紅葡萄酒呈澀物質的化學分析

馬 婧，袁春龍，楊 麗，馬 濤，蘇鵬飛，閆小宇（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

紅葡萄酒呈澀物質的化學分析

馬 婧，袁春龍*，楊 麗，馬 濤，蘇鵬飛，閆小宇
（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

利用明膠指數法、卵清蛋白沉淀法、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、福林-肖卡法、蛋白沉淀法測定24 個紅葡萄酒酒樣中呈澀物質的含量，并與感官評價的澀感強度進行對比分析。結果表明，蛋白沉淀測定單寧的方法與感官評價結果的澀感強度相關性最好，且該方法操作簡單，適合在酒廠進行推廣。

紅葡萄酒；澀感強度；評價；呈澀物質

單寧所產生的澀感，構成了葡萄酒的“骨架”，或者被稱之為“酒體”[1]。澀感指口腔中的干燥和起皺的感覺，是干紅葡萄酒很重要的特征之一[2-6]。葡萄酒單寧的質量由口感的最大強度、達到最大強度所需的時間[7]，以及口腔中干燥感和粗糙感的延續(xù)時間所決定[1,8-9]。當葡萄酒的澀感與其他口感如酒精體積分數和含糖量相平衡的時候，可以被認為是愉悅的。與含糖量相比，如果葡萄酒中的單寧和酸度較高的話，這個葡萄酒被認為是“粗糙的、不成熟的、生青的”；與此相反，如果含糖量較高的話，葡萄酒會被認為是“單薄的、松散的”[10]。澀感影響著葡萄酒的質量，因此對于葡萄酒中澀味化合物的結構以及不同結構對感官品質的影響方面的研究對釀酒是很重要的[11]。

在最近的研究中，國外的學者采用了不同的化學方法分析葡萄酒中的呈澀物質[3,12-13]。明膠指數（gelatin index，GI）法是最早的方法[14-15]，利用明膠的蛋白質特性，來模擬口腔中的唾液蛋白。其與葡萄酒中的單寧結合，通過檢測反應前后酒樣中單寧濃度的變化，來間接反映葡萄酒的澀感。與GI法相比，卵清蛋白沉淀法所選用蛋白的特異性有著明顯的提高[16]。卵清蛋白是一種糖蛋白，含有微量的磷，是卵清中蛋白質的主要成分。其和唾液相似，都富含脯氨酸。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法，是根據蛋白分子質量不同對蛋白多肽進行分離，蛋白在穩(wěn)定的環(huán)境中按其分子質量的大小移動。根據文獻[17-18]，對葡萄酒澀感起主要作用的蛋白是富脯氨酸蛋白和α-淀粉酶，這2 類蛋白的大小分別在15 kD和62～59 kD附近，在早期研究中，常用這2 種蛋白代表全部的人類唾液蛋白，可見其重要性。通過電泳結果，比較這2 種蛋白的含量變化，間接反映酒樣的澀感。此外，通過測量酒樣中單寧和總酚的含量，也可以反映酒樣的澀感強度[19]。

對于不同的化學分析方法，哪種或哪些方法的測量結果與真實口腔中的澀感強度更為一致，目前還沒有一個明確的結論。因此，本實驗采用不同的化學分析方法，對干紅葡萄酒樣中呈澀物質的含量進行測定，并比較與感官評價小組評價結果之間的聯系和差異，從而篩選出一種或幾種科學客觀的方法，不僅為后續(xù)研究提供理論基礎，還具有一定的生產實踐推廣意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從山西戎子酒莊、昌黎朗格思酒莊、寧夏西夏王酒莊、寧夏御馬酒莊和內蒙古漢森酒莊，共選擇了24 個酒樣，具體年份和品種如表1所示。

表1 酒樣列表Table 1 List of wine samples

商業(yè)單寧 意大利Laffort公司；卵清蛋白、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma-Aldrich公司；明膠 天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop ND1000超微量分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；UV-2450紫外-可見分光光度計日本島津公司；KH-250DE型數控超聲波清洗器 昆山合創(chuàng)超聲儀器有限公司；DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、SDS-PAGE mini gel電泳槽 北京六一儀器公司；SYNGENE G∶BOX凝膠成像系統(tǒng) 英國基因有限公司。1.3 方法

