注射用丹參多酚酸對(duì)腦缺血大鼠VEGF、IL-10的影響

白　蓉，　王　淑

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注射用丹參多酚酸對(duì)腦缺血大鼠VEGF、IL-10的影響

白蓉，王淑

目的觀察丹參多酚酸注射液對(duì)腦缺血大鼠VEGF、IL-10表達(dá)的影響，探討丹參多酚酸的腦保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用線栓法建立大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死模型，SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(MCAO組)、丹參多酚酸治療組(治療組)，按缺血時(shí)間分為4個(gè)亞組(6 h、12 h、24 h、48 h)，采用Longa法評(píng)估大鼠神經(jīng)行為學(xué)，ELISA法測(cè)定血清VEGF、IL-10的含量，HE染色法觀察神經(jīng)元形態(tài)，免疫組化法、Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織VEGF、IL-10的表達(dá)。結(jié)果(1)Sham組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0；治療組與MCAO組相比，丹參多酚酸可以明顯降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(P<0.05)。(2)與Sham組相比，MCAO組與治療組血清VEGF、IL-10含量均升高(P<0.05)，但治療組升高更顯著(P<0.05)。(3)MCAO組、治療組缺血半暗區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元均較Sham組少，治療組較MCAO組神經(jīng)元數(shù)目明顯增多；Sham組可見(jiàn)少量VEGF、IL-10表達(dá)，治療組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEGF、IL-10的表達(dá)均較MCAO組增多(P均<0.05)。結(jié)論丹參多酚酸增強(qiáng)大鼠腦缺血后VEGF、IL-10的表達(dá)，可能是其保護(hù)腦細(xì)胞機(jī)制之一。

丹參多酚酸；腦缺血；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；白細(xì)胞介素-10

缺血性腦血管病具有高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率，極大危害人類健康，如何減輕缺血后的神經(jīng)損傷成為臨床治療的重點(diǎn)。腦缺血發(fā)生后，缺血半暗區(qū)會(huì)產(chǎn)生大量血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等與血管新生有關(guān)的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管的新生。[1]炎癥反應(yīng)也是腦缺血損傷的重要機(jī)制之一，白細(xì)胞介素-10(IL-10)是抗炎細(xì)胞因子，在腦缺血后發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。丹參是經(jīng)典而傳統(tǒng)的中藥材，作為治療缺血性腦損傷藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。丹參多酚酸(Salvianolate)為丹參的水溶性提取物，在治療大鼠局灶性腦缺血方面具有顯著療效，可通過(guò)降低大鼠腦組織缺血面積，細(xì)胞氧化損傷，抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，達(dá)到治療急性腦缺血目的[3]。但其對(duì)大鼠腦缺血后VEGF、IL-10的表達(dá)的影響尚少見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)ELISA法、HE染色法、免疫組化法及Western blot方法檢測(cè)VEGF、IL-10的表達(dá)情況，以闡明丹參多酚酸對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性SD大鼠120只(體重250～280 g)，清潔級(jí)，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(MCAO組)、丹參多酚酸治療組(治療組)，再按缺血時(shí)間隨機(jī)分為6 h、12 h、24 h、48 h 4個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只，5只用來(lái)做組織學(xué)染色，5只用來(lái)做Western blot蛋白檢測(cè)。

