響應面優(yōu)化菊芋菊糖的提取工藝研究

劉 燕 陳小銀 楊麗麗 謝 瑞 何 楠 張 繼*

(1.西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070； 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心，蘭州 730070)

響應面優(yōu)化菊芋菊糖的提取工藝研究

劉 燕1,2陳小銀1楊麗麗1謝 瑞1何 楠1張 繼1,2*

(1.西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心，蘭州 730070)

利用單因素實驗及響應面法優(yōu)化確定菊芋塊莖中菊糖的提取工藝。通過單因素實驗篩選出液固比、提取時間、提取溫度3個主要因素，以菊糖得率為響應值利用Design Expert V8.0中心組合試驗設計，建立菊糖提取得率的二次回歸方程，得到優(yōu)化組合條件。響應面法分析結果表明，當液固比為18∶1(mL·g-1)，提取時間41 min，提取溫度86℃時，驗證優(yōu)化工藝得菊芋塊莖中菊糖的最大提取得率40.56%，接近于模型預測值40.74%。在該工藝條件下，對菊糖進行粗制，并通過紅外光譜儀對所提取的菊糖進行了結構分析。該法用于提取菊芋塊莖中的菊糖，工藝簡單、成本低，具有一定的應用價值。

菊芋；菊糖；響應面法；提取工藝

菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜，為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)宿根性草本植物。秋季開花，長有黃色的小盤花，形如菊，生產(chǎn)上一般用塊莖繁殖。其地下塊莖可以食用，煮食或熬粥，腌制咸菜，曬制菊芋干，或作為制取淀粉和酒精原料[1～2]。地上莖也可加工作飼料，其塊莖或莖葉入藥具有利水除濕，清熱涼血，益胃和中之功效[3]。塊莖中富含菊糖，還含有淀粉、蛋白質(zhì)、粗纖維等成分。菊糖是一種天然果聚糖，由D-果糖通過β(1→2)糖苷鍵組成，在適宜的條件下，菊糖可被水解為果糖和葡萄糖。高聚糖漿具有甜度高、冷甜性、風味的不掩蓋性，溶解度高和保健型等特點，在飲料等食品工業(yè)中得到了越來越多的應用，而且可以作為特殊人群如糖尿病患者、運動員等的甜味劑和營養(yǎng)源，此外還可改變食物消化過程，增加飽腹感，防止肥胖[4]。菊芋的生態(tài)適應能力強，具有耐旱、抗旱、耐瘠薄、抗風沙、改善鹽堿土地、繁殖力強、無病蟲害、保持水土等優(yōu)點[5～6]。由此可見，種植菊芋具有很客觀的經(jīng)濟效益和廣闊的開發(fā)前景。

目前，在西歐、北歐以菊芋塊莖為原料，通過提取菊糖后利用菊糖酶一步催化反應生產(chǎn)高果糖漿已開始產(chǎn)業(yè)化, 發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)物得率高、雜質(zhì)少、對設備要求低、耗能小、產(chǎn)品分離純化容易等優(yōu)點[7～9]。而我國在這方面起步晚，但是對菊芋的功效和利用越來越重視。本實驗利用單因素實驗及響應面法優(yōu)化對菊芋塊莖中菊糖的提取工藝進行優(yōu)化，以使得菊糖得率得到最大化，為進一步開發(fā)利用菊芋提供參考依據(jù)[10～12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮菊芋于2014年11月來自甘肅蘭州，所購原材料為紅皮菊芋。苯酚(AR，煙臺市雙雙化工)，濃硫酸(≧98%，北京化工)，3,5-二硝基水楊酸(AR，上海中泰)，無水亞硫酸鈉(AR，上海硫酸廠)，酒石酸鉀鈉(AR，宜興化學試劑廠)，檸檬酸(AR，天津福晨)磷酸氫二鈉(AR，上海中泰)。

1.2 儀器與設備

HSY2-SP恒溫水浴鍋(北京科偉)，JD500-3電子天平(沈陽龍騰)，C21-SDHCB66T蘇泊爾超薄電磁爐(浙江蘇泊爾)，UV1000紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科)，IS10傅立葉變換紅外光譜儀(美國Thermo)，WF-130萬能粉碎機(江陰康和)，DHG-9143B5電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的預處理

將所購新鮮菊芋洗凈、切片后，在室溫下陰干，用粉碎機破碎至一定粒度得菊芋干粉，60℃烘箱干燥至恒重后備用。

1.3.2 標準曲線的制作

將葡萄糖在恒溫干燥箱中105℃干燥至恒重，準確稱取100 mg于100 mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至100 mL，充分混勻得1 mg·mL-1的葡萄糖標準液，于4℃冰箱中保存待用。

