山桐子(Idesia polycarpa Maxim)果實(shí)多酚的抗炎、抗菌活性研究

昝 鵬 張 琳 祖元?jiǎng)?楊 磊 叢 贏

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim)果實(shí)多酚的抗炎、抗菌活性研究

昝 鵬 張 琳*祖元?jiǎng)?楊 磊 叢 贏

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

多酚類物質(zhì)是植物體中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為充分利用山桐子果實(shí)，將果實(shí)中多酚類物質(zhì)提取出來，并對(duì)其抗炎、抗菌效果進(jìn)行研究。利用LSP誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，經(jīng)不同濃度給藥后對(duì)MTT、細(xì)胞產(chǎn)生NO量進(jìn)行測(cè)定；選取糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，判斷抑菌效果。結(jié)果表明：山桐子果實(shí)中總多酚含量為6.6 mg·g-1；給藥組濃度依次為50、100和200 μg·mL-1，隨著給藥濃度的增加RAW264.7細(xì)胞活力值也在增大，NO釋放量隨著給藥濃度的升高降低，山桐子果實(shí)多酚對(duì)選取的三種細(xì)菌抑菌能力由強(qiáng)到弱為：枯草芽孢桿菌>沙門氏菌>糞腸球菌。

山桐子果實(shí)；多酚；抗炎；抗菌

山桐子(IdesiapalycarpaMaxim)是大風(fēng)子科(Flacourtiaceae)山桐子屬(Idesia)多年生木本植物。山桐子是高大落葉喬木，生長環(huán)境集中在我國秦嶺以南及淮河一帶[1～2]，其對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)生長土壤的要求并不嚴(yán)格，可耐旱耐貧瘠。山桐子外型美觀可在城市綠化方面作為優(yōu)良樹種，其果實(shí)產(chǎn)量極高，果實(shí)中含有較多油脂，多做生物柴油的原料，以減輕對(duì)石油需求的壓力[3]。此外，山桐子油的安全性被越來越多的人認(rèn)可，油中富含不飽和脂肪酸和亞油酸[4]，如今已經(jīng)走進(jìn)亞洲許多國家的餐桌[5]。山桐子果實(shí)提取油脂后剩余大量的果實(shí)殘?jiān)?，而殘?jiān)卸喾宇愇镔|(zhì)利用較少。

植物的果實(shí)中含有的多酚類物質(zhì)具有多種生物活性。有研究表明，胡桃楸多酚對(duì)亞硝酸根離子具有較強(qiáng)的抗氧化活性[6]；Lamothe S[7]等在茶多酚中發(fā)現(xiàn)兒茶素和單寧類的抗氧化活性較強(qiáng)；Kazeem等[8]研究得出姜多酚具有抗氧化能力；多酚氧化活性迷迭香多酚>可可多酚>橄欖油多酚[9]。多酚類物質(zhì)還有較強(qiáng)的抗癌活性，有文獻(xiàn)報(bào)道多酚的抗癌功效在癌癥的各個(gè)階段都有存在[10]，Korkina L.G[11]等認(rèn)為天然植物多酚可用于藥妝方面，且不損傷正常細(xì)胞的同時(shí)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；除此之外，多酚類化合物還可防治糖尿病[12]、抗炎[13]、治療心腦血管疾病[14～15]，臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蘋果多酚可以有效降低血漿中TC、LDL-C水平[16]。山桐子果實(shí)多酚的研究中，Seung Hyun Kim發(fā)現(xiàn)脫脂后的果渣中含有抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中NO生成的活性成分[17],另外還發(fā)現(xiàn)山桐子果實(shí)中的成分增加C2C細(xì)胞HSP70水平，使H2O2-induced氧化應(yīng)激抵抗能力增強(qiáng)[18]。

山桐子生長迅速，果實(shí)產(chǎn)量多果實(shí)油產(chǎn)量高，除了食用價(jià)值外，其果實(shí)中多酚類物質(zhì)的藥用價(jià)值更是不可忽略。本文擬對(duì)山桐子果實(shí)多酚的抗炎和抑菌效果進(jìn)行考察，確定其多酚類成分抗炎和抑菌效果，為尋找天然抗炎抗菌活性成分提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品

RAW264.7細(xì)胞由中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心購買提供；糞腸球菌購自中國微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基由杭州百思生物技術(shù)有限公司提供，NO試劑盒購自Griess；MTT購自Sigma，F(xiàn)BS購自Gibco，DMEM低糖培養(yǎng)基購自Hyclone等。

