乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)小鼠小腦顆粒細(xì)胞反應(yīng)的影響機(jī)制

金　娟，　咸峰元，　吳　光，　崔松彪

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乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)小鼠小腦顆粒細(xì)胞反應(yīng)的影響機(jī)制

金娟，咸峰元，吳光，崔松彪

目的探討乙醇對(duì)小腦顆粒細(xì)胞感覺信息傳遞的影響，揭示急性酒中毒對(duì)小腦皮質(zhì)感覺信息傳遞與整合影響的部分機(jī)制。方法ICR小鼠(6～8周齡)經(jīng)腹腔注射烏拉坦(1.3 g/kg 體重. )麻醉后，在小腦CrusII相應(yīng)部位行直徑為1～1.5 mm的開顱術(shù)，除去硬腦膜，腦表面暴露部位持續(xù)灌流人工腦脊液(ACSF)；三叉神經(jīng)感覺刺激選用吹風(fēng)刺激同側(cè)觸須墊，電生理記錄選用GC場(chǎng)電位記錄，通過膜片鉗放大器及數(shù)據(jù)采集軟件記錄感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位變化；電生理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Clampfit 10.1軟件，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果(1)吹風(fēng)刺激(60 ms，50～60 psi)小鼠觸須墊，可誘發(fā)小腦CrusII區(qū)顆粒細(xì)胞高保真反應(yīng)。(2)小腦表面灌流乙醇對(duì)誘發(fā)反應(yīng)的潛伏期沒有明顯影響，但可逆性地抑制顆粒細(xì)胞的感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)。(3)乙醇對(duì)小腦顆粒細(xì)胞的感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)的抑制作用有濃度依存性，最小抑制濃度為0.5 mmol/L，最大抑制濃度300 mmol/L。(4)高濃度乙醇(500 mmol/L)明顯降低P1振幅中值(half-width)、振幅下面積(area)、P1上升參數(shù)(rise tau)和衰減參數(shù)(decay tau)，表明高濃度乙醇嚴(yán)重影響遞質(zhì)傳遞與信息傳導(dǎo)。(5)阻斷GABAA受體活性增強(qiáng)P1振幅，同時(shí)完全阻斷乙醇對(duì)GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)的抑制作用，表明乙醇通過增強(qiáng)GABAA受體活性來抑制GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)。結(jié)論乙醇通過增強(qiáng)GABAA受體活性對(duì)小腦顆粒細(xì)胞感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明乙醇抑制小腦顆粒細(xì)胞對(duì)感覺信息的傳遞，提示急性酒中毒對(duì)小腦運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能的損害可能與乙醇抑制小腦皮質(zhì)感覺信息傳遞有關(guān)。

