鑒別診斷臨床急性肺炎病原體感染的血清標(biāo)志物研究

劉　萌　竇云鵬　谷　麗　呂　喆　王一民　劉穎梅　安云慶* 　曹　彬2,*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院感染與臨床微生物科　北京呼吸疾病研究所，北京 100020；2. 首都醫(yī)科大學(xué)呼吸病學(xué)系，北京 100069；3. 首都醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系　首都醫(yī)科大學(xué)微生態(tài)研究中心，北京 100069； 4. 中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二部，北京 100029)

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· 基礎(chǔ)研究 ·

鑒別診斷臨床急性肺炎病原體感染的血清標(biāo)志物研究

劉萌1,2竇云鵬3谷麗1呂喆3王一民4劉穎梅4安云慶3*曹彬2,4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院感染與臨床微生物科北京呼吸疾病研究所，北京 100020；2. 首都醫(yī)科大學(xué)呼吸病學(xué)系，北京 100069；3. 首都醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系首都醫(yī)科大學(xué)微生態(tài)研究中心，北京 100069； 4. 中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二部，北京 100029)

目的 檢測(cè)急性肺炎患者血清相關(guān)生物標(biāo)志物含量，為建立一種快速鑒別診斷臨床急性支原體肺炎、病毒性肺炎、細(xì)菌性肺炎的免疫膠體金檢測(cè)法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法以臨床病原學(xué)診斷明確的急性支原體肺炎，病毒性肺炎，細(xì)菌性肺炎患者和正常人血清為檢測(cè)樣品，采用血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)/殺菌滲透增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上述血清中相關(guān)生物標(biāo)志物含量。 結(jié)果(1)正常人群血清78份，急性支原體肺炎患者血清46份，病毒性肺炎和細(xì)菌性肺炎患者血清42份，其中病毒感者患者血清35份，細(xì)菌感染患者血清7份；(2)正常人群血清PDGF最大值<6 000 pg/mL； 血清BPI最大值<80 ng/mL；(3)以血清PDGF值6 000 pg/mL作為鑒別診斷急性支原體感染的基線值，支原體感染患者陽(yáng)性檢出率為93.47%(43/46)；病毒和細(xì)菌感染患者出現(xiàn)支原體感染的假陽(yáng)性率為7.14%(3/42)；(4)以血清BPI值80 ng/mL作為鑒別診斷急性細(xì)菌感染的基線值，細(xì)菌感染患者陽(yáng)性檢出率為85.71%(6/7)；病毒感染患者出現(xiàn)細(xì)菌感染的假陽(yáng)性率為3.22% (1/31)。結(jié)論以血清PDGF 6 000 pg/mL和BPI 80 ng/mL作為鑒別診斷不同病原體感染的基線值，對(duì)臨床急性支原體肺炎、病毒性肺炎、細(xì)菌性肺炎鑒別診斷具有一定意義。

肺炎; 鑒別診斷; 血小板衍生生長(zhǎng)因子; 殺菌滲透增強(qiáng)蛋白

在臨床急性呼吸道感染患者中，支原體感染所占比例最大，病毒次之，細(xì)菌最低[1]。在上述病原體中，細(xì)菌對(duì)青霉素和頭孢菌素類抗生素敏感；支原體對(duì)紅霉素和螺旋霉素類抗生素敏感；而病毒感染用上述抗生素治療無(wú)效?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)存在不能及時(shí)準(zhǔn)確鑒別診斷上述相關(guān)病原體的缺陷。 臨床醫(yī)生通常多采用經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療，這不僅容易造成抗生素使用不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，還可因未能及時(shí)合理使用抗生素而使某些患者，特別是嬰幼兒患者病情迅速惡化產(chǎn)生嚴(yán)重后果[2]。

