子癇前期患者胎盤、胎膜組織中水通道蛋白9的表達(dá)變化

白伶俐 蘆笛 高霞

【摘要】目的：觀察水通道蛋白9（AQP9）在子癇前期患者胎盤、胎膜組織中的定位、mRNA及表達(dá)變化，分析AQP9在子癇前期發(fā)病中發(fā)揮的作用。方法：選取本院2014年3月至2015年5月收治的100例孕婦作為研究對(duì)象，其中有50例為正常晚期妊娠孕婦，將這50例作為對(duì)照組；另外50例為子癇前期孕婦（孕周38～42周），輕度子癇前期孕婦與重度子癇前期孕婦各25例，將這50例子癇前期患者作為觀察組。利用免疫組織化學(xué)增強(qiáng)聚合物法對(duì)AQP9的定位情況進(jìn)行測(cè)定；利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)AQP9 mRNA進(jìn)行檢測(cè)；利用蛋白印跡技術(shù)對(duì)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；通過使用凝膠蛋白定量分析軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：（1）AQP9在羊膜上皮細(xì)胞、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞上定位；（2）兩組患者的胎膜組織和胎盤中都有AQP9 mRNA表達(dá)；（3）觀察組胎膜組織、胎膜中AQP9的灰度值都要高于對(duì)照組，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且觀察組中重度子癇前期患者胎膜組織、胎膜中AQP9的灰度值要高于輕度子癇前期患者，對(duì)比差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：子癇前期患者AQP9的表達(dá)水平得到較大程度的提升，AQP9是造成子癇前期發(fā)病的主要因素。

【關(guān)鍵詞】子癇前期；胎盤；胎膜組織；AQP9；表達(dá)變化

Expression of aquaporin-9 in placenta and fetal membrane of preeclampsia patientsBAI Lingli， LU Di， GAO Xia. Department of Obstetrics， Hospital Affiliated to Yanan University， Yanan 716000， Shaanxi， China

【Abstract】Objectives： To observe changes in the location， mRNA and expression of aquaporin-9 （AQP9） in placenta and fetal membrane of preeclampsia patients， to analyze its role in the pathogenesis of preeclampsia. Methods： 100 pregnant women treated in our hospital from March 2014 to May 2015 were selected including 50 normal third trimester pregnant women as control group and 50 preeclampsia patients （gestational age of 38 to 42 weeks） as observation group， i.e. 25 mild preeclampsia pregnant women and 25 severe ones. Immunohistochemical reinforced polymer was used to determine the location of AQP9， reverse transcription-polymerase chain reaction to test the 9 mRNA， protein imprinting technology to test the protein expression levels， and the gel protein quantitative analysis software for determination of protein grey value. Results： Firstly， the AQP9 was located in amniotic epithelial cells， human chorionic trophocyte and sertoli cells. Secondly， expression of AQP9 was found in the membranes and placenta of both groups. Thirdly， the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in the observation group was higher than the control group， with statistically significant difference （P<0.05）， and the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in patients with severe preeclampsia was also higher than those with mild preeclampsia， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusions： Expression level of AQP9 in patients with preeclampsia increases， indicating AQP9 is the main factor of preeclampsia.

【Key words】Preeclampsia； Placenta； Foetal sac； Aquaporin-9 （AQP9）； Changes in expression