乙醇；小鼠小腦顆粒細(xì)胞；感覺刺激；電生理記錄；GABAA受體

中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)乙醇敏感，易損傷主要靶器官，長期過量攝入乙醇會(huì)損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成神經(jīng)元變性、數(shù)量減少，甚至腦萎縮。小腦是重要的運(yùn)動(dòng)中樞，小腦皮質(zhì)將外部信息進(jìn)行精密運(yùn)算與綜合后，由浦肯野細(xì)胞發(fā)出各種輸出指令，來完成各種生理活動(dòng)。小腦皮質(zhì)唯一的輸出神經(jīng)元浦肯野細(xì)胞(PC)對(duì)乙醇高度敏感；慢性酒精中毒可導(dǎo)致PC變性、樹突減少和小腦變性[1]。體外實(shí)驗(yàn)表明，乙醇主要通過調(diào)節(jié)受體和遞質(zhì)傳遞來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，對(duì)GABAA受體起激動(dòng)作用，乙醇還可以增加PC突觸前GABA遞質(zhì)的合成與釋放，導(dǎo)致PC興奮性降低。我們研究發(fā)現(xiàn)在小腦皮質(zhì)感覺信息傳遞過程中，GABAA受體介導(dǎo)的抑制作用對(duì)PC起決定性作用，感覺刺激誘發(fā) PC產(chǎn)生抑制性突觸后電位(IPSP)，并伴有放電暫停。但在整體動(dòng)物上，乙醇對(duì)哺乳動(dòng)物小腦皮質(zhì)神經(jīng)元活動(dòng)、突觸傳遞和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的影響尚不清楚，乙醇對(duì)小腦皮質(zhì)感覺信息傳遞機(jī)制的影響還不明確。本研究應(yīng)用在體膜片鉗場(chǎng)電位記錄和藥理學(xué)手段，在活體動(dòng)物上觀察局部灌流給予不同劑量的乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)小鼠小腦顆粒細(xì)胞層場(chǎng)電位活動(dòng)的影響，通過GABAA受體阻斷劑及GABAA受體激動(dòng)劑的應(yīng)用，探討酒精對(duì)感覺信息突觸傳遞的影響及其機(jī)制，探索急性酒精中毒對(duì)小腦皮質(zhì)神經(jīng)元活動(dòng)、突觸傳遞以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和信息傳導(dǎo)的影響機(jī)制，明確外源性酒精對(duì)感覺刺激誘發(fā)小鼠小腦顆粒細(xì)胞層場(chǎng)電位影響及其機(jī)制，闡明酒精在小腦皮質(zhì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的作用，為今后臨床治療相關(guān)疾病及對(duì)學(xué)習(xí)記憶的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6～8周齡的ICR小鼠，體重為25～30 g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循國際動(dòng)物保護(hù)條例，并受吉林大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的監(jiān)督。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備6～8周齡的ICR小鼠，共30只，腹腔注射20%的烏拉坦麻醉(1.3 g/kg)，待角膜反射消失后，將小鼠置于特制的腦立體定位儀上，用雙側(cè)耳棒及上頜骨固定頭部。切開頭皮并清除顱骨表面肌肉后制備灌流給藥槽(見圖1A)。參照《The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates》圖譜，在小腦Crus II 處用精密牙科鉆行直徑為1～1.5 ms的開顱術(shù)，小心除去硬腦膜，暴露出記錄部位(見圖1B)，安裝好參比電極后，將小鼠和腦立體定位儀固定在顯微鏡(Nikon FN1，Japan)下，找到手術(shù)暴露部位，避開血管，確定記錄部位后進(jìn)行電生理記錄。手術(shù)暴露部位使用蠕動(dòng)泵(MiniPuls 3，Gilson，F(xiàn)rance)持續(xù)灌流人工腦脊液。在整個(gè)手術(shù)和記錄過程中，使用體溫維持儀和加熱墊使動(dòng)物體溫保持在37.0 ±0.2 ℃。

(A) 實(shí)驗(yàn)裝置，包括記錄電極、吹風(fēng)刺激管、記錄電極安裝于電動(dòng)微操作器上；(B) 小鼠小腦分區(qū)及記錄部位由紅色的圓圈表示；(R) Crus II 區(qū)，記錄方式選用局部場(chǎng)電位記錄方式

圖1小鼠小腦分區(qū)及記錄部位

1.2.2顆粒細(xì)胞放電記錄使用自動(dòng)拉制儀(PB-10，Narishige，Japan)將細(xì)玻璃管(外徑：1.5 ms；Narishige，Japan)拉制成記錄電極。電極內(nèi)充裝20～30 μl人工腦脊液，充灌后人工腦脊液電極阻抗為4～6 MΩ。記錄電極安裝于電動(dòng)微操作器上(Sutter，USA)，通過顯微鏡(Nikon Eclipse E600FN，Japan)來檢測(cè)電極移動(dòng)。顆粒細(xì)胞放電記錄采用型號(hào)為Axopatch-1D的膜片鉗放大器(Molecular Device，USA)和Clampex 8.1數(shù)據(jù)采集與分析軟件(Molecular Device，USA)。在顯微鏡下確定記錄部位后，將記錄電極置于記錄區(qū)域腦表面后再將電極慢慢刺入軟腦膜下200～400 μm，到達(dá)小腦皮質(zhì)顆粒細(xì)胞層，調(diào)整放電振幅為0.5 mV以上，待放電頻率和振幅穩(wěn)定100 s后，腦表面給予不同劑量的無水乙醇。在細(xì)胞外記錄條件下，判定顆粒細(xì)胞放電的依據(jù)是放電形式既有單純性放電(simple spike，SS)又有復(fù)雜性放電(complex spike，CS)(見圖2)。

