羽衣甘藍(lán)不同組織及柱頭發(fā)育實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

李 晗 李治龍 李曉嶼 李玉花 藍(lán)興國(guó)

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

羽衣甘藍(lán)不同組織及柱頭發(fā)育實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

李 晗 李治龍 李曉嶼 李玉花 藍(lán)興國(guó)*

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

以羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephala)S13-bS13-b自交不親和系為試材，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內(nèi)參基因在不同組織和5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期柱頭的表達(dá)情況，并運(yùn)用geNorm和BestKeeper軟件統(tǒng)計(jì)分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。在不同組織中，geNorm軟件統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明Tub-α6和EF-1β的表達(dá)較穩(wěn)定；BestKeeper軟件統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明Ubc7和Tub-α6的表達(dá)較穩(wěn)定。在不同發(fā)育柱頭中，geNorm軟件統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明Actin和Ubc7的表達(dá)較穩(wěn)定；BestKeeper軟件統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明EF-1β和Tub-α6的表達(dá)較穩(wěn)定。以篩選到的內(nèi)參基因Tub-α6和Actin，分別分析羽衣甘藍(lán)柱頭S-位點(diǎn)糖蛋白基因(SLG)在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期柱頭的表達(dá)水平，結(jié)果顯示出SLG主要在柱頭中表達(dá)，而且SLG在柱頭發(fā)育成熟時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最高。

羽衣甘藍(lán)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；內(nèi)參基因；柱頭發(fā)育；SLG

羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephala)屬于十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)植物，由于其葉色彩鮮艷且頭部形狀酷似牡丹，被稱為“葉牡丹”[1]。由于其具有較強(qiáng)的耐寒性，是我國(guó)北方重要的綠化觀賞植物[2～3]。在育種方面，由于羽衣甘藍(lán)大部分栽培品種都具有自交不親和性(Self-incompatibility，SI)，人們?cè)谟N過(guò)程中主要采用SI系進(jìn)行羽衣甘藍(lán)雜交種的生產(chǎn)[4]。

在蕓薹屬植物SI上的研究發(fā)現(xiàn)，SI反應(yīng)與柱頭的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[5]。而且，SI相關(guān)的SLG(S-locus glycoprotein)、SRK(S-locus receptor kinase)、MLPK(M-locus protein kinase)和ARC1(Armadillo Repeat-Containing protein 1)基因表達(dá)具有柱頭組織表達(dá)特異性，并且與柱頭發(fā)育成熟性正相關(guān)[6～13]。因此，定量分析基因在不同組織及柱頭發(fā)育階段表達(dá)的水平，對(duì)于闡述基因在SI及柱頭發(fā)育方面的功能是十分重要的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)是近些年來(lái)發(fā)展的一種定量分析基因表達(dá)的方法[14～15]。由于該方法重復(fù)性好、定量精確及高通量等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)研究。在本研究中，我們選擇了Actin、Cpi6(cysteine proteinase inhibitor 6)、EF-1β(elongation factor 1-beta)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、Tub-α3(tubulin alpha-3)、Tub-α6(tubulin alpha-6)、Ubc7(ubiquitin conjugating enzyme7)候選內(nèi)參基因，通過(guò)geNorm[16]和BestKeeper[17]軟件統(tǒng)計(jì)分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，以期篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,為進(jìn)一步開(kāi)展基因表達(dá)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2014年2～6月在東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephala)自交不親和系(S13-bS13-b)由東北林業(yè)大學(xué)花卉生物工程研究所提供。選取羽衣甘藍(lán)的根、嫩莖、嫩葉、當(dāng)天開(kāi)花未散粉的柱頭、花柱、子房、花藥、花瓣為不同組織材料，選取不同花蕾長(zhǎng)度(0～4、4～6、6～8、8～10、>10 mm)的柱頭為不同發(fā)育時(shí)期材料，液氮速凍后保存于-80℃冰箱內(nèi)。

Phase Lock GelTM(PLG)Heavy、TRIzol A+購(gòu)自天根生化科技有限公司；Premix exTaqDNA聚合酶、dNTP購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNaseⅠ，RNase-free購(gòu)自Thermo公司；High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)96孔板、光學(xué)膜、Power SYBY? Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司；RNase Inhibitor購(gòu)于哈爾濱歐比特科技開(kāi)發(fā)有限公司；熒光定量PCR所用機(jī)器為ABI 7500。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)

依據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內(nèi)參基因和SLG13-b引物，相關(guān)信息在表1。