目前臨床常用的血清炎性指標(biāo)主要包括C-反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)和降鈣素原(procalcitonin，PCT)。最初發(fā)現(xiàn)急性細(xì)菌感染患者血清CRP濃度顯著升高，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在某些病毒感染患者血清中CRP濃度也顯著升高。故患者血清CRP濃度升高對(duì)急性細(xì)菌或病毒感染僅有一定的輔助診斷意義[3]。 PCT血清濃度升高對(duì)臨床重癥細(xì)菌感染的診斷和指導(dǎo)抗生素的合理使用具有重要意義[4-5]，而對(duì)臨床輕癥細(xì)菌感染與病毒或支原體感染沒有鑒別診斷價(jià)值。因此，在急性呼吸道感染患者血清中找到對(duì)不同病原體感染具有鑒別診斷意義的生物標(biāo)志物，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法，對(duì)指導(dǎo)及時(shí)合理使用抗生素有效控制患者病情和減少耐藥菌產(chǎn)生有重要意義。

為此，本課題組以臨床病原學(xué)診斷明確的急性支原體、病毒性肺炎、細(xì)菌性肺炎患者和正常健康人血清為檢測(cè)樣品，采用血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)/殺菌滲透增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)試劑盒對(duì)上述血清樣品中相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象和檢測(cè)樣品

選擇2010年9月至2012年6月北京肺炎監(jiān)測(cè)網(wǎng)病原學(xué)診斷明確的門診或住院成人急性肺炎患者88例；其中急性細(xì)菌性肺炎患者血清7份，急性病毒性肺炎患者血清35份，急性支原體肺炎患者血清46份作為檢測(cè)樣品。選擇首都醫(yī)科大學(xué)2015年入學(xué)新生(18～19歲)體檢剩余血清78份作為正常對(duì)照樣品。

1.2檢測(cè)方法

首先采用Bio-Plex懸液芯片技術(shù)對(duì)部分患者血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，尋找具有鑒別診斷意義的候選生物標(biāo)志物，然后采用ELISA試劑盒對(duì)包括急性肺炎患者和正常對(duì)照組人群在內(nèi)的所有血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。PDGF試劑盒(購(gòu)自eBioscience公司)，參照操作說(shuō)明對(duì)血清樣品中PDGF的濃度進(jìn)行檢測(cè)；BPI試劑盒(購(gòu)自Hycult Biotech 公司)參照操作說(shuō)明對(duì)血清樣品中BPI含量進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1正常健康人群組

正常健康人群組血清樣品78份，檢測(cè)結(jié)果：(1)PDGF值：186～5 521 pg/mL，最大值<6 000 pg/mL；(2)BPI值：1～49 ng/mL，最大值<80 ng/mL。

2.2急性細(xì)菌性肺炎組

急性細(xì)菌性肺炎患者血清樣品7份，檢測(cè)結(jié)果：(1)PDGF值：489～7 930 pg/mL，其中6份血清樣品PDGF值<6 000 pg/mL，1份血清樣品PDGF值為7 930 pg/mL。(2)BPI值：40～349 ng/mL，其中6份血清樣品BPI值>80 ng/mL， 1份血清樣品BPI值為40 ng/mL，詳見表1。

表1　急性細(xì)菌性肺炎患者血清中PDGF和BPI檢測(cè)結(jié)果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

2.3急性病毒性肺炎組

急性病毒性肺炎組血清樣品35份，檢測(cè)結(jié)果：(1)PDGF值：530～11 865 pg/mL，其中33份血清樣品PDGF值<6 000 pg/mL，2份血清樣品PDGF值>6 000 pg/mL。(2) BPI值(31份)：12～88 ng/mL， 其中30份血清樣品BPI值<80 ng/mL，1份血清樣品BPI值>80 ng/mL，詳見表2。

2.4急性支原體肺炎組

急性支原體肺炎組血清樣品46份，檢測(cè)結(jié)果：(1)PDGF值：2 786～39 438 pg/mL，其中43份血清樣品PDGF值>6 000 pg/mL，3份血清樣品PDGF值<6 000 pg/mL。(2) BPI值(42份)：22～264 ng/mL，其中25份血清樣品BPI值>80 ng/mL，17份血清樣品BPI值<80 ng/mL，詳見表3。

表2　急性病毒性肺炎患者血清中PDGF和BPI檢測(cè)結(jié)果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

