薄層色譜法對(duì)宮衣凈酊成分的定性鑒別

朱永剛，王 磊，王旭榮，崔東安，張景艷，張 凱，張 康，李建喜，楊志強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050)

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薄層色譜法對(duì)宮衣凈酊成分的定性鑒別

朱永剛，王 磊，王旭榮，崔東安，張景艷，張 凱，張 康，李建喜，楊志強(qiáng)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050)

[目的]建立治療奶牛胎衣不下的中獸藥宮衣凈酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。[方法]采用薄層色譜(TLC)法對(duì)該酊劑中的中藥材進(jìn)行定性鑒別，確定該酊劑中葛根、紅花、急性子和川牛膝的薄層鑒別方法。[結(jié)果]在選定的色譜條件下，色譜斑點(diǎn)分離較好，該鑒別方法能夠有效鑒別葛根、紅花和急性子。[結(jié)論]該試驗(yàn)中所建立的TLC方法簡(jiǎn)單、易操作、專一性強(qiáng)、重復(fù)性好，可為宮衣酊劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

宮衣凈酊；薄層色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

近年來，隨著畜禽養(yǎng)殖的規(guī)模化和集約化發(fā)展，抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，由于抗生素的不合理使用，由此帶來的細(xì)菌耐藥性、動(dòng)物衛(wèi)生安全問題及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注[1-2]。中獸藥由于其獨(dú)特的藥理學(xué)作用，且具有低毒、低殘留和不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在抗菌抗病毒的同時(shí)，還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力，在動(dòng)物疾病的預(yù)防、治療和保健領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3-4]。宮衣凈酊是由葛根、急性子、紅花、川牛膝等中藥組成，是采用中獸醫(yī)群體辯證的觀點(diǎn)，通過藥材加減并經(jīng)過臨床的療效試驗(yàn)后研制而成、采用滲漉的方法制備而成的酊劑，其臨床功效主要包括活血化瘀、促進(jìn)胎衣排出、凈化子宮、加快產(chǎn)后子宮復(fù)舊、促進(jìn)產(chǎn)后繁殖性能的恢復(fù)[5]。謝家聲等[6]研究表明宮衣凈酊具有治療奶牛胎衣不下的效果，治愈率為85.7%。薄層色譜法(TLC)是一種最簡(jiǎn)單的色譜分離技術(shù)，因其具有操作簡(jiǎn)單、分離效率高、設(shè)備簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、分析快速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥物分析中，特別是復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒定，因此對(duì)該復(fù)方酊劑進(jìn)行薄層鑒別可以為其提供質(zhì)量控制依據(jù)[7-9]。為了有效控制宮衣凈酊中葛根、急性子和紅花的質(zhì)量，保證其臨床中的療效，筆者采用薄層色譜法對(duì)宮衣凈酊中葛根、急性子、紅花和川牛膝進(jìn)行定性鑒別。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。賽多利斯分析天平(ALC110.4)；電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器公司)；超聲波清洗儀(型號(hào)KQ250，為上海昆山超聲波儀器公司產(chǎn)品)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA，為上海愛朗儀器公司產(chǎn)品)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A)；全自動(dòng)薄層色譜點(diǎn)樣儀(型號(hào)SP-20E，為上海科哲生化科技有限公司產(chǎn)品)。

1.1.2藥品與試劑。宮衣凈酊樣品，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)研究室研制，200 mL/瓶；葛根藥材、紅花藥材、急性子藥材、川牛膝藥材，均購自蘭州黃河藥材市場(chǎng)；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110752-201313，由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供)；急性子對(duì)照藥材(批號(hào)121628-201001，由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供)；紅花對(duì)照藥材(批號(hào)120907-201111，由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供)；杯莧甾酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)111804-201303)。硅膠G板和H板(10 cm×20 cm)，均購自青島海洋化工有限公司；其余試劑均為分析純；超純水。

1.2方法

1.2.1急性子的薄層鑒別。 取宮衣凈酊溶液 10 mL，蒸干，用 5 mL 純化水充分溶解，用 10 mL 石油醚(60～90 ℃)萃取1次，棄去石油醚層，水層分別用20、20、10 mL水飽和正丁醇萃取 3 次，合并正丁醇層液體，蒸干，用 2 mL 80%丙酮溶解，作為供試樣品溶液。按照處方稱取除急性子以外的藥材，配制陰性對(duì)照溶液。稱取急性子對(duì)照藥材 4.0 g，加熱回流 1 h，棄去丙酮液，藥渣揮干，加入水飽和正丁醇 40 mL，超聲處理 30 min，過濾，將濾液蒸干，在殘?jiān)屑尤爰状?2 mL使其溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各 2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10.0∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，應(yīng)在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)[6]。