總糖的測定采用苯酚-硫酸法[13]。分別吸取1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于6支干燥試管中，分別加蒸餾水至1.0 mL，然后緩慢加入6%苯酚3.0 mL，迅速滴加98%濃硫酸5.0 mL，振蕩均勻后于室溫放置30 min，490 nm處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

還原糖測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14～15]。取6支20 mL刻度試管，分別加入1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別補加蒸餾水至0.5 mL，各加入1.5 mL pH4.8磷酸緩沖液及3 mL DNS試劑，充分混合，沸水浴煮沸7 min顯色，流水冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL，在波長530 nm處測吸光度。以還原糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 菊芋中菊糖含量測定

菊芋中總糖含量的測定：精確量取1 mL菊糖浸提液置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度；搖勻后，分別準確吸取0.1 mL溶液加入3支干燥試管，按總糖標準曲線測定方法，490 nm處測定溶液吸光度，根據(jù)標準曲線求得菊芋中總糖含量。

菊芋中還原糖含量的測定：精確量取菊糖浸提液1 mL于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度線，混勻后吸取0.5 mL于3支試管中，按標準曲線方法處理樣品后530 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線求得菊芋中還原糖含量[16]。

菊糖濃度=總糖濃度-還原糖濃度

1.3.4 響應面試驗

參閱文獻方法比較，用熱水浸提法有較多優(yōu)點[17～18]。影響菊糖提取效果較為顯著的因素主要是料液比、水浴溫度、提取時間，分別進行單因素實驗探究其對菊糖提取率的影響水平。結合單因素實驗結果并在此基礎上，選取影響菊芋中菊糖提取率的主要因素：料液比、水浴溫度、提取時間為考察變量，以菊糖得率為評價指標，采用Design Expert V8.0進行實驗設計。

1.3.5 菊糖的粗制及理化性質(zhì)

菊糖提取液用氧化鈣—磷酸法脫蛋白。先用Ca(OH)2溶液將提取液調(diào)至pH11，80℃水浴保溫50 min，抽濾，用磷酸調(diào)至pH2，90℃水浴保溫70 min，繼續(xù)用Ca(OH)2溶液將提取液調(diào)至pH5。抽濾、濃縮后，取濾液按料醇比1∶3(mL·mL-1)加入無水乙醇，攪拌、靜置至沉淀析出后抽濾，保留濾餅冷凍干燥。

分別取菊芋菊糖進行苯酚—硫酸反應、茚三酮反應、碘—碘化鉀反應、雙縮脲反應、斐林試劑反應，統(tǒng)計實驗結果。

1.3.6菊糖的紅外光譜分析[19～20]

將提取的菊芋多糖樣品與KBr壓片(質(zhì)量比1∶100-200)，用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀掃描，波長范圍400～4000 cm-1，掃描16次，分辨率為4 cm-1。

2 結果與分析

2.1 菊糖提取的單因素實驗

設定提取溫度為90℃，提取時間為30 min條件下，考察液固比對菊芋多糖提取率的影響。由圖1(a)可以看出，隨著液固比的增大，菊糖提取率呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢。當液固比為15 mL·g-1時，菊糖提取率達到最大值37.50%。原因可能是液固比較小時，不足以使菊芋中的多糖充分的溶出；液固比過大，會消耗更多的能量和時間使有效成分溶出。

設定液固比為20(mL·g-1)，提取溫度為90℃條件下，考察提取時間對菊芋多糖提取率的影響。由圖1(b)可以看出，隨著提取時間的增大，菊糖提取率呈現(xiàn)增大的變化趨勢。當提取時間為70 min時，菊糖提取率達到最大值32.66%。在提取時間為40 min時，菊糖提取率為31.72%，隨后變化趨勢趨于穩(wěn)定，說明在40 min菊糖基本完全溶出，40 min可作為菊糖的最佳提取時間。

設定為液固比20(mL·g-1)，提取時間為30 min條件下，考察提取溫度對菊芋多糖提取率的影響。由圖1(c) 可以看出,隨著提取溫度的升高，菊糖提取率呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢。提取溫度為85℃時，菊糖提取率達到最大值37.28%。這可能是高溫破壞了部分糖的結構使其降解，且溫度越低浸提液的顏色越深，可能是溫度較低時浸提液中酚類底物的含量越多，酚類物質(zhì)氧化發(fā)生褐變所致。

圖1 液固比(a)、提取時間(b)和提取溫度(c)對菊糖提取率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio(a)，time(b)and temperature(c)on the extraction yield of inulin