為了更好地觀察乙醇對(duì)自發(fā)性復(fù)雜放電的影響，對(duì)有些神經(jīng)元采用了細(xì)胞密接記錄(cell-attached recording)手段，通過輕輕吸附浦肯野細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜封接阻抗增加至50～150MΩ。細(xì)胞放電活動(dòng)通過Digidata 1200系列數(shù)模轉(zhuǎn)換器、Clampex 8.1軟件和電腦采集，所記錄信號(hào)的濾波頻率為2千赫茲，增益為100倍，數(shù)據(jù)采集后存于移動(dòng)硬盤和DVD光盤用于分析，只有基線穩(wěn)定和記錄完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)　果

2.1感覺刺激誘發(fā)小鼠小腦皮質(zhì)CrusII區(qū)顆粒細(xì)胞(GC)場(chǎng)電位反應(yīng)特征感覺信息可通過苔狀纖維-GC途徑傳入小腦皮質(zhì)，因此GC在感覺信息傳遞過程中起重要作用。為了檢測(cè)GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)，我們將玻璃電極刺入小腦皮質(zhì)CrusII區(qū)GC層(軟腦膜下方200～250 μm；見圖2A)，記錄感覺刺激三叉神經(jīng)誘發(fā)顆粒細(xì)胞群體放電反應(yīng)，即GC場(chǎng)電位記錄。在靜息狀態(tài)下，GC沒有同步性興奮性活動(dòng)，因此，沒有GC場(chǎng)電位變化。然而，吹風(fēng)刺激同側(cè)觸須墊(60 ms，50～60 psi)可誘發(fā)GC產(chǎn)生一對(duì)興奮性場(chǎng)電位反應(yīng)(見圖2B)，第一個(gè)反應(yīng)峰值(P1)的平均值0.80± 0.11 mV，反應(yīng)潛伏期為11.55 ±0.16 ms。第二個(gè)峰值(P2)振幅為0.41±0.13 mV明顯小于P1的振幅(P<0.05；n=20)。而兩個(gè)峰值間相差59.4±0.06 ms(n=20)，與感覺刺激時(shí)間間隔(60 ms)相吻合，表明P1是由吹風(fēng)刺激開始誘發(fā)的，而P2是由吹風(fēng)刺激結(jié)束引起的，表明感覺刺激信息經(jīng)小腦GC傳遞時(shí)保存完整，編碼有刺激開始和結(jié)束信息，提示小腦GC對(duì)感覺信息的傳遞具有高保真性。

(A)檢測(cè)GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)，將玻璃電極刺入小腦皮質(zhì)CrusII區(qū)顆粒細(xì)胞層，記錄感覺刺激三叉神經(jīng)誘發(fā)顆粒細(xì)胞場(chǎng)電位的變化。(B) 感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞的場(chǎng)電位反應(yīng)特征是當(dāng)給予小鼠吹風(fēng)刺激時(shí)，顆粒細(xì)胞層的場(chǎng)電位會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)波P1和P2波，P1波是由于吹風(fēng)刺激開始引起的，而P2波是由于刺激結(jié)束引起的。P1與P2的時(shí)間與刺激的開始和結(jié)束同步

圖2感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞層的反應(yīng)特征

2.2乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)小鼠小腦皮質(zhì)顆粒細(xì)胞場(chǎng)電位反應(yīng)波形及其動(dòng)力學(xué)的影響