1.3.1 模擬酒的配制

模擬酒溶液中含有體積分數12%乙醇溶液和4 g/L酒石酸溶液，并用1 mol/L NaOH溶液將pH值調至3.6。在真空條件下，用0.45 μm濾膜過濾。在配制好的模擬酒中按所需質量濃度加入單寧[20]。

1.3.2 GI法

用錐形瓶取25 mL酒樣，加入2.5 mL 35 g/L明膠溶液，用蒸餾水作對照。3 d后，將酒樣用10 000×g離心10 min，取上清液測量單寧含量。GI用參加明膠蛋白沉淀反應的單寧含量用兒茶素（catechin equivalent，CE）當量（mg/mL CE）表示[15]。

1.3.3 卵清蛋白沉淀法（卵清蛋白指數）

標準曲線的制作：配制不同質量濃度（0.0～4.0 g/L）的卵清蛋白溶液，在該質量濃度范圍內平均設置8 個梯度。分別配制單寧質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的模擬酒，所添加的單寧為商業(yè)單寧。取同一質量濃度的模擬酒750 μL，置于1.5 mL離心管中，分別加入750 μL不同質量濃度梯度的卵清蛋白溶液。將離心管振蕩10 min后，用11 700×g離心10 min。將上清液稀釋適當倍數，用NanoDrop分光光度計在波長280 nm處測量吸光度，根據單寧質量濃度和吸光度擬合出曲線y =－alnx＋b。根據不同單寧質量濃度和所得到的曲線方程的a值，得到標準曲線y＝kx＋c。

酒樣的測定：同標準曲線中的處理方法，得到對數曲線后，將a值帶入標準曲線，得到對應的單寧含量，用（mg/mL單寧）表示[16]。

1.3.4 總酚含量測定

采用福林肖-卡法測總酚[21]，結果用沒食子酸（gallic acid equivalent，GAE）當量（mg/mL GAE）表示。

1.3.5 單寧含量測定

用蛋白沉淀法[22]測單寧含量。

1.3.6 SDS-PAGE

1.3.6.1 人體唾液（human saliva，HS）的收集

由于不同個體間唾液蛋白的差異，典型的HS為不同個體的混合物。選取6 名（3 男3 女）不吸煙的志愿者，于上午10～11時收集唾液，且前2 h不能進食。將唾液收集于冰凍過的大離心管內，混合后于10 000×g離心10 min除去不溶物質，所得的上清液即為人類全唾液。并將樣品以500 μL小體積分裝于－20 ℃保存。

1.3.6.2 結合實驗

結合反應前，酒樣用模擬酒體積比1∶2稀釋?；旌衔铮ㄗ罱K體積150 μL）包括100 μL唾液和50 μL酒樣。結合過程在離心管中進行，反應時間為5 min，反應溫度為37 ℃。將混合物于10 000×g離心10 min，取上清液進行分析。做2 個重復。

1.3.6.3 電泳實驗

每個樣品做2 個重復電泳。利用SYNGENE G∶BOX凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析，利用軟件Quantity One，Version 4.5（Bio-Rad）進行數據分析。

1.3.6.4 唾液蛋白沉降指數（saliva precipitation index，SPI）計算

根據62～59 kD和15 kD 2 個條帶的光密度減少值來計算SPI[20]。

1.3.7 感官評價

1.3.7.1 評價小組培訓

招募感官評價小組志愿者，并根據其感官能力、興趣進行選拔。小組人員通過每次1 h、共計10 次的培訓過程，熟悉測試樣品和過程。培訓內容包括澀感的相關理論知識，再分別利用3.0 g/L單寧、0.1 g/L奎寧和4.0 g/L酒石酸溶液來辨別澀感與苦味和酸味之間的區(qū)別。并且分別在水溶液加入不同的混合物（酸、甜、苦、澀）要求成員進行辨別。之后，利用線性標度法（即在一條100 mm的帶刻度線段上，規(guī)定不添加物質的溶液強度為最小值0、5.0 g/L單寧酸溶液強度為最大值10.0，根據品嘗感受標出強度，根據所標記值定義強度大小，精確到0.1），對成員進行澀感強度的排序訓練。對質量濃度范圍為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的單寧模擬酒溶液進行反復定位。培訓環(huán)境為室溫（18±2）℃，小組成員將全部酒樣（10 mL）倒入口腔，保持8 s后吐出，等待約4 min后根據感受標記澀感強度。之后用去離子水清潔口腔2 次，并咀嚼蘇打餅干使味覺得到恢復，且在對下一酒樣進行評價前至少等待30 s。每個酒樣的評價在5 min內完成，感受到的最大強度即為澀感。所得的數據用于評價小組成員的可靠性和一致性，對相同樣品的評價置信水平大于95%（P＜0.05）。