表3　急性支原體肺炎患者血清中PDGF和BPI檢測(cè)結(jié)果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

3　討論

血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是參與機(jī)體組織損傷修復(fù)的重要因子[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，PDGF升高與肺、肝、骨髓纖維化和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。 肺炎支原體反復(fù)感染的大鼠肺組織中PDGF濃度顯著升高，并由此導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化形成的研究[9-10]報(bào)道，提示支原體感染與體內(nèi)PDGF水平升高存在一定的相關(guān)性。殺菌滲透增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)是一種具有中和內(nèi)毒素和廣譜殺菌作用的陽(yáng)離子蛋白[11-12]，主要存在于中性粒細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞中；細(xì)菌感染后患者血清BPI濃度顯著升高[13]。

PDGF和BPI作為一種參與機(jī)體組織損傷修復(fù)、誘導(dǎo)促進(jìn)組織纖維化形成的細(xì)胞因子和一種抗菌蛋白或抗感染生物制劑受到醫(yī)學(xué)界的重視。但迄今尚未發(fā)現(xiàn)將PDGF和BPI作為一種急性感染生物志志物，用以鑒別診斷不同病原微生物感染的研究。

免疫膠體金檢測(cè)法是一種快速定性診斷的技術(shù)。在此基礎(chǔ)上制備的免疫膠體金試紙卡檢測(cè)試劑盒不僅具有快速(1 h內(nèi))診斷的特點(diǎn)，還具有測(cè)試準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果容易判讀，適合在城鄉(xiāng)基層醫(yī)療單位推廣使用的優(yōu)點(diǎn)[14-15]。建立免疫膠體金檢測(cè)方法的核心問題是能夠找到相關(guān)生物標(biāo)志物，并準(zhǔn)確獲得該生物標(biāo)記物對(duì)相關(guān)疾病具有鑒別診斷意義的基線值。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，若以血清PDGF值6 000 pg/mL作為鑒別診斷急性支原體肺炎、細(xì)菌性肺炎病毒性肺炎的基線值，則支原體感染患者陽(yáng)性檢出率為93.47%(43/46)。鑒于在7份急性細(xì)菌性肺炎和35份急性病毒性肺炎患者血清樣品中分別有1份和2份樣品PDGF值>6 000 pg/mL，故上述患者出現(xiàn)支原體感染的假陽(yáng)性率為7.14% (3/42)。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，血清PDGF值6 000 pg/mL對(duì)急性支原體與細(xì)菌/病毒感染具有很好的區(qū)分度。

若以血清BPI值80 ng/mL作為鑒別診斷急性細(xì)菌性肺炎與急性病毒性肺炎的基線值，則細(xì)菌感染患者陽(yáng)性檢出率為85.71%(6/7)。鑒于在31份急性病毒性肺炎血清樣品中有1份血清樣品BPI值>80 ng/mL，故上述患者出現(xiàn)細(xì)菌感染的假陽(yáng)性率為3.22%(1/31)。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，血清BPI值80 ng/mL對(duì)急性細(xì)菌和病毒感染具有很好的區(qū)分度。

在本實(shí)驗(yàn)中，急性支原體肺炎血清樣品中有25份樣品BPI值>80 ng/mL，17份樣品BPI值<80 ng/mL；故血清BPI值80 ng/mL不能作為鑒別診斷急性細(xì)菌性肺炎與急性支原體肺炎的基線值。鑒于在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，血清PDGF值檢測(cè)結(jié)果，即支原體感染患者陽(yáng)性檢出率為93.47%，已將急性支原體肺炎與急性細(xì)菌性肺炎病毒性肺炎有效鑒別區(qū)分。因此，部分急性支原體肺炎患者血清BPI>80 ng/mL并不影響急性細(xì)菌性肺炎與急性支原體肺炎的鑒別診斷。