1.2 山桐子果實(shí)多酚的提取

脫脂：將飽滿的山桐子果實(shí)在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)低溫烘干粉碎后過60目篩，按照料液比1∶20加入正己烷，25℃恒溫震蕩24 h，抽濾后將溶液與果實(shí)粉末分別收集，再按照料液比1∶10加入正己烷，恒溫條件下繼續(xù)震蕩24 h，抽濾后取濾渣低溫烘干[19]。

多酚提取：準(zhǔn)確稱取脫脂后干燥的粉末10 g，置于三角燒瓶內(nèi)，向三角燒瓶中加入100 mL酸化甲醇溶液[20]，超聲儀中振蕩1 h后離心收集上清，濾渣重復(fù)上述操作。合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收濾液中的有機(jī)溶劑，粗提液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多酚含量檢測(cè)

根據(jù)福林—肖卡法原理，將粗提液與福林肖卡試劑及碳酸鈉溶液混勻，避光反應(yīng)后765 nm比色法測(cè)定吸光度值，空白調(diào)零，每個(gè)樣品重復(fù)三次，結(jié)果以沒食子酸等價(jià)值表示。設(shè)置沒食子酸濃度梯度為1、2、4、6、8、10 mg·mL-1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞置于含10%FBS和1%雙抗的DMEM低糖培養(yǎng)基，溫度37℃，CO2濃度5%。定期觀察細(xì)胞形態(tài)并更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 脂多糖(LPS)誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥及藥物刺激

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后細(xì)胞移入96孔板，將細(xì)胞濃度調(diào)整到1.0×104個(gè)/mL，各孔中用培養(yǎng)基定容至100 μL。加LPS使每孔終濃度為1 μg·mL-1，24 h后吸出培養(yǎng)基，經(jīng)PBS清洗后將細(xì)胞板分組，各孔按給藥量刺激后用培養(yǎng)基定容至100 μL繼續(xù)于37℃、CO25%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.6 RAW264.7細(xì)胞活力檢測(cè)

RAW264.7細(xì)胞分為五組，分別為不添加任何藥物的空白組、陽性對(duì)照選擇20 μg·mL-1地塞米松和山桐子多酚50、100、200 μg·mL-1組，經(jīng)1.5步驟后藥物作用24 h，每孔中加20 μg 0.5% MTT，孵育4 h，再加入100 μL DMSO震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)。細(xì)胞活力以溶劑對(duì)照為100%，按下式計(jì)算細(xì)胞活力：

1.7 RAW264.7細(xì)胞分泌NO含量的測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞分為五組，分別為不添加任何藥物的空白組、陽性對(duì)照選擇20 μg·mL-1地塞米松和山桐子多酚50、100、200 μg·mL-1組，按照1.5方法處理后，1 000 g離心15 min，取50 μL上清到細(xì)胞板中，將Griess試劑A 50 μL加入上清中，室溫避光靜置5 min，再加入50 μL試劑B，室溫避光靜置10 min，540 nm檢測(cè)吸光度值并繪制NO標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 細(xì)菌培養(yǎng)基的配制及菌種選擇與活化

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g，蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉1 g，瓊脂粉18～20 g，加入1 L蒸餾水，加熱煮沸，直到完全溶解，用1%氫氧化鈉和50%檸檬酸鈉調(diào)節(jié)其pH至7.4～7.6，121℃高壓滅菌15 min后備用。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基：取其43 g，瓊脂粉18～20 g，加入1 L蒸餾水，加熱煮沸，直到完全溶解，121℃高壓滅菌15 min后備用。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉18～20 g，加入1 L蒸餾水，加熱煮沸，直到完全溶解，用1%氫氧化鈉和50%檸檬酸鈉調(diào)節(jié)其pH至7.4～7.6，121℃高壓滅菌15 min后備用。

菌種購自菌種保藏中心的凍干粉，無菌條件下，溶解安瓿瓶中凍干粉，吸出菌液接種到固體培養(yǎng)基中，在37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h。在已活化的菌種培養(yǎng)基中刮取少量菌種，接種到相對(duì)應(yīng)的無菌液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃下?lián)u床中培養(yǎng)18～24 h。