2.2.1乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞(GC)場(chǎng)電位反應(yīng)的影響在電流鉗記錄模式下(I=0)，吹風(fēng)刺激同側(cè)觸須墊誘發(fā)GC產(chǎn)生雙峰興奮性場(chǎng)電位反應(yīng)，P1和P2(見圖3A)，腦表面灌流濃度為50 mmol/L的乙醇，對(duì)感覺刺激誘發(fā)GC反應(yīng)的潛伏期沒有明顯影響，灌流5 min后誘發(fā)反應(yīng)的潛伏期為1(1.47 ± 0.30 ms)，較給藥前沒有顯著差異(11.57 ms±0.41 ms；n=5)；但P1的平均值降低了10.1%±1.9% (P<0.05 vs ACSF；n=5；見圖3B)，P2的平均值降低13.7%±4.7% (P<0.05 vs ACSF；n=5；見圖3C)，表明乙醇明顯抑制小鼠小腦GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)。腦表面灌流乙醇所導(dǎo)致的小腦GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)的抑制是可逆的，沖洗15～20 min后可逐漸恢復(fù)到給藥前狀態(tài)。乙醇攝入對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與攝入量關(guān)系密切，增加攝入量可增強(qiáng)乙醇對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)及突觸傳遞的影響，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙，說明乙醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)的影響具有劑量依存性。因此，我們檢測(cè)了不同濃度乙醇對(duì)感覺刺激激誘發(fā)小腦GC場(chǎng)電位的影響。研究結(jié)果見圖4，乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)小腦GC場(chǎng)電位的抑制作用存在一定的濃度依存性。引起感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位抑制的最小乙醇濃度為5 mmol/L，該濃度的乙醇可使P1的平均值降低了2.3%±1.2% (P<0.05 vs ACSF；n=5)。當(dāng)灌流液中乙醇濃度為300 mmol/L時(shí)，P1的平均值降低18.9%±3.3% (P<0.05 vs ACSF；n=5)，灌流液中乙醇濃度為1000 mmol/L時(shí)，P1的平均值降低18.7%±5.0% (P>0.05 vs 300 mmol/L 乙醇組；n=5)，表明當(dāng)灌流液中乙醇濃度達(dá)300 mmol/L時(shí)，乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位的抑制作用達(dá)到最大值，可以使感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)約降低20%。上述結(jié)果表明，乙醇對(duì)小腦GC感覺信息傳遞有明顯的抑制作用，這種抑制作用存在一定的濃度依存性，但高濃度乙醇不能完全抑制GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)，提示乙醇攝入在一定程度上抑制GC對(duì)感覺信息的傳遞，但不能完全阻斷GC感覺信息傳遞。

(A) 吹風(fēng)刺激同側(cè)觸須墊誘發(fā)GC產(chǎn)生雙峰興奮性場(chǎng)電位反應(yīng)。(B，C)腦表面灌流濃度為50 mmol/L的乙醇，對(duì)感覺刺激誘發(fā)GC反應(yīng)的潛伏期沒有明顯影響，但明顯感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)，表明乙醇明顯抑制小鼠小腦GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)

圖3乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞場(chǎng)電位反應(yīng)的影響

圖4乙醇對(duì)小腦GC感覺信息傳遞有明顯的抑制作用，這種抑制作用存在一定的濃度依存性，但高濃度乙醇不能完全抑制GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)，提示乙醇攝入在一定程度上抑制GC對(duì)感覺信息的傳遞，但不能完全阻斷GC感覺信息傳遞