2.2 響應面法優(yōu)化菊芋多糖提取工藝

2.2.1 Design Expert V8.0設計及試驗結果

根據(jù)Design Expert V8.0的中心組合試驗設計原理，結合單因素實驗結果，選取液固比、提取時間、提取溫度這3個因素，采用3因素3水平的響應面分析方法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。響應面試驗因素水平表見表1，在單因素實驗的基礎上，利用響應面法確定菊芋中菊糖的最佳提取工藝，設計及試驗結果如表2所示。

表1響應面試驗因素水平

Table1Levelsandcodeofresponsesurfaceexperiment

水平Level液固比Liquid?to?solidratio(mL·g-1)提取時間Time(min)提取溫度Temperature(℃)-110308001540851205090

表2響應面實驗設計結果

Table2Theresponsesurfacedesignofexperimentresults

序號No．液固比(A)Liquid?to?solidratio時間(B)Time溫度(C)Temperature菊糖得率Extractionyieldofinulin(%)1-1-1020．0021-1033．813-11020．29411035．715-10-118．70610-133．087-10123．89810136．8790-1-128．211001-127．47110-1130．091201132．271300038．501400038．891500038．421600038．771700037．96

2.2.2 回歸模型的建立與分析

利用Design Expert V8.0軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二次回歸模型方程為：

菊糖得率(%)=-1 315.572 10+9.746 90×A+2.553 97×B+28.276 24×C+8.017 46E-003×A×B-0.014 037×A×C+0.014 610×B×C-0.248 66×A2-0.048 384×B2-0.166 23×C2。

通過回歸模型分析響應面的回歸參數(shù)(表3～4)。由表3可以看出：模型P<0.000 1，模型極顯著；失擬項P=0.160 1>0.05，失擬項不顯著。表3中顯示A、C、A2、B2、C2對提取率的影響較大，達到極顯著P<0.000 1，其次是B、BC，達到顯著P<0.05。

從表4可以看出，模型的R2=0.997 9，校正系數(shù)(R2Adj)為0.995 2，預測系數(shù)(R2Pred)為0.976 0，R2預測值與R2校正值較為接近，因而該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預測菊芋中菊糖的提取工藝條件。

表3 模型方差分析

表4 R2綜合分析

2.2.3 提取工藝的響應曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)菊糖得率的回歸方程獲得相應的響應面圖和等高線圖，如圖2所示。

由圖2液固比和提取時間對菊芋多糖含量的交互影響的響應面圖(Ⅰ)可以看出，隨著提取時間的延長，菊芋多糖得率逐漸增高，提取時間達到40min后，多糖含量趨于平衡；隨著液固比的增大，菊糖在溶液中的溶出率先增大后減小；由提取溫度與液固比對菊芋多糖含量的交互影響響應面圖(Ⅱ)可以看出，溫度升高，多糖含量增加，同時由于溫度升高，多糖的降解也加劇，因此，溫度過高不利于菊芋多糖的提?。挥商崛r間與提取溫度對菊芋多糖含量的交互影響響應面圖(Ⅲ)可以看出，提取時間增加，有助于提取的進行；但提取時間過長，也會引起多糖的部分降解；溫度太低不利于反應的進行，太高又會造成多糖水解。

圖2 因素交互作用對菊糖提取率影響的響應曲面和等高線Fig.2 Response surface plot and contour plot showing the effects of extraction conditions on extraction yield of inulin

結合圖2中各組圖可知，每個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，說明響應值菊糖得率在3個因素設計范圍內(nèi)存在最大值。綜合表3和各因素間響應曲面及其等高線圖可知，各因素中液固比和提取溫度對菊糖提取率的影響較大(P<0.000 1)，交互效應對菊糖提取率的影響：BC>AB>AC。

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)及驗證試驗

通過軟件對數(shù)據(jù)進一步分析，可得模型理論最佳條件為液固比17.83∶1(mL·g-1)、提取時間40.86 min、提取溫度86.09℃，在此條件下，模型預測菊糖得率為40.74%。

為了檢驗響應面法的可行性，采用得到的最佳工藝參數(shù)進行菊芋中菊糖提取工藝的驗證試驗，同時考慮到實際操作和生產(chǎn)的便利，將上述優(yōu)化提取條件工藝參數(shù)修正為：液固比18∶1(mL·g-1)、提取時間41 min、提取溫度86℃。在此條件下對菊芋中菊糖進行熱水浸提的驗證實驗，重復實驗三次，取平均值，實際菊糖提取率為40.56 %，提取率與預測結果接近度為99.56 %，說明響應法得到的工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠，適合菊芋中菊糖的提取，有一定實踐操作價值。在此優(yōu)化條件下對菊芋中菊糖進行二次提取，得到二次提取液中菊糖平均含量為3.78%，為菊芋塊莖中菊糖的開發(fā)與利用提供了一定的參考。

