探究膠質(zhì)纖維酸性蛋白在6-OHDA大鼠胃體中的表達變化

任沁展　鄭麗飛　劉　瑋　朱進霞

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系, 北京 100069)

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· 基礎研究 ·

探究膠質(zhì)纖維酸性蛋白在6-OHDA大鼠胃體中的表達變化

任沁展鄭麗飛*劉瑋朱進霞

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系, 北京 100069)

目的 研究膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)在6-羥多巴(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)大鼠胃體中的表達變化情況，探討神經(jīng)膠質(zhì)細胞在帕金森病(Parkinson’s disease, PD)胃輕癱中的作用機制。方法用6-OHDA 損毀大鼠中樞黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，建立PD模型。采用免疫熒光法檢測酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫陽性神經(jīng)元在黑質(zhì)的分布，并用同樣的方法檢測GFAP和神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament, NF)在大鼠胃體肌層的分布情況，采用蛋白免疫印記法(Western blotting)檢測GFAP在6-OHDA模型大鼠胃體的表達情況。結(jié)果6-OHDA大鼠黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元大量丟失，并伴有TH免疫反應性明顯降低；6-OHDA大鼠胃體肌層GFAP和NF免疫反應性下降；Western blotting結(jié)果顯示6-OHDA模型大鼠胃體肌層GFAP蛋白下調(diào)。結(jié)論6-OHDA模型大鼠胃部GFAP和NF表達降低，可能參與了胃輕癱發(fā)病的過程，本研究可能為PD患者胃輕癱防治提供新的思路。

6-羥多巴大鼠；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；神經(jīng)微絲蛋白

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病。PD患者常伴有胃腸功能障礙[1]，如胃輕癱等，并且對某些患者來說，胃腸功能障礙已經(jīng)成為PD的主要癥狀。但其發(fā)病機制尚不清楚。最近研究[2-3]顯示，PD患者的黏膜和黏膜下神經(jīng)叢中腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的蛋白和mRNA水平較高，這提示腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞與PD有著緊密的聯(lián)系。

GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物，而腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞相似，GFAP也是腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞的特異性標志物[4]。腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞作為腸神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成部分，能夠分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子營養(yǎng)神經(jīng)元，并維持神經(jīng)元的生理特性和功能。相關研究報道，在一些神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)膠質(zhì)細胞的改變參與了疾病的調(diào)節(jié)[5]，GFAP的表達和修飾也發(fā)生了變化，如在PD患者的結(jié)腸活檢中發(fā)現(xiàn)GFAP高表達，而GFAP的磷酸化則在PD組較對照組低[6]。將6-羥多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)微量注射到大鼠雙側(cè)黑質(zhì)內(nèi)制備的6-OHDA PD大鼠模型出現(xiàn)胃輕癱的癥狀，其胃部腸神經(jīng)系統(tǒng)也出現(xiàn)了改變，如膽堿能神經(jīng)元和一氧化氮能神經(jīng)元的遞質(zhì)或標志物減少、多巴胺能神經(jīng)元的遞質(zhì)增加[7]，而腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞出現(xiàn)什么變化尚不清楚。因此，本實驗為了揭示腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞在PD胃輕癱發(fā)病中的作用，通過免疫熒光和蛋白印記的方法檢測了GFAP在6-OHDA大鼠胃部的情況。

1　材料與方法

1.16-OHDA處理PD模型大鼠的制備

取SPF級雄性SD大鼠20只(首都醫(yī)科大學實驗動物部提供)，實驗動物許可證號：SCXK(京)2015-0001。體質(zhì)量為210～250 g，按照實驗動物福利許可經(jīng)實驗動物委員會批準，動物在室溫條件下，正常晝夜更替光照，食水24 h供應，采用數(shù)字表法將其隨機分為實驗組和對照組，對照組大鼠9只，6-OHDA處理組11只。

腹腔注射10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛(0.4 g/kg)進行麻醉，將大鼠頭部固定于立體定位儀上，按照大鼠腦立體定位圖譜進行定位雙側(cè)黑質(zhì)位置，黑質(zhì)的坐標：前囟后5.6 mm(AP=-5.6 mm)，旁開±2.0 mm(ML=±2 mm)，深度7.5 mm(DV=-7.5 mm)，用微量注射器每側(cè)勻速注入6-OHDA[2 μg/μL，含0.2%(質(zhì)量分數(shù))抗壞血酸，美國Sigma公司]2 μL。對照組大鼠實驗方法同上，每側(cè)黑質(zhì)注射無菌0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液2 μL[含0.2%(質(zhì)量分數(shù))抗壞血酸]。飼養(yǎng)4周后，模型建立并取材。