1.1.2試劑及儀器注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z20110011，規(guī)格為每支裝0.13 g)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(康為世紀(jì))；兔抗大鼠VEGF、IL-10抗體(Abcam公司)；山羊抗兔IgG-FITC(康為世紀(jì))；VEGF的ELISA試劑盒(上海巧伊公司)；IL-10的ELISA試劑盒(美國(guó) raybiotech公司)；石蠟切片機(jī)；熒光顯微鏡(BX50 Olympus)；Leica 顯微成像系統(tǒng)(德國(guó)萊爾公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Sat公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型建立及給藥途徑采用改良Longa法制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型[4，5]。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉成功后取仰臥位，頸部正中切口，依次分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈并掛線備用，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾暫夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈靠近分叉處剪一小口，將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，去掉動(dòng)脈夾，緩慢插入至有阻力時(shí)停止進(jìn)線，深度約18mm，扎緊備線，消毒，縫合，術(shù)后保溫。Sham組除了不結(jié)扎血管其余步驟同模型組。大鼠清醒后治療組腹腔注射已被0.9%氯化鈉注射液稀釋后的丹參多酚酸30 mg/kg，MCAO組、Sham組給予等量的生理鹽水。

1.2.2神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分手術(shù)大鼠清醒后按Longa法[6]對(duì)大鼠神經(jīng)行為評(píng)分，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：不能完全伸直右側(cè)前爪；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1～3分為成功造模。

1.2.3ELISA法測(cè)定腦缺血大鼠血清VEGF、IL-10含量于各時(shí)間點(diǎn)取大鼠上腔靜脈血，4 ℃離心取上清，分別按VEGF、IL-10檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗夾心法)檢測(cè)，具體方法按說(shuō)明書操作。

1.2.4HE染色法觀察腦缺血大鼠組織學(xué)形態(tài)變化大鼠分別于缺血6 h、12 h、24 h、48 h后經(jīng)多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，進(jìn)行石蠟包埋，切片，厚度約5 μm，常規(guī)脫蠟水化，蘇木精染色，酸化伊紅乙醇復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.2.5免疫組化法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)VEGF、IL-10蛋白表達(dá)取上述石蠟切片，脫蠟修復(fù)，分別一抗、二抗孵育，DAB染色，中性樹膠封片，每張圖片在缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6Western blot檢測(cè)VEGF、IL-10蛋白動(dòng)物模型制備后各時(shí)間點(diǎn)，將大鼠麻醉后取左側(cè)缺血區(qū)皮質(zhì)腦組織，冰上進(jìn)行蛋白裂解及研磨，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣、電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉，一抗孵育4 ℃過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，在暗室曝光顯影。所得圖像用Image J圖像處理軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參吸光度的比值即為目的蛋白相對(duì)值。

2　結(jié)　果

2.1大鼠神經(jīng)行為變化Sham組神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分；治療組與MCAO組相比，腦缺血后6 h、12 h神經(jīng)功能無(wú)明顯差異(P>0.05)，24 h、48 h神經(jīng)功能改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2VEGF、IL-10的ELISA結(jié)果Sham組血清VEGF、IL-10含量少，MCAO組與治療組均較Sham組高(P<0.05)，治療組與MCAO組相比，血清VEGF、IL-10水平均升高(P<0.05)(見(jiàn)表2、表3)。

2.3腦缺血大鼠形態(tài)學(xué)觀察Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，胞核染色清晰，胞質(zhì)均勻(見(jiàn)圖1A)。缺血后梗死灶周圍神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，胞核固縮，胞質(zhì)不均勻(見(jiàn)圖1B～I(xiàn))。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可以看出治療組均較MCAO組正常的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多。

2.4VEGF、IL-10蛋白的表達(dá)情況Sham組大鼠腦組織 VEGF、IL-10僅少量表達(dá)。MCAO組、治療組VEGF、IL-10的表達(dá)6 h時(shí)開始升高，24 h達(dá)到高峰，48 h稍有下降(見(jiàn)圖2～圖4)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療組與MCAO組比較明顯升高(P<0.05)(見(jiàn)表4～表7)。

表1　大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[n=5，M(Q)]

用秩和檢驗(yàn)，MCAO-SLI組與MCAO組比較*P<0.05

表2　各組大鼠血清VEGF濃度(pg/ml)的比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表3　各組大鼠血清IL-10濃度(pg/ml)的比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表4　各組大鼠VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