表1 羽衣甘藍(lán)候選內(nèi)參基因和SLG引物及相關(guān)信息

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

將羽衣甘藍(lán)材料于液氮中迅速研磨，將研磨好的材料放于700 μL TRIzol A+中；勻漿樣品在室溫下震蕩15 min；將Phase Lock GelTM(PLG)置于離心機(jī)中，12 000×g離心30 s；將勻漿樣品轉(zhuǎn)入離心后的PLG中，加入140 μL氯仿，劇烈震蕩10 min；4℃，12 000×g離心15 min；將PLG上層含有RNA的水相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的RNase Free離心管；向得到的水相加入等體積異丙醇，徹底混合均勻，室溫放置30 min；4℃，12 000×g離心10 min；棄掉上清，加入75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌；4℃，7 500×g離心5 min；室溫放置晾干，加入適量RNase Free H2O充分溶解RNA。利用NanoDrop2000超微分光光度計(jì)(Thermo公司)測(cè)定OD260/280值，檢測(cè)RNA的濃度和純度，并將RNA濃度調(diào)整為1 μg·μL-1。使用DNaseⅠ去除基因組DNA：RNA 1 μL(1μg·μL-1)、10×reaction buffer with MgCl21 μL、DNaseⅠ 1 U、RNase-free Water 7 μL，反應(yīng)條件為37℃，30 min，加入EDTA(50 mmol·L-1)1 μL，65℃，10 min；利用去除基因組DNA的羽衣甘藍(lán)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，其中10×RT Buffer 2 μL、25×dNTP Mix(100 mmol·L-1)0.8 μL、10×RT Random Primers 2 μL、MultiScribeTMReverse Transcriptase 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、Nuclease-free H2O 2.2 μL、上述去基因組RNA 11 μL。反應(yīng)條件為25℃，10 min；37℃，120 min；85℃，5 min。

1.4 目的基因片段的PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體積20 μL，其中Premix exTaq為10 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、cDNA 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.5 qRT-PCR分析

取10 μL反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋于200 μL ddH2O中作為反應(yīng)模板。反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中SYBR Green Mix(ABI)10 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL、稀釋后cDNA 8.4 μL。95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸1 min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，溶解曲線分析：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和2次技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用geNorm軟件和BestKeeper軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將候選基因的Ct值用Microsoft Excel計(jì)算出2-ΔCT值并輸入geNorm軟件，計(jì)算得出平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M值。M值小于1.5的基因被認(rèn)為表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，且M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定，反之則不穩(wěn)定；根據(jù)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析Vn/n+1判定內(nèi)參基因合適的數(shù)目[16]。BestKeeper軟件將Ct值輸入程序，獲得標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和調(diào)節(jié)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差SD[±x-fold]，其值越小則表示越穩(wěn)定，越大則表示越不穩(wěn)定(Pfaffl 2001)。計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的方法為2-ΔΔCT法，默認(rèn)擴(kuò)增效率E為2，ΔCt=Ct樣品-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt最小-ΔCt樣品[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽衣甘藍(lán)柱頭及組織RNA的提取

分別提取不同發(fā)育階段的柱頭及根、莖、葉、花柱、子房、花藥和花瓣的RNA。OD260/280值均在1.8～2.0。瓊脂糖凝膠電泳顯示，柱頭RNA良好無(wú)明顯降解(圖1)，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 羽衣甘藍(lán)柱頭總RNA的電泳檢測(cè)Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA from stigmas in B.oleracea var. acephala

2.2 候選內(nèi)參基因的RT-PCR擴(kuò)增分析

提取大于10 mm花蕾內(nèi)的柱頭RNA，去除基因組DNA后，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。分別對(duì)Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內(nèi)參基因進(jìn)行PCR，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示出，擴(kuò)增出的內(nèi)參基因條帶單一，并與預(yù)期結(jié)果一致(圖2，表1)。說(shuō)明各候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增條帶特異性較好，可以用于qRT-PCR的分析。

圖2 7個(gè)候選內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of 7 candidate reference genes M.DL1000; 1.Cpi6; 2.GAPDH; 3.Tub-α6; 4.Tub-α3; 5.EF-1β; 6.Actin; 7.Ubc7

2.3 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR表達(dá)分析

分別對(duì)Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。圖3顯示在不同發(fā)育階段的柱頭樣品中，7個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線有明顯的單一峰。而且，圖4顯示出擴(kuò)增曲線良好，可以滿足qRT-PCR的要求。7個(gè)候選內(nèi)參基因在羽衣甘藍(lán)不同組織中表達(dá)的Ct值在17～31間，其中GAPDH表達(dá)量較高，Ubc7表達(dá)量較低(圖5:A)；在不同發(fā)育時(shí)期的柱頭中，也發(fā)現(xiàn)GAPDH表達(dá)量較高，Ubc7表達(dá)量較低(圖5:B)。

