蘋果生長素輸入載體MdAUX1的基因克隆及在擬南芥和煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化

安建平 王小非 劉 鑫 李浩浩 由春香 郝玉金

(山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，泰安 271018)

蘋果生長素輸入載體MdAUX1的基因克隆及在擬南芥和煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化

安建平 王小非 劉 鑫 李浩浩 由春香 郝玉金*

(山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，泰安 271018)

生長素的極性運輸對調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育起重要作用。生長素轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控生長素的極性運輸。本研究從‘嘎啦’(Malus×domestic‘Royal Gala’)蘋果中克隆了生長素輸入載體基因MdAUX1(基因序列號：MDP0000384437)。序列分析表明，該基因包含長為1 443 bp完整的開放閱讀框，編碼含有480個氨基酸的蛋白。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，AUX1在不同物種間具有高度的序列保守性，其中，蘋果MdAUX1與歐洲甜櫻桃PaAUX1親緣關系最近。半定量PCR分析顯示，MdAUX1在蘋果的莖中表達量較高。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)MdAUX1基因的擬南芥和煙草。轉(zhuǎn)基因擬南芥根系表型觀察結(jié)果顯示，MdAUX1基因在擬南芥中異位表達后，會抑制主根伸長，促進側(cè)根形成；在外源NAA處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥對主根伸長的抑制作用得到部分恢復。在煙草中過量表達MdAUX1基因能夠顯著促進植株地上部分生長。以上結(jié)果說明蘋果MdAUX1基因在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

蘋果；生長素輸入載體；MdAUX1；遺傳轉(zhuǎn)化

生長素是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。生長素的極性運輸是生長素區(qū)別于其他激素的重要特性，即生長素只能從植物體形態(tài)學的上端向下端運輸[1]。生長素的極性運輸存在于高等植物的莖，根和葉中，其運輸方向由轉(zhuǎn)運蛋白控制[2]。其中，生長素輸入載體在生長素濃度梯度的調(diào)控及維持中具有重要作用[3]。

AUX/LAX蛋白家族是目前已知的最主要的生長素輸入載體[4]，其中，AtAUX1是從擬南芥中分離到的第一個生長素輸入載體基因[5]。AtAUX1含有11個跨膜螺旋，是由485個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白[6]。Muller等[7]通過根向地性的恢復實驗，有力地證明了AtAUX1作為生長素輸入載體在生長素運輸過程中具有重要作用。此外，對花生、毛白楊以及水稻中生長素輸入載體功能也進行了研究。任怡怡[8]克隆了花生生長素載體基因PNAUX1，證實PNAUX1在植物體內(nèi)生長素的重新分配中發(fā)揮關鍵作用；閆輝[9]發(fā)現(xiàn)毛白楊生長素生長素輸入載體基因PeAUX1參與毛白楊根、莖、葉和花的發(fā)育；Zhao等[10]和Yu等[11]證明水稻生長素輸入載體基因OsAUX1在根系發(fā)育中發(fā)揮重要作用，超量表達OsAUX1抑制主根伸長，促進側(cè)根發(fā)育。此外，最新研究結(jié)果也顯示，AUX1在植物鹽堿和重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用[12～14]。

我國是全球蘋果最大的生產(chǎn)消費國，蘋果栽培無論是在面積、產(chǎn)量或是出口量方面多年均居世界首位，蘋果產(chǎn)業(yè)對于提高農(nóng)民收入、解決剩余勞動力以及帶動下游附加產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到了關鍵作用。當今蘋果生產(chǎn)過程中，為減少勞動力，節(jié)約成本，通常選用矮化砧木進行嫁接。但是矮化砧木有一個缺點，就是根系不發(fā)達，容易受到風雨沖擊。這影響了蘋果的生產(chǎn)，而生長素在調(diào)控根系發(fā)育過程中起著關鍵的作用[15]。為探明生長素輸入載體在蘋果生長發(fā)育中的作用，本實驗采用同源克隆的方法克隆了蘋果生長素輸入載體基因MdAUX1，成功構(gòu)建了MdAUX1過量表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)MdAUX1基因擬南芥和煙草。通過分析轉(zhuǎn)基因擬南芥根系表型以及轉(zhuǎn)基因煙草地上部分生長情況，初步揭示MdAUX1在植株生長發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

本實驗所用到的植物材料有嘎拉(Malus×domestic‘Royal Gala’)，擬南芥(ColumbiaCol-0)煙草(Nicotianatabacum)。嘎啦幼苗取自山東農(nóng)業(yè)大學南校區(qū)果樹試驗站，取樣時間為2015年7月至9月。檢測MdAUX1基因表達所用的組織包括生長根、幼莖、新生葉、初花時的花和花后30 d的幼果，取樣后用液氮速凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 MdAUX1的克隆和生物信息學分析

從蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.rosaceae.org/)中下載蘋果基因組信息。設計引物，MdAUX1-F:5′-CCACTCAATCTCTCTGCCAAT-3′,MdAUX1-R:5′-GACTGGTGAGAGGGAGAGT-3′,以從‘嘎啦’組培苗獲得的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應程序為：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃后延伸10 min，32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.25%的瓊脂糖凝膠進行電泳并回收目的條帶，連接pMD18-T克隆載體進行測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTp程序搜索同源基因。多序列比對分析采用DNAMAN軟件，系統(tǒng)進化樹用MEGA5.0軟件構(gòu)建。

1.3 半定量PCR分析

利用TRIZOL法分別提取‘嘎啦’根、莖、葉、花及果實的總RNA，根據(jù)大連寶生物公司PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)MdAUX1序列設計RT-PCR引物。MdAUX1(RT)-F：5′-ATGGACGACAGGGAGGAC-3′，MdAUX1(RT)-R：5′-GGAGGAGGAAGAGTCCAC-3′。選取18s(GenBank accession number CN938024)為內(nèi)參基因。PCR反應程序為：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；每個處理的樣品設3個生物學重復，1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 農(nóng)桿菌介導的擬南芥的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因擬南芥通過侵染擬南芥花序的方法獲得[16]。將MdAUX1全長連接到改造過的過量表達載體pCAMBIA 1300：35S載體上。利用農(nóng)桿菌介導法，將重組過量表達載體pCAMBIA 1300-MdAUX1轉(zhuǎn)入擬南芥中，經(jīng)過50 mg·L-1潮霉素Hyg抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過連續(xù)3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進行表型分析。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

轉(zhuǎn)基因煙草通過侵染煙草葉片的方法獲得。將野生型煙草葉片切成小塊，放置在預培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+3 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA)上培養(yǎng)1～2 d。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化侵染煙草葉片；隨后，將葉片轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+3 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+100 mg·L-1潮霉素+500 mg·L-1頭孢霉素)。PCR檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，收取種子，進行表型觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1蘋果生長素輸入載體基因MdAUX1的克隆及基因組結(jié)構(gòu)分析

以蘋果cDNA為模板，MdAUX1-F/R為引物，進行PCR擴增：獲得1 443 bp的特異條帶(圖1)。該基因編碼一個含480個氨基酸的蛋白質(zhì)。

圖1 蘋果MdAUX1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳 MdAUX1. MdAUX1基因擴增產(chǎn)物；Mark:分子量標記DM2000Fig.1 Electrophoresis of PCR products for cloning of MdAUX1 MdAUX1. PCR products of MdAUX1; Mark. DM2000

利用GDR數(shù)據(jù)庫(http://www.rosaceae.org/)分析MdAUX1基因的染色體位置和基因組結(jié)構(gòu)。如圖2所示，MdAUX1定位于蘋果基因組的第6號染色體上，由6個外顯子和5個內(nèi)含子構(gòu)成。

圖2 蘋果MdAUX1基因的染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)Fig.2 Chromosomal location and genomic structure of MdAUX1

2.2MdAUX1及其同源基因氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析

利用DNAMAN軟件和MEGA5.0軟件將蘋果MdAUX1蛋白序列(Malus×domestica，MDP0000384437)與擬南芥AtAUX1(Arabidopsisthaliana,NP_565882.1)、蕪菁BrAUX1(Brassicarapa,XP_009143423.1)、木麻黃CgAUX1(Casuarinaglauca,ABN81349.1)、水稻OsAUX1(Oryzasativa,EAY76542.1)、歐洲甜櫻桃PaAUX1(Prunusavium,CAI05895.1)、碧桃PpAUX1(Prunuspersica,XP_007205126.1)、豌豆PsAUX1(Pisumsativum,BAC98948.1)、蓖麻RcAUX1(Ricinuscommunis,XP_002526879.1)、醉蝶花ThAUX1(Tarenayahassleriana,XP_010529889.1)、葡萄VvAUX1(Vitisviniferal,XP_002279219.1)、梅花ZmAUX1(Prunusmume,XP_008233733.1)、百日草ZvAUX1(Zinniaviolacea,BAH47613.1)的蛋白序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。氨基酸序列比對結(jié)果(圖3)顯示，MdAUX1與其他AUX1蛋白在結(jié)構(gòu)域上保守性很高，MdAUX1蛋白含有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域(42-436 aa)。進化樹分析結(jié)果(圖4)顯示，蘋果MdAUX1與歐洲甜櫻桃PaAUX1親緣關系最近，具有同源性。

圖3 蘋果生長素輸入基因MdAUX1及其同源基因的氨基酸序列比對分析結(jié)果 跨膜結(jié)構(gòu)域用紅線標注。Fig.3 Sequence alignment of auxin influx transporter gene MdAUX1 in apple and its homologous The transmembrane domain is indicated with red marks.