1.3.7.2 酒樣評價

利用上述質量濃度的標準溶液作為參照。在室溫條件下（18±2）℃，每次評價4 個酒樣（10 mL），每個酒樣做2 個重復，樣品隨機編號，感官評價環(huán)節(jié)與培訓環(huán)節(jié)的過程相同。

2 結果與分析

2.1 酒樣的呈澀物質含量和澀感的感官評價

分別利用上述5 種化學方法對24 個酒樣呈澀物質的含量進行測定。同時對組建好的感官評價小組進行培訓，達到要求之后（P＜0.05），對同酒樣評價其澀感強度。將結果進行匯總，如表2所示。

結果表明，所用的2 4 個酒樣的G I范圍為0.016～0.236 mg/mL CE，酒樣2的測定結果最小，酒樣10的測定結果最大；卵清蛋白指數的范圍為0.151～0.773 mg/mL單寧，酒樣8的測定結果最小，酒樣6的測定結果最大；總酚含量的范圍為1.237～3.551 mg/mL GAE，酒樣5的測定結果最小，酒樣19的測定結果最大；單寧含量的范圍為0.038～0.208 mg/mL CE，酒樣2的測定結果最小，酒樣10的測定結果最大；SPI范圍為12.044～78.249，酒樣5的測定結果最小，酒樣10的測定結果最大。感官評價小組的評價結果中，澀感強度范圍為4.0～7.0，酒樣1的評價 結果最小，酒樣3的評價結果最大。

表2 化學測定及感官評價結果Table 2 Results of chemical measurement and sensory perception

2.2 呈澀物質含量與澀感的關系

2.2.1 GI與澀感的關系

圖1 GI與澀感強度的相關性Fig.1 Relationship between GI and astringency intensity

由圖1可以看出，GI與澀感的相關性較好，相關系數r為0.761 7，基本呈線性關系。所選酒樣的澀感強度位于4.0～7.0之間，在該澀感范圍內，GI可以較好地反映澀感。

2.2.2 卵清蛋白指數與澀感的關系

圖2 卵清蛋白指數與澀感強度的相關性Fig.2 Relationship between ovalbumin index and astringency intensity

從圖2可以看出，除點（0.462，6.4）、（0.536，6.4）、（0.773，6.5）外，卵清蛋白指數可以較好地反映酒樣的澀感強度。但是區(qū)分度不是很好，表現在圖中的結果是點的分布過于密集，數據的離散型不好，線性關系不夠明顯（R2＝0.456），導致如果僅從數據結果分析，不同酒樣間差異的顯著性會降低。

2.2.3 單寧含量與澀感的關系

圖3 單寧含量與澀感強度的相關性Fig.3 Relationship between tannin content and astringency intensity

從圖3可以看出，與GI和卵清蛋白指數相比，單寧含量可以更好地反映酒樣的澀感強度。所測得的單寧含量在0.038～0.208 mg/mL CE離散分布，且與澀感的相關度很好r為0.835 3。

2.2.4 總酚含量與澀感的關系

圖4 總酚含量與澀感強度的相關性Fig.4 Relationship between total polyphenol content and astringency intensity

由圖4可知，與單寧相比，總酚含量和澀感之間雖然存在一定的線性關系，但是相關性較弱r為0.550。不同的酒樣所得的總酚含量相近，但在實際感官評價中澀感差異還是較為明顯的，如點（0.209 7，5.0）、（0.219 0，6.4）二者總酚含量相近，但是澀感強度的差異較大。