2.2.2乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞(GC)場(chǎng)電位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征的影響一般認(rèn)為乙醇與苯巴比妥類麻醉藥物的作用相似，通過激動(dòng)GABAA受體活性增強(qiáng)神經(jīng)元的抑制作用，調(diào)節(jié)受體和遞質(zhì)傳遞。本研究結(jié)果表明，乙醇對(duì)小腦GC感覺信息傳遞有明顯的抑制作用，抑制作用有濃度依存性，高濃度乙醇對(duì)GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)抑制的抑制明顯，可使GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)降低20%左右，提示高濃度乙醇可能影響感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。進(jìn)一步分析表明：小腦表面灌流高濃度乙醇(500 mmol/L)，P1中間值為給藥前的81.7%±4.5% (P<0.05 vs ACSF；n=5；見圖5A)，波形下面積為給藥前的82.3%±4.8% (P<0.05 vs ACSF；n=5；見圖5B)，進(jìn)一步證實(shí)乙醇對(duì)小腦GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)的抑制作用。另外，對(duì)感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)波形的動(dòng)力學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)：小腦表面灌流高濃度乙醇(500 mmol/L)后，P1波形上升相的Tau值從給藥前的5.45±0.65 ms降低至3.61±1.10 ms(P<0.05；n=5)。P1上升相代表感覺刺激誘導(dǎo)的興奮性遞質(zhì)釋放并與相應(yīng)受體結(jié)合過程，乙醇使P1上升相Tau值減少，在一定程度上說明乙醇可能減少興奮性遞質(zhì)釋放、或降低遞質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合的數(shù)量。P1波形消退相的Tau值從給藥前的9.11±2.46 ms降低至5.86±1.31 ms (P<0.05；n=5)。P1消退相代表感覺刺激誘導(dǎo)的興奮性遞質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合后失活或分離過程，乙醇使P1消退相Tau值減少，可能與乙醇減少興奮性遞質(zhì)釋放、或降低遞質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合的數(shù)量有關(guān)。上述結(jié)果表明，腦表面灌流乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有明顯的抑制作用。

(A)乙醇對(duì)小腦GC感覺信息傳遞有明顯的抑制作用；(B)小腦表面灌流高濃度乙醇，P1中間值相比較給藥前明顯下降；(C)波形下面積比給藥前明顯下降；(D)P1上升參數(shù)給藥前明顯下降；(E)衰減參數(shù)比給藥前明顯下降

圖5乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞場(chǎng)電位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征的影響

2.3乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞(GC)場(chǎng)電位反應(yīng)影響的藥理學(xué)機(jī)制顆粒細(xì)胞層主要由GC和Golgi細(xì)胞組成，Golgi細(xì)胞是顆粒細(xì)胞層主要的抑制性中間神經(jīng)元，通過釋放GABA使顆粒細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)性抑制和陣發(fā)性抑制。乙醇可以直接興奮Golgi細(xì)胞對(duì)GC產(chǎn)生陣發(fā)性抑制，同時(shí)導(dǎo)致GABA向GC周圍溢出增多，使環(huán)境中的GABA濃度升高，對(duì)GC產(chǎn)生持續(xù)性抑制。本研究發(fā)現(xiàn)乙醇明顯抑制感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)，降低P1和P2幅值、抑制誘發(fā)場(chǎng)電位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，提示乙醇可能通過增強(qiáng)GABAA受體活性而對(duì)GC感覺信息傳遞產(chǎn)生持續(xù)性抑制作用。為了明確乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)的抑制作用是否與GABAA受體有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選用特異性GABAA受體阻斷劑，SR95531(見圖6)。腦表面灌流300 mmol/L乙醇明顯抑制感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)，與灌流酒精前相比，P1峰值降至81.7%±3.0%(P<0.05；n=5)，沖洗20 min后恢復(fù)至98.9%±1.3%，隨后灌流SR95531(20 μm)導(dǎo)致P1峰值增加至107.8%±1.5%(P<0.05 vs ACSF；n=5)，在SR95531(20 μmol/L)存在條件下灌流乙醇(300 mmol/L)10 min后，P1峰值為ACSF狀態(tài)下的103.3%±3.9% (P>0.05 vs ACSF；n=5)，SR95531阻斷了乙醇導(dǎo)致的感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)的抑制作用，表明乙醇通過增強(qiáng)GABAA受體活性對(duì)GC感覺信息傳遞產(chǎn)生持續(xù)性抑制作用。