1.2免疫組織化學測定腦組織和胃組織

腦組織取材：將動物用10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心先灌流37 ℃的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液300 mL，之后用250 mL 4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛進行灌流固定，完成后開顱取出全腦，將腦組織浸泡于4 ℃ 4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛溶液中后固定12 h，之后將組織浸泡于15%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖溶液和30%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖溶液中，對腦組織進行梯度脫水。

胃取材：將大鼠脫臼處死后取出新鮮胃體，用OCT包埋劑包埋，放入液氮中快速冷凍。

大鼠的腦組織梯度脫水后，取出組織塊，用OCT包埋，在 Leica 冰凍切片機中進行大腦黑質(zhì)切片，切片厚度為20 μm，腦片漂片于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution-tween 20, PBST)溶液液面上，用多聚賴氨酸處理的載玻片撈取，用小毛筆輕輕鋪平，過夜晾干。將貼有腦片的載玻片放入檸檬酸鹽緩沖液中進行微波抗原修復，自然冷卻至室溫。用PBST緩沖液洗片3×10 min。用5%(體積分數(shù))馬血清封閉30 min，棄掉封閉血清，孵抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)的一抗(小鼠抗大鼠，1∶5 000，美國Sigma公司)，4 ℃過夜。棄去一抗，用PBST清洗3×10 min。滴加二抗(驢抗小鼠，美國Invitrogen公司)，孵育2 h后滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI)避光孵育5 min，吸去標記液，用PBS洗片3×5 min，用甘油封片。在熒光顯微鏡(ECLIPSE Ni-U, 日本Nikon公司)下觀察并拍照。

取胃體組織包塊，用冰凍切片機切片，厚度為 7 μm，并將其平整的黏附在用多聚賴氨酸處理的載玻片上，室溫過夜。組織干燥后置于染缸中，倒入冷丙酮，固定10 min，接著用PBST清洗組織4次，每次10 min。取5%(體積分數(shù))的馬血清孵育30 min(濕盒中)。完成后甩掉封閉血清，加入一抗神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament, NF)(1∶500，美國Novus公司)、GFAP(1∶400，美國Santa公司)進行雙標，4 ℃過夜孵育。次日取出組織切片，甩掉一抗，用PBST洗4次，每次10 min。滴加二抗(驢抗小鼠、驢抗兔，美國Invitrogen公司)，孵育2 h后滴加DAPI，10 min后PBS洗片4次，甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍攝。

1.3蛋白印記(Western blotting)法測定胃組織

收集新鮮胃組織，沿腸系膜剪開并用Kreb液將胃內(nèi)容物沖洗干凈。在解剖顯微鏡下將胃體組織黏膜面朝下用小針固定，用精細的鑷子將胃的黏膜層和肌層分開。剪取胃體肌層組織30～50 mg，加入300 μL蛋白裂解液于離心管中。機械研磨直至組織粉碎，進一步用超聲震蕩儀超聲破碎。4 ℃，12 000 r/min，離心30 min。小心吸出上清移液，移入另一離心管中，棄去沉淀。用二辛可酸(bicinchoninic, BCA)法進行蛋白定量。配制10%(質(zhì)量分數(shù))濃縮膠和5%(質(zhì)量分數(shù))分離膠，在電泳槽中倒入電泳緩沖液，將上樣蛋白與5×上樣緩沖液混勻，95 ℃水浴5 min變性，在每個加樣孔中加入100 μg蛋白樣品，進行電泳，將電壓調(diào)到80 V使溴酚藍跑到分離膠時，再換成120 V直至溴酚藍到達分離膠底部。取出凝膠進行轉(zhuǎn)膜，恒電流狀態(tài)下轉(zhuǎn)膜，295 mA， 90 min，取出轉(zhuǎn)有總蛋白的硝酸纖維素膜，Tris-HCl 緩沖鹽溶液(tris-buffered saline, TBS)洗5 min，用含10%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉Tris-HCl 鹽緩沖液(tris-buffered saline and tween 20, TBST)溶液室溫封閉1 h，加入一抗(GFAP，1∶5 000，美國Santa公司)，4 ℃孵育過夜。第二日取出后室溫輕搖30 min，TBST洗膜3次，每次10 min，加入綠色熒光標記二抗(1∶10 000，美國Rockland公司)，室溫輕搖2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，然后用TBS洗膜1次，10 min。最后用Odyssey紅外成像儀掃描成像，并用Odyssey軟件進行結(jié)果分析。