圖3 7個(gè)候選內(nèi)參基因的溶解曲線Fig.3 Melting curves of 7 candidate reference genes A.Actin; B.Cpi6; C.EF-1β; D.GAPDH; E.Tub-α3; F.Tub-α6; G.Ubc7

圖4 7個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves of 7 candidate reference genes A.Actin; B.Cpi6; C.EF-1β; D.GAPDH; E.Tub-α3; F.Tub-α6; G.Ubc7

圖5 7個(gè)候選基因在不同組織(A)和不同發(fā)育時(shí)期柱頭(B)的Ct值變化 T1～T8分別代表根、莖、葉、柱頭、花柱、子房、花藥和花瓣；S1～S5分別代表花蕾大小在0～4、4～6、6～8、8～10 mm和大于10 mm的柱頭 下同。Fig.5 The Ct value of 7 candidate reference genes in different tissues(A) and developmental stigmas(B) of ornamental kale T1-T8 represented root,stem,leaf,stigma,style,ovule,anther and petal; S1-S5 represented stigma at different bud size,with S1=0-4 mm bud size,S2=4-6 mm bud size,S3=6-8 mm bud size,S4=8-10 mm bud size,S5=over 10 mm bud size The same as below.

2.4不同組織候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)分析

為了篩選羽衣甘藍(lán)不同組織的最佳內(nèi)參基因，首先采用geNorm軟件對(duì)7個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。將7個(gè)候選基因的Ct值用Microsoft Excel計(jì)算出2-ΔCT值并輸入geNorm軟件，計(jì)算得出平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M值。M值小于1.5的基因被認(rèn)為表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，且M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定。圖6A的結(jié)果表明表達(dá)穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因順序?yàn)門ub-α6/EF-1β(0.69)>Actin(0.74)>Ubc7(0.79)>Cpi6(0.82)>Tub-α3(0.91)>GAPDH(0.98)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明Tub-α6和EF-1β是表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而GAPDH表達(dá)最不穩(wěn)定。此外，通過(guò)geNorm軟件計(jì)算出配對(duì)變異值Vn/n+1。Vn/n+1為選擇閾值，即當(dāng)Vn/n+1<0.15時(shí)，n個(gè)基因即可滿足內(nèi)參基因的要求。圖6B的結(jié)果顯示出V4/5為0.144，即需要選擇4個(gè)內(nèi)參基因Tub-α6、EF-1β、Actin和Ubc7。

圖6 不同組織候選內(nèi)參基因的M值(A)和V值(B)Fig.6 M values(A) or V values(B) of reference genes indifferent tissues by geNorm analysis

BestKeeper軟件是以標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和調(diào)節(jié)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差SD[±x-fold]來(lái)評(píng)判基因的表達(dá)穩(wěn)定性，其值越小則表示越穩(wěn)定，越大則表示越不穩(wěn)定。如表2所示，在羽衣甘藍(lán)不同組織中7個(gè)候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性為順序?yàn)閁bc7(0.41)>Tub-α6(0.43)>Actin(0.58)>Tub-α3(0.68)>EF-1β(0.72)>Cpi6(0.92)>GAPDH(1.00)，這結(jié)果表明BestKeeper軟件默認(rèn)Ubc7和Tub-α6是較為穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因。綜合geNorm軟件和BestKeeper軟件分析的結(jié)果，認(rèn)為Tub-α6是羽衣甘藍(lán)不同組織中表達(dá)穩(wěn)定的最佳候選內(nèi)參基因。