1.2.2紅花的薄層鑒別。 取宮衣凈酊溶液 10 mL，蒸干，用 5 mL 純化水充分溶解，用 10 mL 石油醚(60～90 ℃)萃取1次，棄去石油醚層，水層分別用20、20、10 mL水飽和正丁醇萃取 3 次，合并正丁醇層液體，蒸干，用 2 mL 80%丙酮溶解，作為供試樣品溶液。按照處方稱取除紅花外的藥材，配制陰性對(duì)照溶液。稱取紅花藥材粉末 0.5 g，加入80%丙酮溶液 5 mL，密塞，振搖 15 min，靜置，取上清液作為供試品溶液。另外稱取紅花對(duì)照藥材 0.5 g，按照相同方法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述樣品2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 H 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，應(yīng)在于對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.2.3葛根的薄層鑒別。 取宮衣凈酊溶液 10 mL，蒸至無醇味，加入純化水稀釋，用 20 mL 三氯甲烷萃取，棄去三氯甲烷層，水層液體用20、20、10 mL水飽和正丁醇萃取 3 次，取正丁醇液蒸干，用純甲醇溶解至 2 mL，作為供試品溶液。按照處方取除葛根外的所有藥材，配制陰性對(duì)照溶液。稱取葛根對(duì)照藥材粉末 0.8 g，加入甲醇 10 mL，放置 2 h，過濾，濾液蒸干，在殘?jiān)屑尤爰状?1 mL 使其溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取葛根素對(duì)照品，加入甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各 2 μL，其他樣品溶液各 1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，應(yīng)在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.2.4川牛膝的薄層鑒定。取“宮衣凈酊”樣品溶液 20 mL，濃縮至約 2 mL，添加于中性氧化鋁柱(100～200 目，2.0 g，內(nèi)徑 15 mm)上，用甲醇-乙酸乙酯(1∶1)40 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，在殘?jiān)屑尤爰状?2 mL使其溶解，作為供試品。按照處方稱取除葛根外的藥材，配制陰性對(duì)照溶液。另取川牛膝對(duì)照藥材 2 g，按照相同方法制成對(duì)照藥材溶液。再取杯莧甾酮對(duì)照品，加入甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各 2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴上 10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視。供試品色譜中，應(yīng)在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2　結(jié)果與分析

2.1急性子的薄層鑒別從圖1可以看出，3批供試品宮衣凈酊色譜中，在與急性子對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，缺急性子的陰性對(duì)照在相同位置上無相應(yīng)的斑點(diǎn)，說明陰性對(duì)照無干擾，薄層色譜法對(duì)急性子的鑒定具有專一性。

注：1.宮衣凈酊陰性樣品；2～4.宮衣凈酊樣品；5.急性子對(duì)照藥材。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture；2-4.Gongyijing tincture sample；5.Control of garden balsam seed.圖1　宮衣凈酊中急性子的TLC圖譜Fig.1　TLC of garden balsam seed in Gongyijing tincture

2.2紅花的薄層鑒別 從圖2可以看出，3批供試品宮衣凈酊色譜中，在與紅花藥材和紅花對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，缺紅花的陰性對(duì)照在相同位置上無相應(yīng)斑點(diǎn)，說明陰性對(duì)照無干擾，薄層色譜法對(duì)紅花的鑒定具有專一性。

注：1.宮衣凈酊陰性樣品;2～4.宮衣凈酊樣品;5.紅花藥材;6.紅花對(duì)照藥材。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture；2-4.Gongyijing tincture sample；5.Safflower；6.Control of safflower.圖2　宮衣凈酊中紅花的TLC圖譜Fig.2　TLC of safflower in Gongyijing tincture

2.3葛根的薄層鑒別從圖3可以看出，3批供試品宮衣凈酊色譜中，在與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品和葛根對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，缺葛根的陰性對(duì)照在相同位置上無相應(yīng)的斑點(diǎn)，說明陰性對(duì)照無干擾，薄層色譜法對(duì)葛根的鑒定具有專一性。

注：1.宮衣凈酊陰性樣品;2～4.宮衣凈酊樣品;5.葛根對(duì)照藥材;6.葛根素標(biāo)準(zhǔn)品。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture；2-4.Gongyijing tincture sample；5.Control of puerarin；6.Standard substance of puerarin.圖3　宮衣凈酊中葛根的TLC圖譜Fig.3　TLC of puerarin in Gongyijing tincture

2.4川牛膝的薄層鑒別從圖4可以看出，3批供試品宮衣凈酊色譜中，在與杯莧甾酮標(biāo)準(zhǔn)品和川牛膝對(duì)照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，缺川牛膝的陰性對(duì)照在相同位置上無相應(yīng)的斑點(diǎn)，說明陰性對(duì)照無干擾，薄層色譜法對(duì)川牛膝的鑒定具有專一性。

注：1.宮衣凈酊陰性樣品;2～4.宮衣凈酊樣品;5.川牛膝對(duì)照藥材;6.杯莧甾酮標(biāo)準(zhǔn)品。Note：1.Negative sample of Gongyijing tincture； 2-4.Gongyijing tincture sample； 5.Control of Radix Cyathulae； 6.Standard substance of Radix Cyathulae.圖4　宮衣凈酊中川牛膝的TLC圖譜Fig.4　TLC of Radix Cyathulae in Gongyijing tincture