圖4 蘋果生長素輸入基因MdAUX1及其同源基因的進化分析Fig.4 Evolution analysis of auxin influx transporter gene MdAUX1 in apple and its homologous

2.3 蘋果中MdAUX1基因表達模式分析

為探討蘋果MdAUX1基因在不同組織中的表達特性，在同一時間獲取各種蘋果組織，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈作為模板進行半定量PCR分析。結(jié)果(圖5)顯示，MdAUX1基因存在與蘋果所有的組織，在莖中表達量最高。

圖5 MdAUX1基因在蘋果不同組織中的表達分析Fig.5 Analysis of the expression of MdAUX1 gene in different tissues of apple

2.4MdAUX1過量表達載體的構(gòu)建及獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草

利用引物中引入的BamHⅠ和PstⅠ酶切位點，將MdAUX1基因從pMD18-T載體切出回收，并對pCAMBIA 1300進行同樣酶切，將兩者在16℃連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽性單菌落。成功構(gòu)建pCAMBIA-1300-MdAUX1植物過量表達載體(圖6)。

圖6 35S:MdAUX1結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 Schematic diagram of the 35S promoter:MdAUX1 construct

將構(gòu)建的MdAUX1過量表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，通過侵染擬南芥花序和煙草葉片的方法進行基因的遺傳轉(zhuǎn)化。半定量PCR分析檢測轉(zhuǎn)基因株系MdAUX1基因表達量。擬南芥L1，L2和L3轉(zhuǎn)基因株系以及煙草#1，#2和#3(圖7)被鑒定出來。

圖7 RT-PCR分析MdAUX1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥L1，L2,L3株系和轉(zhuǎn)基因煙草#1，#2，#3株系中的表達水平Fig.7 RT-PCR analysis of the expression level of MdAUX1 in L1,L2 and L3 transgenic Arabidopsis and #1,#2 and #3 transgenic tobacco

2.5擬南芥中異位表達MdAUX1基因影響植株根系發(fā)育

對獲得的MdAUX1轉(zhuǎn)基因擬南芥根系表型進行觀察。將萌發(fā)4天左右、長勢一致的擬南芥幼苗放置到同一培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)，繼續(xù)生長6天后，觀察根系表型。結(jié)果如圖8～9，相比于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度明顯受到抑制，側(cè)根數(shù)目顯著增加。說明MdAUX1基因在擬南芥中異位表達可以影響植株根系發(fā)育。

圖8 觀察生長10 d的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長情況Fig.8 Comparison of 10-day-old seedlings between the WT and transgenic lines

圖9 分析野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度和側(cè)根數(shù)目 *P<0.05，**P<0.01 下同。Fig.9 Analysis of primary roots length and lateral root number between the WT and transgenic lines *P<0.05，**P<0.01 The same as below.

生長素NAA可以通過擴散的方式進入植物細胞內(nèi)，而不依賴于生長素輸入載體。對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥進行NAA處理，結(jié)果(圖10～11)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥抑制主根伸長的表型變得不顯著。以上結(jié)果說明，蘋果生長素輸入載體基因MdAUX1在根系發(fā)育中發(fā)揮重要作用，超量表達MdAUX1抑制主根伸長，促進側(cè)根發(fā)育。

圖10 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在對照和NAA處理下根系表型觀察Fig.10 Phenotypic characterization of WT and transgenic lines under control and NAA treatments

圖11 分析野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在對照和NAA處理下主根長度Fig.11 Analysis of primary roots length between the WT and transgenic lines under control and NAA treatments

2.6 煙草中異位表達MdAUX1基因影響植株生長

對獲得的MdAUX1轉(zhuǎn)基因煙草植株生長狀況進行觀察。結(jié)果(圖12)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草生長狀況明顯優(yōu)于野生型。說明MdAUX1基因在煙草中異位表達可以影響植株地上部分的生長發(fā)育。

圖12 觀察野生型和轉(zhuǎn)基因煙草生長情況Fig.12 Analysis of the growth conditions between the WT and transgenic tobacco

3 討論

生長素的梯度分布影響植物生長發(fā)育和植株形態(tài)[17～18]，生長素輸入載體是形成生長素濃度梯度的基本條件。因此，研究生長素輸入載體的功能就顯得尤為重要。AUX1/LAX1蛋白是最主要的生長素輸入載體，編碼其蛋白的基因主要包括AUX1基因和類AUX1基因(LAX1、LAX2、LAX3)[18]。它們廣泛分布在植物體的韌皮部、維管柱及根細胞中。生長素輸入載體系統(tǒng)的存在，使得生長素在植物體內(nèi)高效運輸，從而調(diào)節(jié)植物體的生長發(fā)育[19～20]。