1.9 抑菌圈的測(cè)定

將直徑6 mm的圓形濾紙片121℃ 20 min滅菌。移液槍吸取200 μL菌懸液均勻涂布于平板中，無菌鑷取滴加5 μL 50 μg·mL-1果實(shí)多酚的濾紙片呈倒三角放置于平板，無果實(shí)多酚的濾紙片為空白對(duì)照，培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。每種菌平行3組計(jì)算抑菌圈直徑。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用DUNCAN檢測(cè)，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 山桐子果實(shí)多酚總量測(cè)定

根據(jù)方法1.3步驟，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1～10 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.102 2X-0.014 7，R2=0.998 3。根據(jù)回歸方程計(jì)算，山桐子果實(shí)的多酚含量為6.6 mg·g-1。

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

山桐子果實(shí)多酚與RAW264.7細(xì)胞作用后細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果如圖1。

圖1 山桐子果實(shí)多酚對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力值的影響Fig.1 Effect of polyphenols in I.palycarpa fruit on LPS induced RAW264.7 cells viability

圖1結(jié)果表明，給藥組中各劑量均對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力產(chǎn)生一定影響，在50～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，山桐子果實(shí)多酚增強(qiáng)了RAW264.7細(xì)胞的活力，對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有毒性。與空白組比較，地塞米松組活力值最高；給藥組中，當(dāng)給藥劑量為200 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力值達(dá)到141%與地塞米松組細(xì)胞活力值相近；劑量為50和100 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞活力值也表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)。因此在給藥濃度50～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加，山桐子果實(shí)多酚對(duì)LPS誘導(dǎo)處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞炎癥消除程度逐漸增強(qiáng)。

2.3山桐子果實(shí)多酚對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO釋放的影響

已經(jīng)證實(shí)植物生理活動(dòng)中，NO在植物對(duì)生物與非生物的防御中有至關(guān)重要的作用[21]。動(dòng)物體中NO釋放決定了是否會(huì)影響正常細(xì)胞的代謝活動(dòng)。機(jī)體受到外界刺激，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生NO促進(jìn)抗炎因子合成，但NO過度積累會(huì)造成組織損傷[22～24]。

根據(jù)Griess試劑盒說明書，測(cè)定LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞中亞硝酸鹽含量。以亞硝酸鹽濃度與吸光度值(A)為橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.006 1X-0.002 0(R2=0.998 1)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各組細(xì)胞中亞硝酸鹽含量，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，給藥劑量在50～200 μg·mL-1范圍內(nèi)給藥劑量越小，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中亞硝酸鹽含量越高。當(dāng)給藥濃度變高時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞炎癥的抑制效果也在增強(qiáng)，細(xì)胞本身分泌的NO含量就會(huì)降低，在一系列的代謝過程中亞硝酸鹽的含量自然降低，當(dāng)給藥濃度在50 μg·mL-1時(shí)亞硝酸鹽含量在30%～35%，給藥濃度增至100 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞中亞硝酸鹽含量降低5%左右，當(dāng)達(dá)到200 μg·mL-1的給藥濃度時(shí)，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中亞硝酸鹽含量低至10%。結(jié)果說明給藥濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，NO產(chǎn)生量減少十分顯著。

2.4 山桐子果實(shí)多酚對(duì)細(xì)菌抑菌效果分析

近來大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)可參與細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)并與細(xì)胞受體相互作用[25～26]此外，其抗菌活性被開發(fā)成新型食物防腐劑[27]，也被利用在治療微生物感染的創(chuàng)新抗菌藥物方面[28～29]。將山桐子果實(shí)多酚分別作用于枯草芽孢桿菌、糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌三種細(xì)菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1山桐子果實(shí)多酚的抑菌效果

Table1AntibacterialeffectofpolyphenolsinI.palycarpafruit

序號(hào)No．菌種名稱Strains抑菌圈直徑Diameterofinhibitionzone(mm)1枯草芽孢桿菌Bacillussubilis15．38±0．542糞腸球菌Enterococcusfaecalis9．75±0．123鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium13．17±0．334空白對(duì)照Blankcontrol0．00±0．00

從表1可知，山桐子果實(shí)多酚對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性最強(qiáng)，其余依次是沙門氏菌、糞腸球菌。在同一計(jì)量濃度下對(duì)三種細(xì)菌抑菌性研究，雖然抑菌效果比較明顯，但是差異較大，枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑可達(dá)到15.38 mm，而糞腸球菌抑菌圈直徑僅為9.75 mm。推測(cè)出現(xiàn)差異的主要原因可能是由于每種菌對(duì)山桐子多酚類成分的敏感度不同造成，枯草芽孢桿菌在山桐子多酚類藥物作用下受到影響更大，而山桐子果實(shí)多酚對(duì)糞腸球菌作用不明顯。