【中圖分類號(hào)】R714.4【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

孕婦在妊娠期間普遍會(huì)患上妊娠期高血壓疾病，而子癇前期是最常見的類型之一，同時(shí)也是造成孕產(chǎn)婦死亡的主要原因[1]。目前，子癇前期發(fā)病機(jī)制仍然處于不清晰的狀態(tài)，專家認(rèn)為早期形成胎盤時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞沒有深入入侵子宮內(nèi)膜，重鑄子宮螺旋小動(dòng)脈出現(xiàn)障礙，從而使胎盤出現(xiàn)“淺著床”現(xiàn)象，這些因素促使子癇前期的發(fā)作[2]。細(xì)胞分化及遷移過程中，水通道蛋白9（AQP9）會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的影響，其表達(dá)升高在一定程度上加快了細(xì)胞凋亡的速度，細(xì)胞的遷移能力逐漸下降，細(xì)胞分化和細(xì)胞融合也會(huì)受到相應(yīng)抑制作用，導(dǎo)致胎盤出現(xiàn)缺血缺氧現(xiàn)象，由此推斷子癇前期發(fā)病很有可能與AQP9異常表達(dá)有一定的關(guān)系。選取2014年3月至2015年5月收治的100例孕產(chǎn)婦，作為子癇前期患者胎盤、胎膜組織中AQP9的表達(dá)變化與子癇前期發(fā)病的關(guān)系的研究對(duì)象，其結(jié)果如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取都是我院2014年3月至2015年5月收治的剖宮產(chǎn)患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有入選患者經(jīng)B型超聲檢查均符合子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；（2）患者簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有心、腦、腎、肝等嚴(yán)重性疾病患者；（2）患者為過敏體質(zhì)，對(duì)藥物過敏；（3）患者患有精神類疾病或正在參加其他臨床試驗(yàn)；（4）未按醫(yī)囑用藥，導(dǎo)致影響最終療效判斷的患者。將其分為對(duì)照組和觀察組，各50例?；颊吣挲g為21～36歲，平均年齡為（24.53±4.34）歲，孕周為38～42周。其中50例正常足月妊娠產(chǎn)婦為對(duì)照組，25例輕度子癇前期孕婦和25例重度子癇前期產(chǎn)婦為觀察組。兩組產(chǎn)婦在年齡、孕周等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。子癇前期發(fā)病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《婦產(chǎn)科學(xué)》中相關(guān)內(nèi)容。兩組患者都沒有患上糖尿病、腎炎、肝炎等合并癥，而且兩組病人也沒有出現(xiàn)妊娠期糖尿病、羊水量異常以及胎膜早破等并發(fā)癥。對(duì)照組患者由于瘢痕子宮、胎位不正等各種因素需要實(shí)施剖宮產(chǎn)術(shù)，觀察組患者除了子癇前期外，沒有產(chǎn)生其它并發(fā)癥，因瘢痕子宮、胎位不正或者病情需要實(shí)施剖宮產(chǎn)手術(shù)。

1.2方法

1.2.1采集標(biāo)本對(duì)兩組患者均實(shí)施剖宮產(chǎn)手術(shù)，胎盤娩出之后，醫(yī)師立即在中央無鈣化區(qū)域取出半徑為1.5cm及體積為8cm3的胎盤組織各3份，將取出物置于常溫0.9%氯化鈉液體中，將血液清洗干凈后，將其分成3份，將其中的1份放入標(biāo)本袋中，并在標(biāo)本袋中加入10%中性福爾馬林，固定1d之后將其送入病理科，經(jīng)24h石蠟包埋的碳膜組織及胎盤，主要是用作免疫組化研究。將剩下的2份放入凍存管中，對(duì)凍存管進(jìn)行編號(hào)，然后將凍存管放入液氮中進(jìn)行冷卻，最后將其保存在-80℃的低溫冰箱中，可在Western-blothing實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)中使用[3]。