與Sham組比較，*P<0.05；與MCAO組比較，△P<0.05

表5　各組大鼠IL-10陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表6　各組大鼠VEGF的相對(duì)灰度值比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

表7　各組大鼠IL-10的相對(duì)灰度值比較

與Sham組比較*P<0.05；與MCAO組比較△P<0.05

圖1　各組大鼠形態(tài)學(xué)所見(jiàn)

圖2　各組大鼠VEGF表達(dá)情況

圖3　各組大鼠IL-10表達(dá)情況

1、2、3、4：Sham組6 h、12 h、24 h、48 h；5、6、7、8：MCAO組6 h、12 h、24 h、48 h；9、10、11、12：治療組6 h、12 h、24 h、48 h

圖4各組大鼠缺血腦組織VEGF、IL-10的表達(dá)

3　討　論

VEGF最初被發(fā)現(xiàn)是一種血管生長(zhǎng)和血管滲透因子，參與神經(jīng)保護(hù)、抗炎過(guò)程、神經(jīng)突觸增生及缺血大腦重塑[7，8]。Yang等[9]采用大腦中動(dòng)脈閉塞的局灶性腦缺血再灌注兔模型，在缺血2 h后顱內(nèi)顯微鏡下注射不同劑量(低劑量：1.25 ng/μl，中劑量：2.5 ng/μl，高劑量：5.0 ng/μl)VEGF，觀察兔腦梗死體積、含水量及神經(jīng)功能缺損變化，發(fā)現(xiàn)中劑量(2.5 ng/μl)組明顯降低腦梗死體積、腦組織含水量及改善神經(jīng)行為功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，低劑量組、高劑量組腦梗死體積與生理鹽水對(duì)照組無(wú)明顯差異，低劑量組腦組織含水量及神經(jīng)行為功能與生理鹽水對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。脊髓損傷大鼠模型中在其損傷24 h后，病灶中心處注射人重組VEGF165發(fā)現(xiàn)IL-1β，TNF-α，IL-10的水平下調(diào)，促進(jìn)大鼠神經(jīng)行為功能恢復(fù)，減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失，表明VEGF可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而抑制脊髓損傷[10]。在VD大鼠通過(guò)外源性給予VEGF利用電生理學(xué)技術(shù)，記錄大鼠海馬CA1區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)，發(fā)現(xiàn)VEGF明顯升高VD大鼠的LTP，改善突觸可塑性的降低[11]。Hayashi[12]利用cDNA序列等方法觀察血管生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)，研究了96個(gè)與血管新生相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)42個(gè)(43.8%)，29個(gè)(30.2%)和13個(gè)(13.5%)基因分別在1 h、1 d、21 d增加，在腦缺血后24 h即出現(xiàn)增值的內(nèi)皮細(xì)胞，3 d后血管數(shù)目增加，這意味著在腦缺血損傷后立即發(fā)生血管生成。

腦缺血損傷包括一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其中炎癥反應(yīng)在缺血中所引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷中起著關(guān)鍵作用。IL-10是由活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞等分泌的高活性多功能蛋白多肽分子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，是重要的抗炎細(xì)胞因子之一。Griui 等[13]使用IL-10基因敲除小鼠，在腦梗死24 h后，其腦梗死體積較MCAO小鼠腦梗死體積大30%；研究擴(kuò)展至體外模型，與來(lái)源于野生型小鼠的神經(jīng)元原代細(xì)胞相比，來(lái)源于IL-10基因敲除小鼠的神經(jīng)元原代細(xì)胞對(duì)興奮性毒性及氧-糖剝奪更敏感；結(jié)合體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，表明外源性及內(nèi)源性的IL- 10在腦缺血時(shí)都具有神經(jīng)保護(hù)作用。