圖6乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)顆粒細(xì)胞場(chǎng)電位反應(yīng)影響的藥理學(xué)機(jī)制；乙醇通過增強(qiáng)GABAA受體活性對(duì)GC感覺信息傳遞產(chǎn)生持續(xù)性抑制

3　討　論

小腦是重要的運(yùn)動(dòng)中樞，小腦皮質(zhì)將外部信息進(jìn)行精密運(yùn)算與綜合后，由浦肯野細(xì)胞發(fā)出各種輸出指令，來完成各種生理活動(dòng)。浦肯野氏細(xì)胞(PC)是小腦皮質(zhì)的主神經(jīng)元，其軸突構(gòu)成小腦皮質(zhì)的唯一傳出路徑，通過其軸突末梢釋放GABA，對(duì)其所支配的小腦核團(tuán)神經(jīng)元發(fā)揮持續(xù)的抑制作用。在小腦的傳入纖維中，爬行纖維和苔狀纖維均與PC樹突形成興奮性突出聯(lián)系[1，2]。爬行纖維的興奮性傳入可引起PC興奮，表現(xiàn)為復(fù)雜峰電位放電(complex spikes，CS)而苔狀纖維與顆粒細(xì)胞形成突觸聯(lián)系后，通過顆粒細(xì)胞的軸突-平行纖維來間接地興奮PC，表現(xiàn)為簡(jiǎn)單峰電位放電(simple spike，SS)。藍(lán)狀細(xì)胞(BC)和星狀細(xì)胞(SC)都是PC的抑制性中間神經(jīng)元，BC的長軸突末梢包裹在3-5個(gè)PC的胞體和軸突起始段，BC興奮可直接從胞體抑制PC；而SC的軸突選擇性地與PC樹突形成抑制性突觸聯(lián)系，對(duì)PC樹突產(chǎn)生抑制，分流平行纖維的興奮性傳入[3]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為感覺信息通過苔狀纖維-顆粒細(xì)胞-平行纖維途徑，興奮一束平行纖維及其支配的PC[4]。雖然大量小腦切片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都與傳統(tǒng)理論相吻合，但在整體動(dòng)物上自然感覺刺激始終沒能誘發(fā)一束小腦皮質(zhì)PC產(chǎn)生興奮[5～7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)感覺刺激不能興奮PC，反而導(dǎo)致 PC產(chǎn)生IPSP(IPSCs)，并伴有放電暫停，感覺刺激只有在阻斷GABAA受體活性后，才可以誘發(fā)PC興奮[8，9]，表明抑制性中間神經(jīng)元在小腦皮質(zhì)感覺信息傳遞過程中起決定性作用。本研究發(fā)現(xiàn)吹風(fēng)刺激小鼠觸須墊，可誘發(fā)小腦CrusII區(qū)顆粒細(xì)胞高保真反應(yīng)，表現(xiàn)為刺激開始反應(yīng)大于刺激結(jié)束反應(yīng)，表明感覺刺激信息通過苔狀纖維-GC途徑傳入小腦皮質(zhì)時(shí)保存完整，對(duì)刺激開始和結(jié)束信息編碼完整，表明小腦GC對(duì)感覺信息的傳遞具有高保真性。