1.2.2免疫組織化學(xué)增強(qiáng)聚合物法用石蠟包埋固定的胎膜組織和胎盤，對(duì)其進(jìn)行切片處理，厚度為3μm，將其進(jìn)行脫蠟復(fù)水處理之后，放入EDTA中，讓其進(jìn)行修復(fù)。在濃度為30%的過氧化氫溶液中添加甲醇，直至將其稀釋成濃度為0.9%的溶液，將胎膜組織和胎盤放入稀釋后的溶液10min，這樣就能將內(nèi)源性過氧化物酶清除干凈；然后將其封閉在5%BSA中，時(shí)間維持15min；再向其中加入經(jīng)稀釋液處理過的一抗（稀釋比例為1：2000），并且保持4℃的溫度，放置1晚；二抗用過氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記，羊抗兔比例為1∶100，在室溫下孵育時(shí)長(zhǎng)為40min，用二氨基聯(lián)苯胺對(duì)其進(jìn)行顯色，用蘇木素復(fù)染[4]。將肝臟細(xì)胞當(dāng)作陽(yáng)性對(duì)照，若細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)上能清晰地見到棕黃色或者黃色顆粒，則該細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)利用TRIzol將胎膜組織和胎盤中所有的RNA抽提出來，用分光光度計(jì)對(duì)260nm和280nm兩處位置的吸光度值進(jìn)行測(cè)定，將總RNA的純度和濃度計(jì)算出來，需要注意的是OD260與OD280的比值必須大于1.8，將5lRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA[5]。

1.2.4Western-blothing實(shí)驗(yàn)剪碎組織，嚴(yán)格遵照相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，在一抗中應(yīng)用兩組患者胎膜組織和胎盤AQP9多克隆抗體，其比例為1：500，在二抗中采用經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記處理的羊抗兔IgG，其比例為1：5000[6]。應(yīng)用凝膠灰度分析軟件Quantitry One4.6.2來檢測(cè)底片，測(cè)量其灰度值，同時(shí)對(duì)AQP9標(biāo)本和β-actin的灰度值進(jìn)行檢測(cè)，AQP9的相對(duì)含量就是AQP9灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法

匯總處理兩組患者的臨床數(shù)據(jù)后，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)其進(jìn)行處理，其中用χ2來檢驗(yàn)組間率對(duì)比，用率（%）來表示計(jì)數(shù)資料；若P>0.05，那么差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤中AQP9定位情況

對(duì)照組和觀察組產(chǎn)婦的胎膜組織及胎盤中都能見到AQP9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，具體定位于絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞以及胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞。見圖1、圖2。

2.2兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤中AQP9mRNA定性表達(dá)

在對(duì)照組和觀察組產(chǎn)婦的胎膜組織和胎盤中都檢測(cè)到了AQP9 mRNA表達(dá)，兩組患者的胎膜組織和胎盤標(biāo)本中都擴(kuò)增出β-actin，實(shí)際擴(kuò)增片段是77bp，而且都能夠測(cè)出AQP9 mRNA表達(dá)，其中AQP9擴(kuò)增的片段是78bp，和預(yù)期的長(zhǎng)度一致。

2.3兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤AQP9水平

2.3.1兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤AQP9表達(dá)情況AQP9分子量約為27kda，β-actin分子量大約是43kda。在對(duì)照組和觀察組產(chǎn)婦胎膜組織及胎盤中都檢測(cè)到了AQP9。見圖3。

圖1AQP9在胎膜組織中的表達(dá)圖2AQP9在胎盤中的表達(dá) 圖3AQP9在胎膜組織和胎盤中的表達(dá)結(jié)果2.3.2兩組產(chǎn)婦AQP9的灰度值對(duì)照組產(chǎn)婦胎膜組織、胎盤中AQP9的灰度值分別為（0.17±0.02）、（0.20±0.02），觀察組產(chǎn)婦胎膜組織、胎盤中AQP9的灰度值分別為（0.54±0.16）、（0.54±0.14）。對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3.3觀察組中輕度子癇前期與重度子癇前期患者胎膜組織和胎盤AQP9的灰度值25例輕度子癇前期患者胎膜組織和胎盤中的蛋白灰度值分別為（0.39±0.17）、（0.42±0.02），25例重度子癇前期患者胎膜組織和胎盤中的蛋白灰度值分別為（0.68±0.02）、（0.67±0.03），對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3討論