2.2.5 SPI與澀感的關系

圖5 SPI與澀感強度的相關性Fig.5 Relationship between SPI and astringency intensity

從圖5可以看出，SPI值與澀感間存在一定的線性關系，可以較好地反映澀感的強弱r為0.641 6。酒樣的澀感范圍為4.0～7.0，該主觀實驗所設置的澀感強度范圍為0～10；其對應的SPI變化范圍為12.044～78.249，而SPI的理論范圍為0～100?？梢钥闯鯯PI可以放大酒樣之間的差異，能更為直觀地區(qū)別不同酒樣。

綜合以上圖表可以看出，在對葡萄酒樣的測定中，不同的化學分析方法間r（總酚含量）＜r（卵清蛋白指數）＜r（SPI）＜r（GI）＜r（單寧含量）?？偡邮侵钙咸丫浦懈鞣N酚類物質的總和，而不同的酚類物質，如一些小分子的酚酸類化合物和大分子的單寧，通過品嘗不同的酚類物質化合物的溶液可以發(fā)現，其澀感強度是有顯著差別的。因此僅僅用總酚的含量來表征葡萄酒澀感是片面的。卵清蛋白指數的結果集中度較高，測定結果大部分集中在0.151～0.462 mg/mL單寧。該方法與總酚含量的測定類似，其測量值為波長280 nm的吸光度，波長280 nm為酚類物質的特征吸收峰。此方法的核心，是通過酚類物質的含量來反映澀感的強度，因此該方法與總酚含量測定法存在同樣的弊端。SPI的測定擺脫較為傳統(tǒng)的比色法，采用凝膠色譜的光密度分析，通過模擬葡萄酒樣在口腔中反應前后蛋白質的含量變化，來間接衡量酒樣的澀感。該方法對于傳統(tǒng)的比色法，在測定方法上是一種創(chuàng)新。與其他比色法相比，電泳法的操作相對要復雜很多，因此所得的自然誤差會比其他方法大。此外電泳法屬于分子實驗方法，對操作的準確度和儀器的精密度要求也相對較高。GI和單寧法從根本上而言，都是依賴于對葡萄酒樣中單寧含量的測定，而單寧是葡萄酒中主要的呈澀物質。因此與其他方法相比，蛋白沉淀測單寧法的準確度較高。

2.3 不同化學測定方法間的對比

根據葡萄酒樣利用不同化學測定方法所得到的數據，對比不同方法間的相關性。在5 種測定方法中，兩兩之間進行比較，所得到的線性關系如圖6所示。

圖6 不同化學測定方法間的相關性Fig.6 Relationships among different chemical methods

由圖6可知，不同測定方法之間的相關性r（總酚含量/卵清蛋白指數）＜r（卵清蛋白指數/SPI）＜r（卵清蛋白指數/GI）＜r（單寧含量/SPI）＜r（單寧含量/卵清蛋白指數）＜r（GI/SPI）＜r（總酚含量/SPI）＜r（單寧含量/總酚含量）＜r（總酚含量/GI）＜r（單寧含量/GI）。

從相關性的結果可以看出，2 個方法間的原理越相近，所得到結果的相關性也會越高。如單寧含量/總酚含量、總酚含量/GI、單寧含量/GI三對方法中兩兩間的相關性均大于0.78，而這3 種方法的本質都是將某一類特定的物質（酚類或者單寧）與一種特殊的物質發(fā)生結合反應，并能在特定的波長處產生吸收峰，從而實現對該類物質的定量分析。

卵清蛋白指數與其他方法間的相關性最弱。雖然本質上卵清蛋白指數也是比色法，但是與傳統(tǒng)的比色法原理不同的是，利用不同量的卵清蛋白與酒樣中的單寧類物質反應，從酚類物質總量的減少趨勢來判斷酒樣中單寧物質的多少。其中缺乏對特定物質的定量過程，犧牲了精確性獲得了操作上的簡易性。

SPI與其他方法相比，具有一定的相關性，0.57＜r（SPI/其他方法）＜0.79。該結果也表明，SPI具有一定的可靠性，除去使用傳統(tǒng)的比色法，利用色譜法也能對葡萄酒里的單寧含量進行定量分析，從而表征葡萄酒的澀感強度。

3 討 論

澀感對葡萄酒的質量有著非常重要的影響，因此近年來關于呈澀物質的研究一直很多，學者們都試圖找出一種可以替代感官評價的方法。根據測量方法的不同，大概可以分為以下幾類：分光光度法、濁度法、黏度法、光譜法、電泳法等。

