癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬區(qū)鉀離子通道Kv1.3的表達(dá)研究

金　銜，　馬　笑，　李　深

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癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬區(qū)鉀離子通道Kv1.3的表達(dá)研究

金銜，馬笑，李深

目的研究氯化鋰-匹羅卡品致癲癇持續(xù)狀態(tài) (status epilepticus，SE) 后大鼠海馬區(qū)鉀離子通道Kv1.3的表達(dá)及分布變化，探討鉀離子通道Kv1.3與癲癇發(fā)作的相關(guān)性。方法48只健康雄性sprague-dawley大鼠隨機(jī)平分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組繼續(xù)隨機(jī)分為6 h、1 d、2 d和3 d 4個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)亞組(n=6)。通過大鼠腦電監(jiān)測(cè)記錄大鼠腦電變化情況，通過尼氏染色觀察腦組織病理改變，采用免疫組織化學(xué)染色和Western-blot方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)Kv1.3的表達(dá)及分布變化。結(jié)果(1)腦電監(jiān)測(cè)：正常大鼠腦電圖表現(xiàn)為波幅較均勻一致的α波，癇性發(fā)作后開始出現(xiàn)慢波、棘波，波幅、節(jié)律不規(guī)則，SE過程中表現(xiàn)為長(zhǎng)程的棘波活動(dòng)。(2)尼氏染色：SE后6 h未發(fā)現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)及神經(jīng)元數(shù)量改變；SE后1 d，海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，神經(jīng)元數(shù)量減少；SE后2 d、3 d，海馬區(qū)神經(jīng)元進(jìn)一步減少，且出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹、變形、尼氏小體減少甚至消失。(3)免疫組織化學(xué)染色和Western-blot檢測(cè)：SE后2 d，Kv1.3在海馬CA3和CA1區(qū)表達(dá)較對(duì)照組明顯減少 (P<0.05)。SE后6 h、1 d、3 d，Kv1.3在海馬CA3和CA1區(qū)表達(dá)較對(duì)照組無明顯變化 (P>0.05)。SE后6 h、1 d、2 d、3 d，Kv1.3在海馬DG區(qū)表達(dá)較對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論Kv1.3的表達(dá)下調(diào)可能與癲癇發(fā)作相關(guān)。

癲癇持續(xù)狀態(tài)；鉀離子通道；Kv1.3；海馬

癲癇是各種原因?qū)е碌拇竽X局部神經(jīng)元異常高頻同步放電并向周圍腦組織擴(kuò)散的腦部疾病。我國癲癇的患病率約為5‰。目前，仍有20%～40%的癲癇患者的癥狀得不到有效控制。因此，對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制和新的抗癲癇藥物的開發(fā)一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)，具有重大的社會(huì)意義。本研究通過檢測(cè)癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬區(qū)Kv1.3的表達(dá)和分布情況，探索Kv1.3與癲癇發(fā)作的相關(guān)性。

1　材料和方法

1.1材料健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。氯化鋰、匹羅卡品購自美國Sigma-Aldrich公司，兔抗大鼠Kv1.3多克隆抗體購自以色列Alomone Labs公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，全細(xì)胞蛋白提取液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，兔抗大鼠GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自南京巴傲德生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，預(yù)染蛋白Marker、ECL發(fā)光液購自美國Thermo Scientific公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型建立48只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組繼續(xù)隨機(jī)分為6 h、1 d、2 d和3 d 4個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)亞組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組大鼠予以腹腔注射氯化鋰和匹羅卡品(氯化鋰劑量為3 mEq/kg (125 mg/kg)，匹羅卡品劑量為25 mg/kg)建立癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，對(duì)照組大鼠于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水，觀察大鼠活動(dòng)情況。按照Racine六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)大鼠癲癇發(fā)作情況：0級(jí)：無癇性發(fā)作；Ⅰ級(jí)：濕狗樣抖動(dòng)、面肌痙攣如眨眼、動(dòng)須及節(jié)律性咀嚼；Ⅱ級(jí)：頸部肌肉痙攣，表現(xiàn)為點(diǎn)頭和(或)甩尾；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣伴站立；Ⅴ級(jí)：全身陣攣，失去平衡，跌倒。若大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作，并達(dá)到Racine Ⅳ-Ⅴ級(jí)發(fā)作為造模成功。發(fā)作進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)并持續(xù)50 min后予以腹腔注射10% 水合氯醛終止發(fā)作。分別于觀察時(shí)間點(diǎn)取腦組織，沿中線分為左右兩部分，一側(cè)腦組織用于制備石蠟切片，另一側(cè)腦組織用于提取海馬區(qū)蛋白。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色(1)切片脫蠟至水；(2)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(3)0.3%過氧化氫/甲醇溶液室溫孵育30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；(4)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(5)枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原；(6)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(7)A液(山羊血清封閉液)37 ℃封閉2 h；(8)一抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；(9)復(fù)溫30 min；(10)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(11)B液(生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG)37 ℃孵育1 h；(12)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(13)C液(辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，S-A/HRP)37 ℃孵育30 min；(14)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(15)DAB顯色；(16)脫水透明；(17)中性樹膠封片，晾干；(18)觀察：使用光學(xué)顯微鏡觀察Kv1.3在海馬CA1、CA3和DG區(qū)的表達(dá)情況，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量光密度值。