1.4統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1大鼠黑質(zhì)部位注射6-OHDA的帕金森動物模型鑒定

在多巴胺的合成過程中，TH是限速酶，所以TH可以作為多巴胺能神經(jīng)元的標志物。從免疫熒光的染色結(jié)果(圖1A和1B)來看，6-OHDA模型鼠黑質(zhì)部位的TH免疫陽性神經(jīng)元(紅色)的數(shù)量和熒光強度明顯低于對照組，表明6-OHDA大鼠黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少。提示6-OHDA處理的PD大鼠模型造模成功。

圖1　酪氨酸羥化酶免疫陽性神經(jīng)元在大鼠黑質(zhì)致密部的分布情況

Dashed ovals show images of TH-immunoreactive neurons (red) in SN pars compacta in control (A) and 6-OHDA (B) rats. Nuclei (blue) are stained by 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). 6-OHDA：6-hydroxydopamine；scale bars: 200 μm.

2.2GFAP和NF在PD組和對照組大鼠胃體肌間神經(jīng)叢中的分布情況

為了明確腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞在胃體肌層的分布情況，采用免疫組織化學的方法進行了形態(tài)學的觀察。GFAP是腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞的特異性標志物，NF是神經(jīng)元的標志物。結(jié)果顯示在對照組及6-OHDA大鼠的胃體肌間神經(jīng)叢中GFAP(綠色)和NF均呈現(xiàn)免疫陽性(紅色)，并且GFAP標記的腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞包繞在NF標記的神經(jīng)元周圍。與對照組相比，6-OHDA大鼠胃體肌間神經(jīng)叢中GFAP和NF免疫陽性細胞的數(shù)量和熒光強度都低于對照組(圖2)。

2.3GFAP在PD組和對照組大鼠胃體肌間神經(jīng)叢中的蛋白表達差異

為了明確腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞在6-OHDA大鼠胃體肌層的變化情況，進一步采用Western blotting的方法檢測了胃體肌層中GFAP的蛋白，GFAP的表達以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3 phasparc dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參，并以比值的形式表示。結(jié)果顯示6-OHDA大鼠組GFAP蛋白(0.14±0.03，n=4)較對照組(0.20±0.03，n=4)有明顯的下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見圖3。

3　討論

本實驗通過用6-OHDA損毀黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元制備的PD大鼠模型，觀察到6-OHDA大鼠較正常對照組大鼠胃體肌間神經(jīng)叢中GFAP和NF的表達量下降。

在本實驗中，6-OHDA損毀了黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)細胞，標志著動物模型造模成功。本實驗室之前的研究[8]顯示，6-OHDA大鼠較正常對照組的大鼠會有胃輕癱的表現(xiàn)如胃動力減弱、胃排空延遲等。在本實驗中，GFAP作為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志物，在PD大鼠胃體肌層中表達較正常對照組低，提示在PD大鼠胃體中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的數(shù)量和功能可能出現(xiàn)降低。作為神經(jīng)元的標志物，NF在PD大鼠胃體中的表達也較對照組低。近年來研究[9]顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子在腸神經(jīng)系統(tǒng)的形成過程中有著重要的作用。神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子如膠質(zhì)源性的神經(jīng)生長因子(line-derivednervegrowthfactor,GDNF)、神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)[10]和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3,NT-3)，能夠誘導胚胎時期的神經(jīng)嵴細胞的分化、增生，形成完善的腸神經(jīng)系統(tǒng)[11-12]，其中NT-3還能促進神經(jīng)細胞軸突的生長[12-13]，促進神經(jīng)傳導功能的修復[14]，這些研究提示神經(jīng)膠質(zhì)細胞具有營養(yǎng)神經(jīng)元，維持神經(jīng)元的生理特性和功能。GDNF和NT-3還能維持和促進神經(jīng)元存活、分化、再生，為神經(jīng)元的生長提供良好的微環(huán)境[15]，GDNF還對修復損傷的神經(jīng)元有營養(yǎng)和保護作用[16]。更加值得注意的一點是NT-3與迷走神經(jīng)還有交互作用[17]。而在6-OHDA大鼠胃部由于神經(jīng)營養(yǎng)因子的減少，可能引起神經(jīng)元出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的異常。腸神經(jīng)系統(tǒng)在胃動力調(diào)控中起著至關重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能的異常將會引起胃動力障礙[18]，具體機制還有待進行進一步研究[19-20]。

