血管生長(zhǎng)素的差異表達(dá)對(duì)鑒別前列腺癌雄激素依賴性和非依賴性的臨床意義的研究

田河 南錫浩 于峰 白吉祥 邸彥橙 郭振海 吳影

【摘要】目的：研究雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌中血管生長(zhǎng)素（ANG）的差異性表達(dá)的臨床意義，以了解雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制。方法：研究時(shí)間為2013年7月至2015年7月，采用體外培養(yǎng)的方式分別培養(yǎng)雄激素依賴性（LNCaP細(xì)胞）和非依賴性（PC-3細(xì)胞）前列腺癌細(xì)胞株，并與正常健康人群進(jìn)行對(duì)比；分別在細(xì)胞和組織水平上對(duì)ANG水平和表達(dá)情況進(jìn)行分析歸納。結(jié)果：前列腺癌患者ANG陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常健康人群（P<0.05）；雄激素依賴性前列腺癌患者各分期中ANG水平明顯低于非依賴性患者，P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異意義。結(jié)論：ANG在雄激素依賴性前列腺癌向非依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)化中具有主導(dǎo)作用，ANG可能成為腫瘤的標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】雄激素依賴性前列腺癌；雄激素非依賴性前列腺癌；血管生長(zhǎng)素；差異表達(dá)

Research of ANG differentially expression in identification of androgen-dependent and independent prostate cancerTIAN He， NAN Xihao△， YU Feng， BAI Jixiang， DI Yancheng， GUO Zhenhai， WU Ying. Department of Urology， Mudanjiang Medical College Hongqi Hospital， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China

【Abstract】Objectives： To study the clinical significance of differential expression of ANG in androgen-dependent and independent prostate cancer in order to understand the pathogenesis of androgen-independent prostate cancer. Methods： From July 2013 to July 2015， by way of in vitro culture， we got androgen-dependent （LNCaP cells） and independent （PC-3 cells） prostate cancer cell lines. The cell sample from healthy people was used as control sample； ANG and expression levels at the cellular and tissue levels were respectively analyzed and summarized. Results： ANG expression in prostate cancer patients were significantly higher than that in normal healthy population （P<0.05）. In various stages， ANG levels of androgen-dependent prostate cancer were significantly lower than that of non-dependent prostate cancer， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion： ANG has a leading role in the conversion to non-independent prostate cancer in androgen dependent prostate cancer and ANG may become tumor marker.

【Key words】Androgen dependent prostate cancer； Androgen-independent prostate cancer； ANG； Differential expression

【中圖分類號(hào)】R737.25【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

前列腺癌是西方國(guó)家老年男性最常見的惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病呈逐年增多的趨勢(shì)。盡管去勢(shì)治療對(duì)于進(jìn)展期前列腺癌患者是最有效的治療方法，但癌細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)展為雄激素非依賴性，在內(nèi)分泌治療后一旦演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔?，則對(duì)患者的治療和預(yù)后帶來極大的困難。前列腺癌細(xì)胞獲得激素非依賴性的機(jī)制，可能與多種因素有關(guān)，雖已成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)但仍處于探索階段。近來研究顯示[1，2]，血管生長(zhǎng)素（angiogenin， ANG）在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。已有報(bào)道前列腺癌患者血清ANG水平高于正常人水平，并且在前列腺癌組織中高表達(dá)[3]。國(guó)內(nèi)有研究表明ANG在前列腺癌組織中表達(dá)顯著高于前列腺良性增生組織，ANG的表達(dá)隨前列腺癌患者臨床分期的升高而上調(diào)[4]。本研究?jī)r(jià)值在于證實(shí)ANG是否在雄激素依賴性前列腺癌向雄激素非依賴性前列腺癌演變過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，從而揭示雄激素依賴性前列腺癌向雄激素非依賴性前列腺癌的演變機(jī)制。研究前列腺癌患者血清ANG水平和前列腺癌進(jìn)展程度的關(guān)系，其前景是為ANG能成為腫瘤的標(biāo)記物提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