2.5不同發(fā)育時(shí)期柱頭內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)分析

為了分析羽衣甘藍(lán)不同發(fā)育時(shí)期柱頭的最佳候選內(nèi)參基因，采用geNorm軟件對(duì)7個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。圖7A的結(jié)果表明表達(dá)穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因順序?yàn)锳ctin/Ubc7(0.193)>Cpi6(0.330)>Tub-α6(0.436)>EF-1β(0.486)>Tub-α3(0.530)>GAPDH(0.577)。這個(gè)結(jié)果表明Actin和Ubc7是表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。而且所有的V值均小于0.15，因此認(rèn)為選擇Actin和Ubc7兩個(gè)內(nèi)參基因可滿足穩(wěn)定性需求(圖7B)。此外，BestKeeper軟件分析結(jié)果7個(gè)候選基因穩(wěn)定性順序?yàn)镋F-1β(0.33)>Tub-α6(0.35)>Cpi6(0.36)>Actin(0.41)>GAPDH(0.41)>Tub-α3(0.45)>Ubc7(0.51)，其中表達(dá)較為穩(wěn)定的是EF-1β和Tub-α6(表3)，且所有候選基因均符合內(nèi)參穩(wěn)定性要求即std dev[±CP]小于1。綜合geNorm軟件和BestKeeper軟件分析的結(jié)果，認(rèn)為Actin是羽衣甘藍(lán)柱頭發(fā)育時(shí)期中表達(dá)穩(wěn)定的最佳候選內(nèi)參基因。

表2利用BestKeeper軟件對(duì)羽衣甘藍(lán)不同組織7個(gè)候選內(nèi)參基因的統(tǒng)計(jì)分析

Table2SummarystatisticsgeneratedbytheBestKeeperanalysisfor7candidatereferencegenesinthedifferenttissuesofornamentalkale

Ubc7Tub?α6ActinTub?α3EF?1βCpi6GAPDHn8888888geoMean[CP]28．7319．6825．0720．0222．5720．8018．09arMean[CP]28．7419．6825．0820．0422．5820．8318．13min[CP]27．7818．8224．1818．6021．2519．1316．73max[CP]29．9520．9725．9521．2223．7121．9220．18stddev[±CP]0．410．430．580．680．720．921．00CV[%CP]1．422．182．323．383．204．415．53min[x-fold]-1．94-1．81-1．86-2．68-2．50-3．19-2．57max[x-fold]2．322．451．832．312．202．174．26stddev[±x-fold]1．331．351．501．601．651．892．00Stabilityrank1234567

表3利用BestKeeper軟件對(duì)羽衣甘藍(lán)不同發(fā)育時(shí)期柱頭組織7個(gè)候選內(nèi)參基因的統(tǒng)計(jì)分析

Table3SummarystatisticsgeneratedbytheBestKeeperanalysisfor7candidatereferencegenesinthedifferentdevelopmentalstigmasofornamentalkale

EF?1βTub?α6Cpi6ActinGAPDHTub?α3Ubc7n5555555geoMean[CP]23．4920．6518．3625．6124．1721．8030．30arMean[CP]23．4920．6518．3625．6224．1721．8130．31min[CP]23．1920．2517．8624．9223．5621．3129．53max[CP]24．3121．3618．7526．0324．8722．6330．83stddev[±CP]0．330．350．360．410．410．450．51CV[%CP]1．401．671．981．581．702．041．67min[x-fold]-1．23-1．32-1．41-1．61-1．53-1．40-1．71max[x-fold]1．771．641．311．341．631．781．45stddev[±x-fold]1．261．271．291．321．331．361．42Stabilityrank1234567

圖7 不同發(fā)育時(shí)期柱頭候選內(nèi)參基因的M值(A)和V值(B)Fig.7 M values(A) or V values(B) of reference genes in different developmental stigmas by geNorm analysis

圖8 SLG基因在不同組織(A)和不同發(fā)育階段柱頭(B)的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of SLG gene in different tissues(A) and developmental stigmas(B) of ornamental kale

2.6SLG在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期柱頭的表達(dá)分析

SLG基因表達(dá)具有柱頭組織表達(dá)特異性，并且與柱頭發(fā)育成熟性正相關(guān)[6～7]。因此，通過(guò)對(duì)SLG的表達(dá)分析可以驗(yàn)證篩選到的內(nèi)參基因的可行性。在不同組織中，以候選基因Tub-α6作為內(nèi)參基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLG主要在柱頭組織中表達(dá)并且表達(dá)量是其它組織表達(dá)量的1 000倍左右(圖8:A)；在不同發(fā)育時(shí)期的柱頭中，以候選基因Actin作為內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)SLG主要隨著柱頭的成熟而表達(dá)量增高，而且在柱頭接近成熟的時(shí)候(8～10 mm大小的花蕾)達(dá)到表達(dá)量高峰(圖8:B)。上述結(jié)果說(shuō)明，在羽衣甘藍(lán)不同組織和不同發(fā)育時(shí)期柱頭的熒光定量PCR研究中，可以采用Tub-α6和Actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行分析。