圖2　神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)微絲在大鼠胃體肌間神經(jīng)叢中的分布情況

GFAP-immunoreactivity (green) and NF-immunoreactivity (red) were showed in gastric myenteric plexus of control (A，B，C) and 6-OHDA (D，E，F(xiàn)).C：merged image of A and B；F：merged image of D and E； 6-OHDA：6-hydroxydopamine； scale bars: 20 μm.

圖3　神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白在對照組和6-OHDA組大鼠胃體肌層的表達差異

A: GFAP protein level was detected from gastric muscular externa of control and 6-OHDA rats by Western blotting. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal reference.B: Compared to control, GFAP protein expression was significantly reduced in gastric muscular externa of 6-OHDA rats (**P<0.01vscontrol,n=4).6-OHDA：6-hydroxydopamine.

有研究[2]顯示，PD患者中胃腸道中的炎性反應因子前體與GFAP和另一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志物Sox-10的表達有非常強的相關性，膠質(zhì)細胞的增生或反應增強可能是PD的始動因素[5,21]，PD患者的結(jié)腸活檢中也發(fā)現(xiàn)GFAP的表達上調(diào)，高度懷疑是神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應性增生。這些研究結(jié)果提示，在PD患者起病時，腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應性增生，被激活后釋放細胞因子產(chǎn)生炎性反應，造成PD。但隨著PD的發(fā)展，腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞可能會像中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞一樣[22]出現(xiàn)反應下降，進而導致GFAP陽性細胞數(shù)量的減少或功能的減退，從而影響到腸神經(jīng)系統(tǒng)及胃動力。

綜上所述，6-OHDA處理模型大鼠胃部GFAP和NF的降低可能參與到了胃輕癱發(fā)病的過程，本研究可能為PD患者胃輕癱防治提供新的思路。

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編輯孫超淵

， E-mail：13581582937@163.com

The expression of glial fibrillary acidic protein in gastric corpus of 6-OHDA rats

Ren Qinzhan, Zheng Lifei*, Liu Wei, Zhu Jinxia

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo study the glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression in gastric corpus of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) treated rats and explore the underlying mechanism of enteric glial cells in gastroparesis of Parkinson’s disease (PD). Methods6-OHDA PD rat model was made by microinjecting 6-OHDA into bilateral substantia nigra. Immunofluorescence was used to observe the distribution of tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactive (IR) neurons in the substantia nigra and the expression of GFAP and neurofilament (NF) in gastric corpus of 6-OHDA rats. Western blotting was applied to detect the expression of GFAP and NF in gastric corpus of 6-OHDA rats. ResultsIn rats treated with 6-OHDA, the number of TH-IR neurons in the substantia nigra was significantly reduced; Immunofluorescence results showed that both GFAP and NF expression were distinctly decreased in gastric corpus of 6-OHDA rats; Compared with the control rats, the protein level of GFAP was significantly decreased in gastric corpus of 6-OHDA rats by Western blotting. ConclusionThe results suggest that decrease of NF and GFAP in gastric corpus may play a role in the course of gastroparesis of 6-OHDA rats, which may provide a new idea for prevention of gastroparesis in PD.

6-hydroxydopamine rats; glial fibrillary acidic protein; neurofilament

國家自然科學基金(81170346，81370482，31400991)，北京市自然科學基金(7121003, 7132017)，北京市屬高等學校創(chuàng)新團隊建設與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目(IDHT20140514)，首都醫(yī)科大學基礎臨床科研合作課題(14JL14)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81170346, 81370482, 31400991), Natural Science Foundation of Beijing (7121003, 7132017), Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20140514) and Basic-Clinical Scientific Research Cooperation Project of Capital Medical University (14JL14).

時間：2016-10-1610∶57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1057.020.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.011]

R 363

2015-12-18)