乙醇主要通過調(diào)節(jié)受體和遞質(zhì)傳遞來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，一般認(rèn)為乙醇與苯巴比妥類麻醉藥物的作用非常相似，對(duì)GABAA受體活性有激動(dòng)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，GABAA受體激動(dòng)劑，蠅蕈醇(muscimol)可以增強(qiáng)乙醇的鎮(zhèn)靜作用，而GABAA受體阻斷劑，印防己毒素(picrotoxin)和荷苞牡丹堿(bicucilline)可以拮抗乙醇的鎮(zhèn)靜和運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào)癥狀，而苯二卓類(benzodiazepines)可以增強(qiáng)乙醇對(duì)GABAA的激動(dòng)作用[10]。體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)乙醇明顯抑制N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體活性，導(dǎo)致NMDA通道電流減小[11]。Mameli等人在小腦切片上應(yīng)用膜片鉗和藥理學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以增加PC自發(fā)性抑制性突觸后電流(IPSCs)的發(fā)生頻率，可使電刺激誘發(fā)的IPSC振幅增加，雙刺激比率(paired-pulse ratio)降低；而細(xì)胞接觸記錄顯示乙醇并不影響PC自發(fā)性發(fā)電頻率，他們主張乙醇對(duì)PC的抑制作用是突觸前行為，可能與顆粒細(xì)胞的興奮性傳入減少有關(guān)[12]。動(dòng)物長期飲用(大于3 m)濃度大于18%的乙醇飲料，可以導(dǎo)致PC活動(dòng)明顯抑制，單純性和復(fù)雜性峰電位放電頻率均減少；而對(duì)GC活動(dòng)無顯著影響[13]。

顆粒細(xì)胞層主要的抑制性中間神經(jīng)元，它接受平行纖維的興奮性傳入，為顆粒細(xì)胞提供反饋抑制，以減弱平行纖維對(duì)PC的興奮性傳入[2]。Golgi細(xì)胞向GC提供持續(xù)性抑制和陣發(fā)性抑制。本研究發(fā)現(xiàn)：乙醇對(duì)小腦GC感覺信息傳遞有明顯的抑制作用，這種抑制作用存在一定的濃度依存性，但高濃度乙醇不能完全抑制GC對(duì)感覺刺激的反應(yīng)，提示乙醇攝入可通過增強(qiáng)GABAA受體活性抑制GC對(duì)感覺信息的傳遞，但不能完全阻斷GC感覺信息傳遞。應(yīng)用GABAA受體阻斷劑完全阻斷了乙醇導(dǎo)致的感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)的抑制作用，表明乙醇通過增強(qiáng)GABAA受體活性對(duì)GC感覺信息傳遞產(chǎn)生持續(xù)性抑制作用。本研究結(jié)果可能與以下因素有關(guān)：(1)乙醇通過調(diào)節(jié)受體和遞質(zhì)傳遞來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，對(duì)GABAA受體活性有激動(dòng)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，GABAA受體激動(dòng)劑蠅蕈醇可以增強(qiáng)乙醇的鎮(zhèn)靜作用，而GABAA受體阻斷劑，印防己毒素和荷苞牡丹堿可以拮抗乙醇的鎮(zhèn)靜和運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào)癥狀，但苯二卓類可以增強(qiáng)乙醇對(duì)GABAA的激動(dòng)作用[10]。因此，環(huán)境中乙醇濃度的增高，可能直接激動(dòng)GC上的GABAA受體，對(duì)GC細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)性抑制作用。(2)環(huán)境中乙醇濃度的增高也可能與內(nèi)源性GABA產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)而增強(qiáng)內(nèi)源性GABA對(duì)GC的抑制作用。(3)乙醇通過抑制Golgi細(xì)胞內(nèi)的Na+/K+ATP酶的活性，增加Golgi細(xì)胞興奮性，從而增強(qiáng)對(duì)GC的陣發(fā)性抑制，并增加GABA向GC周圍溢出，導(dǎo)致環(huán)境中的GABA濃度升高，進(jìn)而增加GC的持續(xù)性抑制[14]。因此，小腦皮質(zhì)乙醇濃度的增高可以興奮Golgi細(xì)胞，增加GABA的釋放，提高GC周圍GABA的濃度，增加GC的持續(xù)性抑制，抑制GC感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)。另外，在小腦切片上，乙醇不影響PC自發(fā)性發(fā)電頻率，但可以增加PC自發(fā)性抑制性突觸后電流(IPSCs)的發(fā)生頻率，可使電刺激誘發(fā)的IPSC振幅增加、雙刺激比率降低，提示乙醇可能抑制顆粒細(xì)胞的興奮性傳入 。