1.2.3Western-blot(1)提取海馬區(qū)蛋白：分離海馬并放入玻璃勻漿器中，加入適量的蛋白裂解液(海馬組織與蛋白裂解液的比例為1∶5，w/v)，置于冰上充分勻漿后移入1.5 ml EP管中，4 ℃，12000 r/min離心30 min，取上清液；(2)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度；(3)蛋白變性：將蛋白樣品稀釋為2 μg/μl，分裝40 μl/EP管，向每個(gè)EP管中加入10 μl 5×上樣緩沖液，混勻，100 ℃變性5 min，冷卻后于4 ℃保存?zhèn)溆茫?4)SDS-PAGE電泳：放置好制膠玻璃板，先后灌注10%的分離膠和5%濃縮膠。插入梳子，待凝膠聚合完全后拔出梳子。放玻璃板入電泳槽內(nèi)，向電泳槽內(nèi)加入1×電泳緩沖液，按組別順序?qū)⒏鞯鞍讟悠泛皖A(yù)染Marker加入上樣孔內(nèi)，蛋白樣品上樣量為20 μg/孔，預(yù)染Marker上樣量為5 μl/孔。接通電源，先調(diào)整電壓為80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)全部進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為100 V，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底端時(shí)關(guān)閉電源，終止電泳；(5)轉(zhuǎn)膜：截取凝膠，剪裁與凝膠大小相同的濾紙和PVDF膜，在石墨電極上依次整齊放置濾紙(3層)、PVDF膜、凝膠和濾紙(3層)，小心搟除氣泡，蓋好蓋板，接通電源，轉(zhuǎn)膜55 min；(6)封閉：5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；(7)孵育一抗：TBST漂洗PVDF膜，于雜交袋中4 ℃孵育一抗(Kv 1.3抗體稀釋濃度為1∶200，GAPDH抗體稀釋濃度為1∶1000)過夜；(8)TBST漂洗PVDF膜4次，每次12 min；(9)孵育二抗：于雜交袋中孵育二抗(1∶5000)，室溫下孵育2 h；(10)TBST漂洗PVDF膜4次，每次12 min；(11)顯影(暗室中操作)：控制曝光時(shí)間，然后將X光片置于顯影液中1 min，轉(zhuǎn)至定影液中定影5 min，用清水沖洗，晾干。(12)圖像分析：掃描膠片，用Image J軟件測(cè)量各個(gè)條帶的光密度值(IOD)，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的IOD比值，作為半定量分析指標(biāo)。

2　結(jié)　果

2.1腦電監(jiān)測(cè)造模前大鼠和對(duì)照組大鼠腦電圖表現(xiàn)為波幅較均勻一致的α波；實(shí)驗(yàn)組大鼠癲癇發(fā)作后逐漸出現(xiàn)慢波、棘波，波幅、節(jié)律不規(guī)則，SE過程中表現(xiàn)為長(zhǎng)程的棘波活動(dòng)(見圖1)。