3 討論

在qRT-PCR分析中，內(nèi)參基因的選擇是定量分析的前提[19]。目前，GAPDH[20]、Actin[21]、18s rRNA[22]、EF-1α(elongation factor 1-alpha)[23]、ubiquitin[24]等是目前常被選擇的內(nèi)參基因。而且發(fā)現(xiàn)，在不同物種或同一物種的不同組織選擇的內(nèi)參基因可能會(huì)不同，如在擬南芥不同組織、發(fā)育及脅迫反應(yīng)中選擇的最佳內(nèi)參基因不同[25～27]；在白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)花芽發(fā)育中表達(dá)最穩(wěn)定的基因是Tubulin和GAPDH[28]，而在不同干旱條件下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Actin和GAPDH[29]。此外，在內(nèi)參基因篩選統(tǒng)計(jì)分析中，目前主要采用geNorm、Bestkeeper和Normfinder[30]等軟件。這些軟件主要采取不同的統(tǒng)計(jì)算法對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。在本文的研究中，候選基因Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7的表達(dá)水平在不同組織中差異較大，但在不同發(fā)育時(shí)期柱頭中表達(dá)情況基本穩(wěn)定(圖5)。采用geNorm和Bestkeeper兩種軟件對(duì)候選基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在不同組織表達(dá)分析中，geNorm軟件將Tub-α6和EF-1β排在最穩(wěn)定的位置，Bestkeeper軟件將Ubc7和Tub-α6排在比較穩(wěn)定的位置，由于兩個(gè)軟件內(nèi)參穩(wěn)定性的算法不同，因此內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序不同是可能的，最終認(rèn)為Tub-α6是不同組織中最佳的內(nèi)參基因；在不同發(fā)育階段的柱頭中，geNorm軟件將Actin和Ubc7排在最穩(wěn)定的位置，Bestkeeper軟件將EF-1β和Tub-α6排在比較穩(wěn)定的位置，且所有的候選基因均符合內(nèi)參穩(wěn)定性要求即std dev[±CP]小于1，最終認(rèn)為在不同發(fā)育時(shí)期柱頭中最佳內(nèi)參基因是Actin。

利用篩選到的內(nèi)參基因?qū)LG在不同組織和不同發(fā)育階段的柱頭進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)SLG在柱頭中的表達(dá)量是其它組織表達(dá)量1 000倍左右，而且也發(fā)現(xiàn)SLG在柱頭接近成熟時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，這個(gè)研究結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果較為一致，同時(shí)也說(shuō)明了篩選的內(nèi)參基因可以應(yīng)用到其它目標(biāo)基因的定量表達(dá)分析中。這些研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)對(duì)基因在不同組織及柱頭發(fā)育階段的表達(dá)研究，提供了更多的線索。

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Central Universities Fundamental Research Special Fund Project(DL13CA13)；National Natural Science Foundation of China(31070275)

introduction：Li Han(1991—),female,master student,mainly engaged in plant developmental biology.

date:2015-12-17

SelectionofReferenceGenesforReal-timeFluorescenceQuantitativePCRinDifferentTissuesandStigmaDevelopmentfromOrnamentalKale

LI Han LI Zhi-Long LI Xiao-Yu LI Yu-Hua LAN Xing-Guo*

(College of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

We used real-time quantitative polymerase chain reaction to test the expression ofActin, cysteine proteinase inhibitor 6(Cpi6), elongation factor 1-beta(EF-1β), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), tubulin alpha-3(Tub-α3), tubulin alpha-6(Tub-α6) and ubiquitin conjugating enzyme7(Ubc7), and then identified the most suitable reference genes in a given set of tissues and different developmental stigmas of ornamental kale(Brassicaoleraceavar.acephala)S13-bS13-bhomozygotes by using the geNorm and BestKeeper software programs. By a geNorm analysis,Tub-α6 andEF-1βwere the most suitable reference genes among the given set of tissues, andActinandUbc7 were the most stable genes during stigma development. By a BestKeeper analysis,Ubc7 andTub-α6 were the most suitable reference genes among the given set of tissues, andEF-1βandTub-α6 were the most stable genes during stigma development.Tub-α6 andActinwere the most suitable reference genes among the given set of tissues and during stigma development, respectively. Furthermore, the expression ofSLGnormalized withTub-α6 orActinshowed thatSLGwas predominantly expressed in stigma among the given set of tissues and reached its highest level at approaching anthesis during stigma development.

Brassicaoleraceavar.acephala；real-time quantitative PCR；reference genes；stigma development；SLG

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(DL13CA13)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070275)

李晗(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:lanxingguo@126.com

2015-12-17

* Corresponding author：E-mail:lanxingguo@126.com

S635

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.012