3　討論與結(jié)論

酊劑是藥物用規(guī)定濃度乙醇提取或溶解制成的澄明液體制劑，也可用流浸膏稀釋制成。一般藥材制成濃度20 g/mL，含劇毒藥物10 g/mL。酊劑具有雜質(zhì)含量少、藥量高、服用劑量少、制備簡(jiǎn)單、易保存、不易變質(zhì)的特點(diǎn)[10]。宮衣凈酊以補(bǔ)氣益血、行滯祛瘀、利水消腫的紅花、葛根、急性子、川牛膝為主藥。該組方中紅花具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛等功效，且對(duì)子宮具有興奮作用，小劑量使用可使子宮發(fā)生節(jié)律性收縮，大劑量使用則使其收縮加強(qiáng)[11]；紅花對(duì)妊娠動(dòng)物的作用尤為明顯[12]。葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉等功效，且具有抗氧化損傷、抗細(xì)胞凋亡的作用[13]。急性子具有消積、破血、軟尖、抗菌、抗氧化等功效[10]，且具有興奮子宮平滑肌、加強(qiáng)子宮收縮的作用[14]。川牛膝具有活血祛瘀、利尿通淋、引血下行等功效[15]。通過結(jié)合以上4種中藥材的藥理特性、配伍關(guān)系及酊劑的特點(diǎn)，該中藥酊劑可用于治療奶牛胎衣不下，且臨床效果顯著。

筆者參照《中國(guó)獸藥典》中對(duì)紅花、葛根、急性子、川牛膝4味藥材的鑒別方法，通過對(duì)照品、供試品、陰性樣品色譜的比較試驗(yàn)，確定了宮衣凈酊中4味藥材的薄層鑒別方法。這4種方法專屬性強(qiáng)，制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，樣品與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯示相同的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，可作為宮衣凈酊中急性子、紅花、葛根和川牛膝的定性鑒別方法。在葛根的鑒別中，《中國(guó)獸藥典》2010年版(2部)葛根的薄層鑒定方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)分離不明顯；結(jié)合《中國(guó)藥典》2010年版(1部)中當(dāng)歸拈痛丸中的處理方法，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，說明薄層色譜方法對(duì)葛根的鑒定具有專一性。在紅花的鑒別中，參照《中國(guó)獸藥典》2010年版(1部)紅花的薄層鑒定方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的點(diǎn)分離較差，且其他成分干擾較嚴(yán)重；結(jié)合《中國(guó)藥典》2010年版(1部)中化積口服液中紅花的處理方法，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，說明薄層色譜方法對(duì)紅花的鑒別具有專一性。在急性子的鑒別中，參照《中國(guó)獸藥典》中急性子的鑒別方法試驗(yàn)，效果不明顯；參照紅花的鑒別方法，發(fā)現(xiàn)能分離對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，但分離不徹底，后對(duì)急性子的不同展開液進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷-甲醇(10.0∶0.5)為展開劑比三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(10.0∶0.5)[10]為展開劑的分離效果更好。在川牛膝的鑒別中，參照《中國(guó)獸藥典》2010年版(2部)川牛膝的薄層鑒定方法，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，說明薄層色譜方法對(duì)川牛膝的鑒別具有專一性。

宮衣酊劑為活血化瘀、促進(jìn)產(chǎn)后子宮的復(fù)舊、提高產(chǎn)后繁殖性能的新獸藥產(chǎn)品，為了保證其臨床療效，應(yīng)建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證該酊劑的質(zhì)量。該研究中采用的TLC法可以對(duì)宮衣凈酊進(jìn)行薄層鑒別，且方法簡(jiǎn)單，專一性較強(qiáng)，可以達(dá)到控制宮衣凈酊質(zhì)量的目的。

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Quanlitative Identification of Gongyijing Tincture Composition by Thin Layer Chromatography

ZHU Yong-gang, WANG Lei, WANG Xu-rong, YANG Zhi-qiang*et al

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS, Engineering & Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province, Lanzhou, Gansu 730050)

[Objective] To establish quality standards of Gongyijing tincture to cure retained fetal membranes. [Method] Thin layer chromatography (TLC) method was used for qualitative identification of the traditional Chinese medicine in Gongyijing tincture. Puerarin, safflower and garden balsam seed and Radix Cyathulae were identified by TLC in Gongyijing tincture. [Result] Under the selected chromatographic conditions, chromatographic spots were better separated. This identification method could effectively identify puerarin, safflower, and garden balsam seed. [Conclusion] The established TLC method was simple, easy to operate, has strong specificity and good repeatability, which provides

for the quality control of Gongyijing tincture.

Gongyijing tincture; Thin layer chromatography (TLC); Quality standard

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303040)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)與臨床創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2015-LIHPS-06)。

朱永剛(1991- )，男，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向：奶牛中獸藥研發(fā)。*通訊作者，研究員，博士生導(dǎo)師，從事奶牛疾病相關(guān)研究。

2016-07-22

S 853.7

A

0517-6611(2016)27-0114-03