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    Lactobacillusfermentum Zhao的小鼠抗皮膚老化效果

    2016-11-11 11:22:04周小芳易若琨
    重慶第二師范學院學報 2016年5期
    關鍵詞:灌胃乳酸菌老化

    周小芳,易若琨,趙 欣

    (重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067)

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    LactobacillusfermentumZhao的小鼠抗皮膚老化效果

    周小芳,易若琨,趙欣

    (重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067)

    本文對LactobacillusfermentumZhao(LF-Zhao)的抗老化效果進行研究。體外抗氧化實驗結果顯示 LF-Zhao具有較強的DPPH自由基和·OH清除能力。進一步的動物實驗表明,LF-Zhao可以提高D-半乳糖誘導氧化小鼠血清和皮膚組織中的SOD、GSH-Px水平和降低NO、MDA水平,且隨著LF-Zhao濃度的增加效果更為明顯。通過RT-PCR實驗分析小鼠皮膚組織發(fā)現(xiàn),LF-Zhao能上調氧化小鼠皮膚的nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT mRNA表達和下調iNOS表達,高濃度的LF-Zhao使以上表達最接近正常組小鼠。通過這些結果可以得出LF-Zhao具有良好的皮膚抗老化作用。

    牦牛酸乳;Lactobacillus fermentum Zhao;氧化;老化;小鼠

    牦牛是分布在我國青藏高原地區(qū)的一種特有畜牧資源,其中牦牛酸乳中含有豐富的營養(yǎng)物質,發(fā)酵過程中產生的活性物質和發(fā)酵中的菌群都對牦牛酸乳保健效果產生影響。特別是牦牛酸乳中的乳酸菌群種類主要受各地區(qū)牧民生活習慣,擠奶及發(fā)酵的器具,發(fā)酵溫度、時間等因素的影響,故從牧區(qū)的牦牛酸乳分離出的乳酸菌與常用的商業(yè)乳酸菌有很大區(qū)別[1]。目前有大量的研究表明,乳酸菌在食品行業(yè)中具有很廣泛的作用,現(xiàn)已被應用在發(fā)酵等食品工業(yè)相關領域[2-5],但我國工業(yè)中生產發(fā)酵乳制品所用的絕大部分乳酸菌均來自國外,因此國內學者已經開始對青海、西藏和甘肅等地區(qū)牦牛發(fā)酵乳中含有的微生物進行了分離、鑒定,旨在發(fā)現(xiàn)具有我國自主知識產權的、保健功能顯著的乳酸菌[6-8]。

    研究表明乳酸菌對人體有較多的益處,可以促進營養(yǎng)物質的吸收[9];改善人體胃腸道功能,抑制腐敗菌的繁殖,清除腸道垃圾[10];增強人體免疫力和抵抗力;消除人體內自由基,具有抗衰老的作用[11]。進一步的研究表明乳酸菌有較強的抗氧化作用,對于控制氧化導致的機體異常具有一定的幫助[12]。本研究團隊對藏區(qū)牦牛酸乳進行了初步研究,分離鑒定出具有知識產權的乳酸菌菌株。通過動物實驗對已鑒定的牦牛酸乳分離乳酸菌LactobacillusfermentumZhao的皮膚老化預防效果進行了研究,實驗結果為食品和保健品行業(yè)進一步利用LactobacillusfermentumZhao積累了理論依據。

    一、材料與方法

    (一)材料與試劑

    菌株:乳酸菌LactobacillusfermentumZhao(LF-Zhao)分離自四川紅原縣自然發(fā)酵的牦牛酸乳(中國典型培養(yǎng)物保藏中心菌種保藏號:M2013513)。

    DPPH試劑,上海金穗生物科技有限公司;NO、SOD、GSH-Px、MDA試劑盒,南京建成生物工程研究所;EDTA,Sigma公司,美國;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒,Becton Dickinson公司,德國;Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV,Invitrogen公司,美國;RT-PCR引物nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT,天根生化科技有限公司;其余試劑均為國產分析純。

    (二)實驗動物

    雄性SPF級KM小鼠40 只(體重20~25 g),購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證號:SYXK(渝)2012-0001)。

    (三)儀器與設備

    LD2X-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋,江西華科精密儀器有限公司;PYX-DHS-50X65BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海百典儀器設備有限公司; UV9600紫外分光光度計,北京北分瑞利分析儀器(集團)公司;Bio-Rad小型水平電泳槽,Bio-Rad公司,美國 ABI 2720 PCR儀, 美國Applied Biosystems公司。

    (四)方法

    1. DPPH自由基清除能力的測定

    將4mL的LF-Zhao菌液(濃度為1.0×107、1.0×108CFU/mL)和1mL的DPPH(1.5×10-4M)試劑混合后室溫放置30min,最后在517nm處讀得吸光度,計算得到DPPH 自由基清除能力[13]。