GI法是最早化學測定方法，最近的研究也證明GI能較好地表征葡萄酒的澀感R2為0.563[15]，這與本實驗得到的結果R2為0.580 2是相近的。證明GI法是一種穩(wěn)定的化學測定方法，該方法的再現性很好。在該研究中，同時比較了總酚含量表征澀感的方法R2為0.684，這與本實驗所得到的結果R2為0.308仍有一定的差距。利用酚類物質的總量表征澀感強度，不同酒樣中酚類物質的構成不同，而不同酚類物質的澀感強度是不一樣的，這可能是造成本實驗結果與其他研究者結果存在差異的原因?？偡雍坎⒉皇且粋€較好地表征澀感強度的數據。

卵清蛋白指數法被提出之后，鮮有應用該方法的其他研究。與該方法的作者所得出的結論r（卵清蛋白指數/澀感強度）=0.773 7，本實驗所得出的結論r（卵清蛋白指數/澀感強度）=0.675 3相對較低，與GI法相比，該方法的再現性一般[16]。

SDS-PAGE法是一個比較新穎的表征澀感強度的方法，本實驗所得到的結果r為0.641 6與先前的研究所得到的結果r為0.984相比，存在一定的差異[20]。在同等條件下此方法的的再現性不好，且對實驗操作方面擁有著較高的要求，整個實驗流程需要較長的時間。該方法適合資源水平相對較高的實驗室使用，而對于需要快速給出實驗結果釀酒基地，該方法不適合推廣。

之前也有一些研究對于不同的呈澀物質化學測定方法做出了比較，利用測定波長280 nm處吸光度、凝膠色譜法以及蛋白沉淀單寧法測定了不同的美樂和西拉葡萄酒的呈澀物質含量，結果表明蛋白沉淀法與其他兩者相比，與澀感之間有著更好的相關度[23]，這和本實驗的研究結果是一致的。蛋白沉淀法與其他的吸光度法相比，所測得的單寧含量較低，但是在與澀感的相關性研究方面，均表明該方法能很好地反映葡萄酒的澀感強度[24]。

4 結 論

對24 個不同葡萄酒成品酒樣，分別利用5 種不同化學方法測定其呈澀物質含量，并將結果與感官評價的結果進行比較。結果表明不同的化學方法與主觀評價的澀感間的相關系數r（總酚含量）＜r（卵清蛋白指數）＜r（SPI）＜r（GI）＜r（單寧含量），說明蛋白沉淀法能較好地反映葡萄酒中的澀感強度。蛋白沉淀法操作簡單，對儀器以及操作技能要求較低，適合在葡萄酒生產車間進行推廣，雖然不能完全替代感官評價，但對于表征葡萄酒的澀感有很好的參考價值。

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Comparative Evaluation of Chemical Methods for Analyzing Astringent Taste Compounds of Red Wine

MA Jing, YUAN Chunlong*, YANG Li, MA Tao, SU Pengfei, YAN Xiaoyu
(College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

A total of 24 red wine samples were analyzed by gelatin index, ovalbumin index, sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), Folin-Ciocalteau, and protein precipitation methods, respectively. The results obtained with these methods were compared with the perceived astringency. The protein precipitation assay showed a strong correlation with the perceived astringency, which was convenient and suitable for extensive applications in wineries. Key words: red wine; astringency intensity; evaluation; astringent taste compound

10.7506/spkx1002-6630-201604024

TS262.6

A

1002-6630（2016）04-0132-07

馬婧, 袁春龍, 楊麗, 等. 紅葡萄酒呈澀物質的化學分析[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 132-138. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604024. http://www.spkx.net.cn

MA Jing, YUAN Chunlong, YANG Li, et al. Comparative evaluation of chemical methods for analyzing astringent taste compounds of red wine[J]. Food Science, 2016, 37(4): 132-138. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604024. http://www.spkx.net.cn

2015-05-13

陜西省農業(yè)攻關項目（2015NY131）；西北農林科技大學科技創(chuàng)新重點項目（Z109021301）

馬婧（1989—），女，碩士研究生，研究方向為葡萄酒化學。E-mail：celia-89@163.com

*通信作者：袁春龍（1969—），男，副教授，博士，研究方向為葡萄酒化學。E-mail：yuanchl69@nwsuaf.edu.cn