3 討論

多酚指分子中含有多羥基酚類物質(zhì)的總稱。在植物體中，植物多酚含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是植物體中最豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，其主要作用是保護(hù)植株免受外界病原體侵害[30]。多酚可有效清除機(jī)體自由基成分，減少蛋白質(zhì)、核酸被氧化造成的組織功能障礙及免疫力下降誘發(fā)的多種疾病[31]，實(shí)驗(yàn)主要通過檢測(cè)細(xì)胞活力、檢測(cè)細(xì)胞中NO的釋放量及對(duì)部分細(xì)菌的抑制作用，初步判斷山桐子果實(shí)中的多酚成分具有一定的抗炎、抗菌療效，對(duì)山桐子果實(shí)多酚的進(jìn)一步開發(fā)利用有重要意義。

研究結(jié)果表明，在50～200 μg·mL-1給藥濃度范圍內(nèi)，炎癥細(xì)胞的活力值都有一定的增強(qiáng)，說明該濃度范圍山桐子果實(shí)多酚對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有毒性。通過比較發(fā)現(xiàn)在給藥濃度范圍內(nèi)的山桐子果實(shí)多酚對(duì)細(xì)胞活力值都有一定的影響，隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞活力值逐漸增高。

機(jī)體受到刺激后會(huì)產(chǎn)生防御反應(yīng)產(chǎn)生促炎因子，而促炎因子誘導(dǎo)機(jī)體釋放NO參與炎癥反應(yīng)，當(dāng)NO釋放過多時(shí)，催化機(jī)體內(nèi)抗炎因子大量釋放造成機(jī)體局部損傷[32]。利用山桐子果實(shí)中多酚成分，抑制促炎因子使機(jī)體NO釋放減少保護(hù)機(jī)體的同時(shí)達(dá)到治療炎癥的目的。通過Griess試劑盒結(jié)果得出，50～200 μg·mL-1給藥濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO均有不同程度的影響。

實(shí)驗(yàn)選取三種常見細(xì)菌枯草芽孢桿菌、糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌分別進(jìn)行抑菌效果研究，根據(jù)抑菌圈直徑判斷山桐子果實(shí)多酚的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果實(shí)多酚對(duì)不同的細(xì)菌都有一定的抑菌效果，不同的細(xì)菌抑制效果不同。本文從細(xì)胞抗炎和細(xì)菌的抑制兩方面驗(yàn)證山桐子果實(shí)中多酚利用的可行性，從而為山桐子果實(shí)有效利用提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)方向。

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Special Fund for Forestry Scientific Research in the Public Interest(20140460202)

introduction：ZAN Peng(1989—),male,master,specializing in research and utilization of plant resources.

date:2016-06-04

Anti-inflammationandAntibacterialActivityofPolyphenolsinIdesiapolycarpaMaxim.Fruit

ZAN Peng ZHANG Lin*ZU Yuan-Gang YANG Lei CONG Ying

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Polyphenols are important secondary metabolites in plant. For full use of the fruit, polyphenols inLdesiapalycarpaMaxim fruit were extracted and the anti-inflammatory activity and antibacterial effect were studied. LSP-induced RAW264.7 inflammatory cells were treated with different concentration polyphenols and the anti-inflammatory effect was determined by MTT assays and NO amount of RAW264.7 cells.Enterococcusfaecalis,Bacillussubtilis,Salmonellatyphimuriumwere selected for antimicrobial experiment to analyze antibacterial activity. The content of polyphenols ofL.palycarpaMaxim fruit was 6.6 mg·g-1. Under the administration concentrations with 50, 100 and 200 μg·mL-1, along with the increase of administration concentration, RAW264.7 cells viability value was increased and the release of NO from RAW264.7 cells was also decreased. The antibacterial ability of polyphenols inL.palycarpafruit of selected three kinds of bacteria in the descending order ofB.subtilis,S.typhimuriumandE.faecalis.

Idesiapolycarpafruit;polyphenols;anti-inflammatory activity;antibacterial activity

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(20140460202)

昝鵬(1989—)，男，碩士研究生，主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。

* 通信作者：E-mail：zhanglin6600@sina.com

2016-06-04

* Corresponding author：E-mail：zhanglin6600@sina.com

Q949.759.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.021