    2. ·OH清除能力的測定

    配制測定反應體系(1.4mL),包含0.2mL的LF-Zhao菌液(濃度為1.0×107、1.0×108CFU/mL),脫氧核糖(6mM,0.2mL),0.2mL的磷酸鈉緩沖液(20mM,pH 7.4),0.2mL無水氯化鐵(FeCl3,400μM),0.2mL的硫酸亞鐵-乙二胺四乙酸(EDTA,400μM),0.2mL的H2O2(3mM)和0.2mL抗壞血酸(400μM)。在37℃水浴中保溫60min后,在反應體系液中加入1mL的三氯乙酸和1mL的硫代巴比妥酸后,在90℃水浴中加熱20min。最后在532nm處測定吸光度測后計算·OH清除能力[13]。

    3. 動物抗老化實驗

    KM小鼠喂養(yǎng)1周適應環(huán)境后平均分為4組,分別是正常組、老化對照組、LF-Zhao低濃度組和LF-Zhao高濃度組,每組10只小鼠。正常組除外其余3組每只小鼠每日按濃度120mg/kg腹腔注射D-半乳糖,持續(xù)6周。注射D-半乳糖的同時,LF-Zhao低濃度組(1.0×107CFU/mL)和LF-Zhao高濃度組(1.0×108CFU/mL)小鼠每日灌胃0.2mL的LF-Zhao,同樣持續(xù)6周。6周后對小鼠實施絕食24h后乙醚處死小鼠并解剖,心臟取血,皮膚組織待用[13]。

    4. 血清和皮膚組織NO、SOD、GSH-Px和MDA含量測定

    將取得的血漿在4000rpm下離心分離10min后取上層血清,按試劑盒說明書測定小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA的含量。將小鼠皮膚組織制成10%的勻漿后在4000rpm下離心分離10min,取上清液按試劑盒說明書測定皮膚組織指標。

    5. RT-PCR實驗分析皮膚組織

    用RNAzol 試劑提取皮膚組織中的總RNA,然后將其濃度稀釋到1μg/μL。在RNA 提取液(2μL)中按次序加入1μL的 oligodT18,RNase, dNTP 和MLV 酶,10μL的5×buffer,然后合成cDNA(37℃ 120 min,99℃ 4min,4℃ 3 min)。然后以反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達,同時GAPDH(持家基因)作為內參照同樣進行擴增。最后以瓊脂(含1%濃度溴化乙錠)電泳檢查PCR擴增產物,并用Image1.44軟件定量分析表達強度[13]。

    (五)數據統(tǒng)計

    所有的實驗均進行3 次平行實驗,然后使用SAS9.1 統(tǒng)計軟件采用one-way ANOVA 分析方法分析各組數據在p<0.05 水平上是否具有顯著差異。

    二、 結果與分析

    (一)LF-Zhao的體外抗氧化效果

    通過預實驗發(fā)現(xiàn)LF-Zhao的抗氧化效果在濃度0-1.0×108CFU/mL呈現(xiàn)線性增長,因此本研究選擇濃度1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao進行體外和動物體內的抗氧化效果研究。實驗結果顯示1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao具有較強的DPPH自由基清除能力,1.0×107CFU/mL的LF-Zhao對DPPH自由基清除能力為47.5±3.8%,濃度提高到1.0×108CFU /mL時對DPPH自由基清除能力達到84.5±4.2%。同時,1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao對·OH清除能力也呈現(xiàn)出和DPPH自由基清除能力相同的趨勢,分別達到52.1±3.3%和88.6%±3.5。DPPH自由基清除能力和·OH清除能力的測定可以有效地對食品的體外抗氧化效果進行檢測[14],由本實驗的結果可以看出LF-Zhao具有很強的體外抗氧化效果,且隨著濃度的提高,抗氧化效果也隨之提高。

