test.ResultsNo significant differences of genotype frequencies and allele frequencies were identified between the drug-resistant group and drug sensitive group,while no significant differences of genotype frequencies and allele frequencies were identified between the drug-resistant group and normal control group.Significant differences of genotype frequencies were identified between the drug sensitive group and normal control group (χ2=6.468,P=0.039).CC vs CT OR=1.669 (95%CI=0.842～3.306,P=0.141),CC vs TT OR=2.652 (95%CI=1.240～5.668,P=0.011),Significant differences of allele frequencies were identified between the drug sensitive group and normal control group (χ2=7.411,P=0.006),C vs T OR=1.737 (95%CI=1.166～2.588,P=0.006).ConclusionThe C588T polymorphism of GABAARG2 gene is associated with epilepsy susceptibility,but not with antiepileptic drug resistance in Chinese Han population.

GABAARG2 gene；C588T;Single Nucleotide polymorphism；Epilepsy

1003-2754(2016)02-0139-04

2015-12-08；

2016-01-30

(1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001；2.廣東省普寧市人民醫(yī)院，廣東 普寧 515300)

許志恩，E-mail:zjxuzhien@126.com

R742.1

A