2.2.5 菊糖的理化性質(zhì)

從顯色反應的結果來看，苯酚—硫酸反應和斐林試劑反應成陽性，表明菊糖是還原性多糖。茚三酮反應、碘—碘化鉀反應、雙縮脲反應均為陰性，表明菊糖中不含蛋白質(zhì)和淀粉。

2.2.6 紅外光譜分析結果

以響應面法優(yōu)化菊芋菊糖提取工藝所得參數(shù)對菊糖進行提取后，將所得菊糖充分干燥,掃描其紅外光譜，得到圖3。由圖3可以看出：3 384.85 cm-1處有一個很強的吸收峰，為締合羥基(0H)的伸縮振動吸收峰; 32 00～2 800 cm-1之間吸收峰較弱，是C—H的伸縮振動區(qū)，2 925.19 cm-1附近為亞甲基(C—H)對稱伸縮振動吸收峰：1 632.42 cm-1出現(xiàn)了較強的吸收峰，1 400～1 200cm-1出現(xiàn)的吸收峰是C—H的彎曲振動吸收峰；因C—O鍵的極性較大，紅外吸收峰較強，故在1 131.13 cm-1處為伯醇的吸收峰；環(huán)醚在1 260～780 cm-1出現(xiàn)兩個峰，高頻端為C—O—C的不對稱伸縮振動，低頻端為C—O—C的對稱伸縮振動，故圖中1 032.00 cm-1為呋喃環(huán)醚鍵(C—O—C)的伸縮振動，937.03 cm-1處吸收峰為果糖基呋喃環(huán)的對稱伸縮振動；900 cm-1以下的指紋區(qū)還存在較多密集而復雜的吸收峰，許多峰難以歸屬，但可以反應具體化合物結構上的微小差別。

圖3 菊糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of inulin

3 結論

本實驗在單因素實驗的基礎上，通過響應面試驗設計方法考察了液固比、提取時間、提取溫度對菊芋菊糖提取率的影響。根據(jù)二次回歸方程優(yōu)化得菊芋菊糖的最佳提取工藝為: 液固比18∶1(mL·g-1)、提取時間41 min、提取溫度86℃。回歸分析和實驗結果表明，在該工藝條件下，提取率為40.56%，與預測值40.74%較接近。通過紅外檢測初步分析了菊糖的結構，包括菊糖中各種顯著的官能團。利用熱水浸提法提取菊芋中菊糖的方法，實驗步驟少，操作簡單，經(jīng)濟高效，可以在相關的工業(yè)生產(chǎn)中進行推廣和應用。

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National Key Technology R&D Program of the Ministry of Science and Technology of China

introduction：LIU Yan(1990—),female,master,Mainly engaged in the Development and Utilization of Plant Resources research.

date:2015-11-03

ExtractionProcessOptimizationofInulinfromHelianthustuberosusL.byResponseSurfaceMethodology

LIU Yan1,2CHEN Xiao-Yin1YANG Li-Li1XIE Rui1HE Nan1ZHANG Ji1,2*

(1.College of Life Science,Northwest Normal University, Lanzhou 730070；2.Research Center For Gansu Distinctive Plants,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)

Single-factor tests and response surface method (RSM) were used to optimize the extraction process ofHelianthustuberosusL. inulin in tubers．In order to obtain the maximum of extraction yield of the inulin, three main factors including liquid-solid ratio, extraction times and extraction temperature were selected with the Design Expert V8.0 design, and a quadric regression equation for predicting the yield of inulin was established. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows: liquid-solid ratio of 18∶1(mL·g-1), extraction time of 41 min and extraction temperature of 85℃. Under the conditions, the optimum extracting yield of inulin was 40.56%, which is well matched with the predictive extracting yield of 40.74%. Under the process, we carried out the rough inulin and analyzed extraction of the inulin by infrared spectrum with the simple and low cost process.

HelianthustuberosusL.;inulin;response surface methodology;extraction process

國家科技支撐計劃(2012BAD20B06)；國家自然基金(31200255)

劉燕(1990—)，女，碩士研究生，主要從事植物資源的開發(fā)與利用方面的研究。

* 通信作者：E-mail：1156479951@qq.com

2015-11-03

* Corresponding author：E-mail：1156479951@qq.com

TS244+.1

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10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.020