近些年來，在毛楊樹、水稻、花生、豌豆、櫻桃等植物中也發(fā)現(xiàn)了生長素輸入載體基因的存在。本研究中克隆得到了蘋果生長素輸入載體基因MdAUX1，基因組結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，MdAUX1定位于蘋果基因組的第6號染色體上，由6個外顯子和5個內(nèi)含子構(gòu)成。氨基酸序列比對表明，蘋果MdAUX1基因與擬南芥、蕪菁、木麻黃、水稻、歐洲甜櫻桃、碧桃、豌豆、蓖麻、醉蝶花、葡萄、梅花、百日草的AUX1基因具有高度同源性，初步推測該基因片段為存在于蘋果中的生長素輸入載體AUX/LAX類基因家族成員。MdAUX1蛋白功能域分析結(jié)果表明其在42-436 aa存在一個保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，表明MdAUX1能夠?qū)⑸L素運輸進入細胞膜。進化樹分析進一步表明，蘋果MdAUX1與歐洲甜櫻桃PaAUX1親緣關系最近，推測二者功能相近。同時，組織表達分析結(jié)果顯示，該基因在蘋果各組織中為組成型表達，且在莖部的表達強度最高，推測MdAUX1在植物體內(nèi)生長素極性運輸和重新分配中發(fā)揮關鍵作用。

為了進一步研究MdAUX1在蘋果生長發(fā)育中的功能，我們構(gòu)建了MdAUX1基因的過量表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草。根系表型觀察結(jié)果顯示，在擬南芥中量表達MdAUX1抑制了主根伸長，促進了側(cè)根發(fā)育。一般認為，當生長素在根系中積累到一定水平時，就會抑制主根伸長；同時，又會激活側(cè)根原基，誘導側(cè)根不斷生長并伸長[21]。據(jù)此推測蘋果MdAUX1作為生長素輸入載體，能夠調(diào)控生長素極性運輸，促進生長素在根系部位的積累。生長素NAA可以通過擴散的方式進入植物細胞內(nèi)，而不依賴于生長素輸入載體[22]。用NAA處理植株，轉(zhuǎn)基因植株抑制主根伸長的表型變得不顯著，推測蘋果MdAUX1在生長素運輸中具有飽和性。此外，轉(zhuǎn)基因煙草的地上部分生長狀況明顯優(yōu)于野生型，表明MdAUX1在促進植株生長也發(fā)揮重要作用。這些研究結(jié)果表明MdAUX1基因為生長素運輸載體AUX/LAX類基因家族成員，在促進植物根系發(fā)育和植株生長中發(fā)揮重要作用，這為蘋果生長發(fā)育調(diào)控及新品種培育提供了理論依據(jù)。

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The National Natural Science Foundation of China(31430074);Shandong Agricultural Engineering and industrial System(SDAIT-03-033-03)

introduction：AN Jian-Ping(1990—),male,Master,Mainly engaged in the study of fruit tree molecular biology.

date:2016-09-05

MolecularCloningandGeneticTransformationAnalysisofanAppleAuxinInfluxTransporterGeneMdAUX1inArabidopsisthalianaandTobacco

AN Jian-Ping WANG Xiao-Fei LIU Xin LI Hao-Hao YOU Chun-Xiang HAO Yu-Jin*

(College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an 271018)

Auxin has been identified to play critical roles in regulating plant growth and development. The polar transport of auxin is regulated by auxin transporters. In this study, an auxin influx transporter gene namedMdAUX1 was cloned fromMalus×domestic‘Royal Gala’. Sequence analysis showed that the length ofMdAUX1 gene was 1 443 bp, which encoded 480 amino acids. Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that the AUX1 had a high sequence conservation among different species, and apple MdAUX1 exhibited the highest sequence similarity withPrunusaviumPaAUX1. RT-PCR analysis demonstrated theMdAUX1 gene was mainly expressed in stem. We generated transgenicArabidopsisand tobacco plants expressing the appleMdAUX1 byAgrobacterium-mediated genetic transformation. Ectopic expression ofMdAUX1 inArabidopsisexhibited the phenotype of inhibition of primary root elongation and increase lateral root number. Furthermore, there was no significant inhibition on primary root elongation phenotype when treated with the NAA. OverexpressingMdAUX1 in tobacco could significantly promote the growth of aerial parts of plant. These results suggested that MdAUX1 played a vital role in plant growth and development.

apple;auxin influx transporters;MdAUX1;genetic transformation

國家自然科學基金(31430074)；山東省農(nóng)業(yè)工程和產(chǎn)業(yè)體系(SDAIT-03-033-03)

安建平(1990—)，男，碩士研究生，主要從事果樹生物技術的研究。

* 通信作者：E-mail:haoyujin@sdau.edu.cn

2016-09-05

* Corresponding author：E-mail:haoyujin@sdau.edu.cn

S661.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.014