近年來(lái)，關(guān)于中藥在急性腦缺血損傷的治療方面研究非常活躍，丹參的應(yīng)用尤其廣泛，丹參多酚酸是丹參水溶性有機(jī)酸，可通過(guò)血腦屏障，主要通過(guò)以下幾個(gè)途徑改善腦缺血：(1)增加缺血區(qū)腦血流量；(2)抗血小板聚集作用，對(duì)凝血系統(tǒng)無(wú)影響，無(wú)出血風(fēng)險(xiǎn)；(3)抗氧化、清除自由基作用；(4)對(duì)缺氧引起的線粒體損傷有顯著的保護(hù)作用；(5)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制細(xì)胞凋亡[14～17]。He等[18]通過(guò)對(duì)1型糖尿病MCAO大鼠腦缺血24 h后通過(guò)尾靜脈注射丹參多酚酸，每天1次并持續(xù)14 d，發(fā)現(xiàn)VEGF、BDNF的表達(dá)增加以及上調(diào)BDNF-TrkB-CREB信號(hào)通路，減小梗死體積，從而促進(jìn)I型糖尿病MCAO大鼠腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)。

關(guān)于丹參多酚酸在腦缺血早期抗炎及血管保護(hù)方面的國(guó)內(nèi)外研究尚少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用丹參多酚酸作為治療腦缺血損傷的藥物，采用左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，選取腦缺血6 h、12 h、24 h、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)從血管保護(hù)及抗炎的角度闡明其腦保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠通過(guò)丹參多酚酸干預(yù)后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療組血清及腦組織VEGF、IL-10表達(dá)水平明顯高于MCAO組，且呈動(dòng)態(tài)變化，6 h少量表達(dá)，12 h繼續(xù)增高，24 h達(dá)高峰，48 h稍下降但仍處于較高水平，減少神經(jīng)元凋亡數(shù)，有效的改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能。由此推測(cè)丹參多酚酸在缺血性腦血管病早期通過(guò)增強(qiáng)VEGF的表達(dá)發(fā)揮血管保護(hù)作用，通過(guò)增強(qiáng)IL-10的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，減輕腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，為闡明丹參多酚酸治療腦缺血提供新的理論依據(jù)和治療思路。

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The effect of Salvianolate on expression of VEGF、IL-10 after focal cerebral ischemia injury in rats

BAIRong，WANGShu.

(DepartmentofNeurology，InstituteofClinicalMedicine，TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Salvianolate on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)、IL-10 in rats with cerebral ischemia injury，and to further explore the mechanism and neuroprotection of Salvianolate. MethodsThe left middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats models were established by Longa method. SD rats were randomly divided into three groups：sham group，MCAO group，salvianolate group. According to different ischemia time，each group was divided into 4 subtypes(6 h、12 h、24 h、48 h). The rat neurobehavioral score was evaluated by Longa’s test. The concentration of VEGF、IL-10 in serum were detected by ELISA. HE staining was used to observe the morphological structure of cortical neurons. The expressions of VEGF、IL-10 were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results(1)The neurobehavioral score of sham group was 0.Compared with MCAO group，salvianolate could obviously reduce the behavior score in rats. (2)Compared with sham group，the concentration of VEGF、IL-10 in serum increased in MCAO group and increased obviously in salvianolate group. (3)The number of neurons in MCAO group and salvianolate group were significantly decreased than in sham group. Compared with MCAO group，the number of neurons was increased in salvianolate group. A little expression of VEGF、IL-10 could be seen on cerebral cores in sham group. The expression of VEGF、IL-10 in salvianolate group were higher than MCAO group at different time points. ConclusionSalvianolate could enhance the expression of VEGF、IL-10 after ischemia in rats. This perhaps was one of the important protective mechanisms.

Salvianolate；Middle cerebral artery occlusion(MCAO)；Vascular endothelial growth factor(VEGF)；Interleukin-10(IL-10)

1003-2754(2016)05-0411-06

2016-01-25；

2016-04-23

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

白蓉，E-mail：bai13838169212@163.com

R743.3

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