研究時(shí)間為2012年7月至2015年7月，病例納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：臨床表現(xiàn)為尿無力、尿流緩慢、尿線變細(xì)、尿不盡、尿流中斷、尿急、尿頻、急性尿潴留、夜尿增多；均經(jīng)病理活檢證實(shí)為前列腺癌或前列腺增生；1個(gè)月內(nèi)無前列腺損傷性檢查（前列腺電切術(shù)、前列腺穿刺活檢、直腸內(nèi)超聲檢查等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他惡性腫瘤病史；磁共振檢查禁忌癥；不愿配合研究者。入選的研究對(duì)象為雄激素依賴性前列腺癌患者32例作為A組，雄激素非依賴性前列腺癌32例作為B組，另選取同期健康人群32例作為對(duì)照組。A組患者年齡在46～62歲，平均（58.6±6.2）歲；病程1～5年，平均（3.5±0.4）年；B組患者年齡在45～65歲，平均（57.9±5.6）歲；病程1～5年，平均（3.2±0.5）年；對(duì)照組年齡在40～70歲，平均（59.6±7.3）歲。三組研究對(duì)象年齡的比較上無明顯差異，存在可比性。

1.2細(xì)胞株和試劑

雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株LNCaP細(xì)胞、雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞均由中科院細(xì)胞庫(kù)提供。LNCaP細(xì)胞在F12培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中進(jìn)行增殖培養(yǎng)傳代，PC-3細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中進(jìn)行增殖培養(yǎng)傳代。培養(yǎng)時(shí)溫度均為37℃，二氧化碳5%。

1.3方法

ANG在正常前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞系的表達(dá)：（1）人前列腺細(xì)胞系PC-3M和前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，按相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道培養(yǎng)，LNCaP在激素遞減環(huán)境下經(jīng)連續(xù)傳代形成激素非依賴的LNCaP-AI細(xì)胞系；（2）提取各組細(xì)胞總RNA，real-time PCR檢測(cè)各組ANG mRNA含量；（3）提取細(xì)胞總蛋白，western-blot檢測(cè)各組ANG蛋白含量。RNA干擾ANG合成后觀察細(xì)胞生物學(xué)變化：（1）設(shè)計(jì)ANG靶向siRNA，以脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染LNCaP和LNCaP-AI細(xì)胞系，同時(shí)設(shè)計(jì)空白載體組；（2）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化；（3）用CCK-8法、自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的光密度（D）值比較轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變化；（4）以標(biāo)準(zhǔn)方法采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞周期；（5）用Transwell小室和0.25% 考馬斯亮藍(lán)染色、正置顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)觀察轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞侵襲力。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS14.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成分析檢驗(yàn)，計(jì)量時(shí)數(shù)據(jù)錄入形式為（±s），完成t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)時(shí)數(shù)據(jù)錄入形式為%，完成χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著意義。

2結(jié)果

2.1ANG表達(dá)結(jié)果分析

與對(duì)照組相比，A組和B組患者ANG蛋白（+）信號(hào)表現(xiàn)為棕黃色顆粒，位于胞漿部位。64例前列腺癌患者中ANG蛋白呈（+）56例，占87.50%，與對(duì)照組的0.00%比較，χ2=156.36，P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；強(qiáng)度主要集中在中等或強(qiáng)陽(yáng)性。癌旁組織中ANG蛋白主要存在于血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、少量的炎性細(xì)胞等，均呈弱陽(yáng)性。

2.2ANG檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)比較

A組和B組患者ANG均為不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，但不同分期中A組陽(yáng)性表達(dá)低于B組，P<0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。見表1。

3討論

前列腺癌患者血清ANG水平高于正常人水平，并且在前列腺癌組織中高表達(dá)ANG[6]。本研究中，A組與B組患者ANG陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P<0.05），提示前列腺癌患者ANG陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)異常。國(guó)內(nèi)有研究表明ANG在前列腺癌組織中表達(dá)顯著高于前列腺良性增生組織，ANG的表達(dá)隨前列腺癌患者臨床分期的升高而上調(diào)。由于多種因素誘發(fā)前列腺組織內(nèi)的ANG異常合成增加進(jìn)而促進(jìn)腺體內(nèi)血管增生、內(nèi)皮細(xì)胞遷移粘附很可能是推進(jìn)前列腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一[7，8]。我們推測(cè)，在雄激素促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的同時(shí)，ANG很可能也發(fā)揮著作用。尤其是進(jìn)行去勢(shì)治療后，體內(nèi)雄激素水平下降，在癌細(xì)胞逐漸發(fā)展為雄激素非依賴性的過程中，ANG的表達(dá)可能會(huì)明顯增加成為主要的促腫瘤因素，最終使激素依賴性前列腺癌（ADPC）演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔ˋIPC）。

研究結(jié)果中：A組（雄激素依賴性前列腺癌）患者ANG蛋白水平在A、B、C、D四個(gè)分期的表達(dá)中均低于B組（雄激素非依賴性前列腺癌），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.05）；雄激素依賴性前列腺癌向非依賴性發(fā)展時(shí)，ANG水平明顯發(fā)生變化，提示ANG在病情的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。ANG是1985年Fett等首次從培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT-29的無血清上清液中分離到的，ANG具有核糖核酸酶的活性，這是是其促血管生成功能所必需的[9]。ANG蛋白含123個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為14.4kD，雖然在腫瘤細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)，但也存在于人體正常細(xì)胞中，可由多種組織和細(xì)胞分泌，在生理狀態(tài)下其表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。ANG是一種非常有效的促血管生成因子，可對(duì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的促增殖作用。目前ANG在很多缺血性疾?。ㄌケP缺血、心肌缺血等）的診斷與治療中體現(xiàn)出一定價(jià)值[10]。ANG與腫瘤關(guān)系密切。腫瘤性血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上存在ANG 高度特異性的整合素作為 ANG 受體介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖粘附和遷移，并且ANG結(jié)合于腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的表面或細(xì)胞外基質(zhì)，起到連接兩種細(xì)胞的作用。在多種惡性腫瘤患者中ANG在腫瘤組織中的表達(dá)和血清ANG水平均明顯升高，ANG且與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，提示預(yù)后較差或復(fù)發(fā)，如胰腺癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、浸潤(rùn)性宮頸癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌和急性髓性白血病等[11]。癌變的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移等對(duì)血管新生有顯著的依賴性。癌細(xì)胞分泌的各類因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生作用，促進(jìn)其增殖，在宿主內(nèi)生成新的血管網(wǎng)，為瘤體的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。ANG家族在其受體Tie-2的作用下對(duì)新生成的血管產(chǎn)生作用，并維持其穩(wěn)定性。ANG-1因子具有內(nèi)皮細(xì)胞趨化作用，同時(shí)能夠增加其生存時(shí)間。ANG-2與ANG-1具有拮抗作用，均受其Tie-2受體的調(diào)控與其具有一致的親和力。但臨床對(duì)ANG參與血管的新生機(jī)制尚未明確。大部分學(xué)者研究認(rèn)為：ANG-1結(jié)合受體后促進(jìn)磷酸化的發(fā)生，借助細(xì)胞和基質(zhì)間的作用對(duì)血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)；而ANG-2與ANG-1發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)抑制性作用，阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞與外周細(xì)胞的作用，對(duì)血管的重塑產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，松解血管增強(qiáng)VEGF的促血管新生作用，生成新的毛細(xì)血管[12，13]。林楠等學(xué)者對(duì)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[14]：肝移植瘤中腫瘤的形成時(shí)ANG-2表達(dá)過度，說明ANG與腫瘤新生血管的生長(zhǎng)具有相關(guān)性，可促進(jìn)其生長(zhǎng)；本文研究與其結(jié)果相近，說明ANG在前列腺癌病情發(fā)展的機(jī)制中具有重要作用。

綜上，由于多種因素誘發(fā)前列腺組織內(nèi)的ANG異常合成增加進(jìn)而促進(jìn)腺體內(nèi)血管增生、內(nèi)皮細(xì)胞遷移粘附很可能是推進(jìn)前列腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一[15]。我們推測(cè)，在雄激素促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的同時(shí)，ANG很可能也發(fā)揮著作用。尤其是進(jìn)行去勢(shì)治療后，體內(nèi)雄激素水平下降，在癌細(xì)胞逐漸發(fā)展為雄激素非依賴性的過程中，ANG的表達(dá)可能會(huì)明顯增加成為主要的促腫瘤因素，最終使激素依賴性前列腺癌演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔Ｑ芯吭谠撗葑冞^程中前列腺癌細(xì)胞內(nèi)ANG的表達(dá)變化對(duì)了解激素非依賴性前列腺癌的形成機(jī)制有重要意義。

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