    (二)LF-Zhao對小鼠NO、SOD、GSH-Px和MDA含量的影響

    由表1和表2可知,灌胃LF-Zhao的小鼠血清和皮膚組織中的NO、MDA含量較僅誘導老化的老化對照組小鼠低,而SOD、GSH-Px含量更高。同時,不同濃度LF-Zhao灌胃小鼠體內的NO、SOD、GSH-Px和MDA含量也產生一定的差異,1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠血清中的NO和MDA含量顯著低于老化對照組小鼠,而SOD、GSH-Px含量顯著高于老化對照組小鼠,且1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA水平比1.0×107CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠的水平更接近正常組小鼠。LF-Zhao灌胃小鼠皮膚組織中的NO、MDA、SOD、GSH-Px含量表現(xiàn)出和血清指標相似的狀態(tài),NO和MDA的含量高于正常組,SOD和GSH-Px的含量低于正常組,高濃度的LF-Zhao能使老化皮膚中的NO、MDA、SOD、GSH-Px含量更接近正常組。一氧化氮在體內是由一氧化氮合酶(NOS)催化下產生的, 在體內各生理系統(tǒng)和組織中均有十分重要的作用,一定量的NO起到維持體內老化平衡的作用,當機體收到老化損傷時,NO在NOS的作用下大量產生,是機體失衡的表現(xiàn)[15]。本研究也得到了相似的結果,老化對照組小鼠由于氧化損傷導致NO的含量異常上升,LF-Zhao可以緩解這種異常的NO含量上升,且高濃度的LF-Zhao具有更顯著的效果,意味著LF-Zhao具有較強的動物體內抗老化效果。SOD和GSH-Px作為評價體內抗氧化的重要標準已得到證明,高含量的SOD和GSH-Px證明抗氧化效果的優(yōu)異;同時MDA是脂質過氧化的重要表現(xiàn),其含量越低證明機體收到脂質過氧化導致老化的影響越小[16]。本研究中LF-Zhao可以起到緩解氧化造成的SOD、GSH-Px含量下降和抑制MDA含量的升高,且高濃度的LF-Zhao效果最好。

    表1 不同濃度LF-Zhao灌胃小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA含量

    不同字母表示比較各組數據平均值顯著性差異(p<0.05),表2,圖1、2同。

    表2 不同濃度LF-Zhao灌胃小鼠皮膚組織中NO、SOD、GSH-Px和MDA含量

    (三)不同濃度LF-Zhao對小鼠皮膚組織中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表達的影響

    通過PT-PCR實驗結果可以看到,LF-Zhao灌胃小組小鼠皮膚組織中的nNOS、eNOS表達顯著高于老化對照組,但低于正常組,同時皮膚組織中的iNOS表達呈現(xiàn)與nNOS、eNOS表達相反的趨勢,顯著低于老化對照組(見圖1)。然而,LF-Zhao灌胃小鼠的nNOS、eNOS表達顯著高于老化對照組小鼠,1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠的nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表達比1.0×107CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠更為接近正常組小鼠。體內的NO失衡是機體損傷的標志之一,NO在體內是由NOS催化產生的,其中iNOS在正常情況下不表達,機體氧化損傷后,iNOS大量轉化成NO,使機體氧化損傷加重;nNOS和eNOS在機體多個組織中均體現(xiàn)出氧化受損后下降的趨勢,可見nNOS、eNOS表達減弱,iNOS表達增強是氧化損傷的重要體現(xiàn)[17]。

    圖1 Lactobacillus fermentum Zhao灌胃小鼠皮膚組織中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表達水平

    (四)不同濃度LF-Zhao對小鼠皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達的影響

    實驗結果顯示LF-Zhao灌胃可以顯著提高老化損傷小鼠皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達(見圖2),起到抗老化的作用,且高濃度的LF-Zhao的效果更為優(yōu)異,其皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的表達強度更為接近正常組小鼠。SOD在動物體內有三種異構體,Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和EC-SOD,體內的Mn-SOD和Gu/Zn-SOD水平過低會導致自由基的大量產生,對機體造成老化損傷。CAT作為生物防御體系中的關鍵酶之一,能清除氧自由基和促進過氧化氫分解,從而避免氧化對體內細胞的老化損傷[18]。

    圖2 Lactobacillus fermentum Zhao灌胃小鼠皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達水平

    三、結語

    本研究對不同濃度的LF-Zhao的抗老化效果進行研究,通過體外和動物體內實驗證明LF-Zhao具有顯著的抗老化效果。不同濃度的LF-Zhao均能夠清除DPPH自由基和·OH。動物實驗也證明受到D-半乳糖誘導老化的小鼠在灌胃LF-Zhao后體內NO和MDA含量下降,SOD和GSH-Px含量上升。進一步通過RT-PCR實驗觀察小鼠肝組織中mRNA表達的變化發(fā)現(xiàn),LF-Zhao可以上調氧化損傷小鼠的nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT表達和下調iNOS表達。根據這些結果可以得出結論:LF-Zhao可以產生較好的抗老化效果。

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    [責任編輯劉江南]

    2016-04-11

    重慶第二師范學院學生科研項目(2014036)

    周小芳(1993— ),女,在讀本科生,研究方向:功能性食品;通信作者:趙欣(1981—),男,教授,理學博士,研究方向:功能性食品。

    TS201.4

    A

    1008-6390(2016)05-0160-04

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