另外，高濃度乙醇不僅降低P1振幅值，而且明顯降低P1振幅中值、振幅下面積、P1上升參數(shù)和衰減參數(shù)，表明腦表面灌流乙醇對(duì)感覺刺激誘發(fā)GC場(chǎng)電位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有明顯的抑制作用。在一定程度上提示乙醇可能通過活化GABAA受體而抑制興奮性遞質(zhì)釋放、或妨礙興奮性遞質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合。

總之，乙醇對(duì)GABAA受體活性有激動(dòng)作用，可以通過增強(qiáng)GABAA受體活性對(duì)小腦顆粒細(xì)胞感覺刺激誘發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明乙醇抑制小腦顆粒細(xì)胞對(duì)感覺信息的傳遞，提示急性酒中毒對(duì)小腦運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能的損害可能與乙醇抑制小腦皮質(zhì)感覺信息傳遞有關(guān)。研究結(jié)果有助于解明酒中毒性小腦病變的發(fā)生機(jī)理，為臨床治療提供理論依據(jù)。

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Mechanisms of ethanol affects sensory stimulus-evoked response in cerebelalr granule cell in vivo in mice

JINJuan，XIANFengyuan，WUGuang，etal.

(DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalYanbianUniversity，Yanji133000，China)

ObjectiveThe mechanisms of the effects of ethanol on the sensory information transferred by cerebellar GCs，and reveal a partial mechanisms of sensory information integration and transmission in cerebellar cortex. MethodsAfter ICR mice were anesthetized by intraperitoneal injection of urethane (1.3 g/kg body weight i.p.)，a 1～1.5 mm craniotomy were drilled to expose the cerebellar surface corresponding to cerebellar cortex Crus II. The dura were removed，and the cerebellar surface was constantly superfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (ACSF). Sensory stimuli were performed by air-puff stimulation (60 ms，50～60 psi) of ipsilateral whisker pad. Field potential recording were employed to record the sensory stimuli evoked responses in cerebellar GC. Electrophysiological data were analyzed using Clampfit 10.1 software. Differences between the mean values recorded under control and test conditions were evaluated by Student’s paired t-test using SPSS software. Results(1) Air-puff stimulation of ipsilateral whisker-pad evoked high fidelity responses in GCs in cerebellar Crus II. (2) Cerebellar surface perfusion of ethanol did not change the latency of the evoked responses，but reversible inhibited the sensory stimulation evoked responses in GCs. (3) The ethanol-induced inhibition of the sensory stimulation evoked responses was concentration dependent，the minimal concentration is 0.5 mmol/L，the maximal inhibitory concentration is 300 mmol/L that induced a decrease in the normalized amplitude of P1 . (4) High concentration of ethanol significantly induced decreases in half-width，area，rise tau and decay tau of P1. (5) Blockade of GABAA receptor activity induced an increase in amplitude of P1，and abolished the ethanol induced inhibition in the sensory stimulation-evoked responses of GCs，indicated that ethanol induced inhibition in GC sensory stimulation-evoked responses of cerebellar Cs via the enhancement of GABAA receptors activity. ConclusionsEthanol inhibited the sensory-stimulation evoked responses in cerebellar GCs through the enhancement of GABA receptor activation，indicated that ethanol inhibited the cerebellar GCs to transfer the sensory information. These results suggested that the impairment of cerebellar motor coordination by acute alcohol intoxication could be related with ethanol induced inhibition in the cerebellar cortical sensory information transmission.

Alcohol；Mice cerebellar granule cell (GC)；Sensory stimuli；Synchronized with electrophysiology recording；GABAA receptor

1003-2754(2016)05-0448-06

2016-01-20；

2016-03-15

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 延邊 133002 )

崔松彪，E-mail：sbcui@ybu. edu. cn

R595.6

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