根據(jù)以上研究結(jié)果，擬制備的免疫膠體金檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)血清PDGF含量的測(cè)試紙卡I和檢測(cè)血清BPI含量的測(cè)試紙卡II。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)測(cè)試紙卡I檢測(cè)線處出現(xiàn)一條紫紅色條帶或測(cè)試紙卡I和II檢測(cè)線處各出現(xiàn)一條紫紅色條帶，鑒定為急性支原體肺炎；(2)測(cè)試紙卡I檢測(cè)線處無(wú)紫紅色條帶出現(xiàn)，測(cè)試紙卡II檢測(cè)線處出現(xiàn)一條紫紅色條帶，鑒定為急性細(xì)菌性肺炎；(3)測(cè)試紙卡I和II檢測(cè)線處均無(wú)紫紅色條帶出現(xiàn)，鑒定為急性病毒性肺炎。用測(cè)試紙卡I和II檢測(cè)正常人血清也會(huì)出現(xiàn)上述結(jié)果，但正常健康人群無(wú)肺炎相關(guān)臨床癥狀，也不會(huì)來(lái)醫(yī)院就診，因此不影響本試劑盒在臨床上的使用。

本項(xiàng)研究獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為免疫膠體金快速定性檢測(cè)試劑盒的制備奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。鑒于研究對(duì)象，即急性肺炎患者病例數(shù)(88例)和不同病原體感染，特別是細(xì)菌性肺炎患者病例數(shù)(7例)較少，有可能影響PDGF/BPI鑒別診斷基線值的確定及相關(guān)病原體的陽(yáng)性檢出率和誤診率，因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)，以獲得更為準(zhǔn)確的PDGF/BPI鑒別診斷基線值及相關(guān)病原體的陽(yáng)性檢出率和誤診率。

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編輯慕萌

s， E-mail：anyunq@ccmu.edu.cn, caokin_ben@163.com

Studies of serum biomarkers to differentiate and diagnose acute pneumonia pathogens infection

Liu Meng1,2, Dou Yunpeng3, Gu Li1, Lyu Zhe3, Wang Yimin4, Liu Yingmei4, An Yunqing3*, Cao Bin2,4*

(1.DepartmentofInfectiousDiseasesandClinicalMicrobiology,BeijingChaoyangHospital,BeijingInstituteofRespiratoryMedicine,Beijing100020，China; 2.DepartmentofImmunology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 3.DepartmentofImmunology,MicroecologyResearchCenter，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China; 4.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029，China)

ObjectiveTo provide the experimental basis of a rapid immune colloidal gold test which used to differentiate and diagnose acute pneumonia patients infected with mycoplasma pneumoniae(MP)/virus/bacteria. MethodsThe level of platelet-derived growth factor (PDGF) and bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in the serum of acute pneumonia patients with definite infection of mycoplasma pneumoniae /virus/bacteria and healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. ResultsThere were 78 serum samples from healthy controls, 46 from acute MP patients, 42 from acute bacterial and viral pneumonia patients (7 from bacterial pneumonia and 35 from viral pneumonia patients). (2) PDGF values of healthy controls were all less than 6 000 pg/mL; BPI values were all less than 80 ng/mL. (3) If definition of the baseline value of PDGF which could diagnose acute MP infection is as 6 000 pg/mL, the positive detection rate of MP pneumonia patients was 93.47% (43/46), and the MP false positive rate of patients with viral or bacterial pneumonia was 7.14% (3/42). (4) If definition of the baseline value of BPI which could diagnose acute bacterial infection is 80ng/mL, the positive detection rate of patients with bacterial pneumonia was 85.71% (6/7), and the bacteria false positive rate of viral pneumonia patients was 3.22% (1/31). ConclusionUsing PDGF’s baseline value as 6 000 pg/mL and BPI’s 80 ng/mL to differential diagnosis has some clinical significance to differentiate acute MP/virus/bacterium infection.

pneumonia; differentiation diagnosis; platelet-derived growth factor; bactericidal/permeability-increasing protein

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81271840)，國(guó)家青年杰出基金項(xiàng)目(81425001)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81271840)， National Science for Distinguished Young Scholars(81425001).

時(shí)間：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.004.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.016]

R 563.1

2016-09-05)