3.1AQP9結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性及能量代謝

AQP9是一種跨膜糖蛋白，是組成水通道蛋白的重要部分，其cDNA中中共包括2890個(gè)核苷酸分子，5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子共同組成了AQP9基因，該蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是由跨膜6次的單肽鏈組成，同源四聚體構(gòu)成了其高級(jí)結(jié)構(gòu)。AQP9對(duì)水通透性較好，而且其還能夠通透各種小分子，具體包括甘油、尿素、嘧啶和嘌呤，尤其甘油作用較為突出。AQP9是肝臟特異性蛋白，能夠在人體內(nèi)運(yùn)輸甘油。Yoshiki等[5]對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行研究后，了解到當(dāng)溫度保持在25℃時(shí)，AQP9攝取的甘油會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)，而且其會(huì)隨溫度的變化而發(fā)生改變，當(dāng)溫度在4～25℃范圍內(nèi)時(shí)，AQP9攝取的甘油量就會(huì)降低70%。Yamamoton[6]的研究結(jié)果表明，AQP9的表達(dá)水平會(huì)嚴(yán)重受到血胰島素濃度的影響，AQP9表達(dá)水平在糖尿病患者中會(huì)增加，認(rèn)為AQP9與腦能量代謝有著密切的聯(lián)系。

3.2AQP9與子癇前期

3.2.1子癇前期發(fā)病與滋養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)系子癇是威脅孕產(chǎn)婦健康甚至生命的四大疾病之一，一般發(fā)生在妊娠晚期或產(chǎn)后不久，發(fā)生在產(chǎn)前最為常見，被稱為產(chǎn)前子癇。子宮螺旋動(dòng)脈重塑出現(xiàn)障礙與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)不足有著較大的聯(lián)系，其是子癇前期發(fā)病的主要因素。Arima等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，正常足月妊娠產(chǎn)婦合體滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡率明顯要低于足月妊娠重度子癇前期患者，子癇前期患者由于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力不足，導(dǎo)致絨毛缺氧，與妊娠期高血壓疾病關(guān)系密切。在本研究中，最終結(jié)果表明AQP9在絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)程度在子癇前期患者胎盤、胎膜組織中增強(qiáng)，說明AQP9可能與子癇前期發(fā)病存在一定的關(guān)系。

3.2.2AQP9與子癇前期的關(guān)系全部凋亡細(xì)胞在最初會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，造成水大量確實(shí)，繼發(fā)性細(xì)胞體積不斷縮小，此過程被專家稱為凋亡體積縮小。

在AVD時(shí)期，AQP9在水穿細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)中起著至關(guān)重要作用。正常孕婦胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞總的凋亡率顯著低于子癇前期孕婦。在該研究中，AQP9在子癇前期產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組產(chǎn)婦，在觀察組患者中輕度子癇前期產(chǎn)婦要低于重度子癇前期產(chǎn)婦，而AQP9參與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，這表明AQP9很有可能會(huì)加劇滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，使胎盤出現(xiàn)缺氧缺血現(xiàn)象。

Wang等[8]通過體外培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水通道蛋白促進(jìn)了水分子滲透細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其在細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要的作用。Carbrey等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滋養(yǎng)細(xì)胞與破骨細(xì)胞有著相似的分化過程，即能夠形成多核結(jié)構(gòu)，具體是分裂活躍而沒有分化的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過融合與分化之后產(chǎn)生的。Fujita等[10，11]發(fā)現(xiàn)，AQP9會(huì)對(duì)破骨細(xì)胞分化產(chǎn)生一定的影響，而單核細(xì)胞經(jīng)過融合之后形成了破骨細(xì)胞，認(rèn)為AQP9參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的分化過程。

Joblonski等[12]通過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AQP9在正常妊娠病人胎盤組織中的表達(dá)較子癇前期患者明顯降低，認(rèn)為AQP9的異常表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞分化、遷移和凋亡產(chǎn)生了巨大的影響，其參與了子癇前期發(fā)病過程[13]。本研究表明，觀察組胎膜組織、胎盤的AQP9表達(dá)明顯要高于對(duì)照組患者，輕度子癇前期患者要低于重度患者，此結(jié)果與Badaut[14]相關(guān)研究具有一致性，表明AQP9增強(qiáng)是導(dǎo)致子癇前期發(fā)病的主要原因。

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