A為大鼠造模前腦電圖，B為大鼠SE時(shí)腦電圖

2.2尼氏染色對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊。實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬組織在SE后6 h，未發(fā)現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)及神經(jīng)元數(shù)量改變；在SE后1 d出現(xiàn)細(xì)胞離散，排列松散，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少；

SE后2 d、3 d，海馬組織神經(jīng)元進(jìn)一步減少，且出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹、變形、尼氏小體減少甚至消失(見圖2)。

2.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Kv1.3的表達(dá)Kv1.3陽性染色為棕褐色，主要存在于細(xì)胞膜上。Kv1.3在正常大鼠及SE大鼠海馬區(qū)廣泛分布，富集于CA3和CA1錐體細(xì)胞胞體和突起，以及齒狀回 (dentate gyrus，DG) 顆粒細(xì)胞。SE后6 h、1 d，Kv1.3在海馬CA3和CA1區(qū)表達(dá)水平與對(duì)照組無明顯差異 (P>0.05)。SE后2 d，Kv 1.3在海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)表達(dá)水平較對(duì)照組明顯減少 (P<0.05)。SE后3 d，Kv1.3在海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)表達(dá)水平恢復(fù)至與對(duì)照組相同水平。SE后6 h、1 d、2 d、3 d，Kv1.3在海馬DG區(qū)的表達(dá)水平均與對(duì)照組相比無明顯差異 (P>0.05)(見圖3～圖5、表1)。

圖2　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各觀察時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)觀察(尼氏染色50×)

圖3　不同觀察時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠海馬 CA3 區(qū) Kv1.3 表達(dá)情況(200×)

圖4　不同觀察時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠海馬 CA1 區(qū) Kv1.3 表達(dá)情況(200×)

圖5　不同觀察時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠海馬 DG 區(qū) Kv1.3 表達(dá)情況(200×)

分組 海馬分區(qū)CA3CA1DG對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組6h1d2d3d6h1d2d3d0.140±0.0180.136±0.0390.147±0.0210.149±0.0450.141±0.0530.095±0.0160.086±0.023*0.095±0.0170.134±0.0450.142±0.0530.150±0.0290.122±0.0300.138±0.0480.093±0.0220.086±0.024*0.099±0.0250.127±0.0230.116±0.0400.123±0.0260.128±0.0260.132±0.0450.099±0.0170.123±0.0320.094±0.027

表示實(shí)驗(yàn)組與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異*P<0.05

2.4Western-blot檢測(cè)Kv1.3的表達(dá)SE后2 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)Kv1.3表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；SE后6 h、1 d、3 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較無顯著性差異 (P>0.05)(見圖6、表2)。

圖6　不同觀察時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠海馬區(qū) Kv1.3 表達(dá)量

時(shí)間Kv1.3與GAPDH光密度比值對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組6h1d2d3d0.739±0.1330.721±0.0330.810±0.1390.800±0.0530.812±0.0950.856±0.0170.314±0.085*0.577±0.110

表示實(shí)驗(yàn)組與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異*P<0.05

3　討　論

癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚不完全清楚。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，離子通道的活動(dòng)在維持神經(jīng)元膜電位穩(wěn)定中發(fā)揮十分重要的作用。越來越多的研究表明，癲癇是一種離子通道病[1，2]，編碼鉀、鈉、鈣、氯等離子通道的基因突變可導(dǎo)致其編碼的膜蛋白功能異常，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)外離子的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異常，引起神經(jīng)元高興奮性，導(dǎo)致癲癇的發(fā)生[3]。

鉀離子通道由70多種基因編碼，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中種類最多、分布最廣的膜蛋白，在神經(jīng)元膜靜息電位的維持和動(dòng)作電位復(fù)極化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，對(duì)控制膜興奮性和穩(wěn)定動(dòng)作電位幅度和頻率有重要作用，同時(shí)參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞凋亡等多種生理過程[4，5]。當(dāng)鉀離子通道減少或者鉀離子通道功能被阻斷時(shí)將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜興奮性增高，引起癲癇發(fā)作。近年來，鉀離子通道作為新興的抗癲癇藥物的作用靶點(diǎn)已得到了研究者的廣泛關(guān)注[6]。

研究表明，延遲整流鉀離子通道家族(Kv)是電壓門控鉀離子通道一個(gè)亞型，屬于延遲整流鉀離子通道，該離子通道開放時(shí)促進(jìn)鉀離子外流，在動(dòng)作電位復(fù)極化過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮積極作用。Kv1的結(jié)構(gòu)和功能異常與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。Kv1.1基因敲除小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)元高興奮性癥狀，并出現(xiàn)自發(fā)癇性發(fā)作，在基因水平證實(shí)Kv1與癲癇發(fā)生密切相關(guān)[7]。曾常茜、李亞偉等[8，9]證實(shí)Kv1.2和Kv1.4在癲癇發(fā)作大鼠腦內(nèi)表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，該變化從癲癇發(fā)生后1 h開始，48～72 h仍存在。本研究則旨在探索Kv1.3是否亦參與癲癇發(fā)生過程。研究證明，致驚厥劑戊四唑可明顯降低Kv1.3電流[10]，說明Kv1.3可能與癲癇發(fā)生有相關(guān)性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符合。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SE后2 d，Kv1.3在大鼠海馬CA1和CA3區(qū)表達(dá)明顯降低，且該變化持續(xù)時(shí)間較短，提示Kv1.3表達(dá)可能與癲癇發(fā)病過程的動(dòng)態(tài)演變相關(guān)。Kv1.3的表達(dá)變化在CA3和CA1區(qū)明顯，提示其在這兩個(gè)腦區(qū)內(nèi)發(fā)揮其病理生理作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SE后大鼠海馬區(qū)Kv1.3表達(dá)出現(xiàn)一過性降低，由此推測(cè)Kv1.3可能參與癲癇的發(fā)生過程，其發(fā)生機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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Study on the expression of potassium channel Kv1.3 in rat hippocampus after status epilepticus

JINXian，MAXiao，LIShen.

(DalianMunicipalCentralHospita，Dalian116033，China)

ObjectiveTo investigate the expression and distribution of potassium channel Kv1.3 in rat hippocampus after status epilepticus (SE) induced by lithium and pilocarpine，to explore the relationship between Kv1.3 and epileptogenesis. Methods48 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into experiment group and control group. The rats in each group were further randomly assigned into 6 h，1 d，2 d and 3 d subgroups (n=6). Electroencephalography (EEG) of rats in both groups were recorded to show the electrical activity of the rat brains. Nissel staining was performed to investigate the pathological changes and immunohistochemistry and westernWestern-blot were applied to analyze the expression and distribution of Kv1.3. Results(1) The EEG of rats in control groups showed α wave with uniform amplitude，while the EEG in rats subjected to pilocarpine injection showed slow waves and spike waves with irregular amplitude and rhythm. Sustained spike waves were observed during SE. (2) Nissl’s staining showed that 6 h after SE，the neural morphology of hippocampi in experiment groups was as the same to that in control groups. There was no change in neuronal morphology and numbers. However，1 d after SE，the structure of hippocampi was discrete and the number of neurons was decreased. 2 days and 3 days after SE，the number of neurons in hippocampi decreased further. Swelling and deformation of neurons were seen. Nissl bodies emerged，decreased or even disappeared. (3)The expression of Kv1.3 were significantly decreased in CA3and CA1region 2 d after SE as compared to control group (P<0.05). There was no difference in the expression of Kv1.3 in CA3and CA1 region between experiment groups and control groups 6 h，1 d or 3 d after SE (P>0.05). The expression of Kv1.3 did not show difference in DG area in experiment groups as compared to control groups at all time points examined (P>0.05). Western-blot of isloated proteins in individul brain region showed the same trend. ConclusionThe decreased expression of Kv1.3 may play a role in the epileptogenesis.

Status epilepticus；Potassium channel；Kv1.3；Hippocampus

1003-2754(2016)05-0392-05

2016-01-10

2016-03-01

國家自然科學(xué)基金(81300985)，遼寧省自然科學(xué)基金(201501821)，大連市衛(wèi)生計(jì)生委計(jì)劃項(xiàng)目

(大連市中心醫(yī)院，遼寧 大連 116033)

李深，E-mail：listenlishen@hotmail.com

R742.1

A