益腎方對(duì)IgA腎病細(xì)胞因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

王三合　 康曉玲　樊　平　陳　群

西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院(西安710072)

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益腎方對(duì)IgA腎病細(xì)胞因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

王三合 康曉玲樊平陳群

西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院(西安710072)

目的：觀察益腎方對(duì)IgA腎病模型大鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法：將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，造模組30只兩組，采用口服牛血清白蛋白聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B法造模。將IgA腎病模型大鼠分成3組：益腎方組、造模組、強(qiáng)的松治療組各10只。分別灌胃給藥，4周后取血，酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定IL-6、Leptin和PDGF水平。結(jié)果：與模型組比較，各藥物治療組均有IL-6、Leptin和PDGF表達(dá)降低作用；與正常對(duì)照組比較，各組IL-6、Leptin和PDGF表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05)；與模型組比較，益腎方能顯著降低IL-6、Leptin和PDGF的表達(dá)。 結(jié)論：益腎方可能是通過(guò)降低IL-6、Leptin和PDGF的表達(dá)治療IgA腎病。

IgA腎病(IgA nephrophathy, IgAN)是我國(guó)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病，發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的58.2%，是全世界發(fā)病率最高的原發(fā)性腎小球疾病，也是慢性腎臟病的主要病理類型[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，眾多細(xì)胞因子與IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，而白細(xì)胞介素-6(IL-6)是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要因子之一[2]。目前，有關(guān)細(xì)胞因子與IgA腎病的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察益腎方對(duì)IgA腎病模型大鼠IL-6、Leptin和PDGF指標(biāo)的變化，從細(xì)胞因子水平探討益腎方治療IgA腎病的可能機(jī)制，為益腎方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21日齡幼年Sprague-Dawley (SD) 大鼠40只，體重100±50g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2動(dòng)物模型的建立正常對(duì)照組大鼠自由進(jìn)食與飲水，而模型組大鼠隔日灌服BSA200mg/kg體重(BSA用0.1%BSA酸化水溶解)，第6周開(kāi)始按20mg/kg,1次/d尾靜脈注射1%BSA(每1gBSA溶于1250ml注射用水中，配成含BSA0.4mg/0.5ml的溶液)連續(xù)3d，第8周時(shí)按0.5mg/kg尾靜脈注射SEB，每周1次(1 mg SEB溶于50ml注射用水，配成每0.5ml注射用水含0.01mg SEB的溶液)，連續(xù)注射3周，觀察至12周末。

1.3分組及藥物干預(yù)模型大鼠分三組，每組10只，正常對(duì)照組10只。將模型大鼠30只隨機(jī)分成3組：益腎方組(湯劑容量為每次每公斤體重10ml)、模型組(灌以相同劑量的清水)、強(qiáng)的松治療組(0.1mg/100g)；1次/d，連續(xù)4周。

1.4取材實(shí)驗(yàn)的第12周末和第16周末用代謝籠收集大鼠24h尿液進(jìn)行尿總蛋白測(cè)定。采用腹主動(dòng)脈取血分離血清，-20℃保存。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)試劑盒測(cè)定血清樣本中IL-6、Leptin、PDGF-BB水平，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。計(jì)算血清IL-6、Leptin和PDGF水平。

2結(jié)果2.1正常對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一般情況正常，模型組大鼠在造模時(shí)，注射SEB后均有不同程度的食欲減少，精神萎靡等表現(xiàn)。造模第12周末收集大鼠尿液進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠第12周末尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.05

2.2各組大鼠治療4周后血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，各組尿液中紅細(xì)胞個(gè)數(shù)和24h尿蛋白定量均較正常對(duì)照組顯著增加，各治療組之間血尿與蛋白尿水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，顯示造模成功。

表2　各組大鼠治療4周后血清細(xì)胞

注：*表示與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，#表示與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

2.3各組大鼠第16周末尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h尿蛋白定量結(jié)果治療4周后對(duì)IL-6、Leptin、PDGF-BB的檢測(cè)結(jié)果,見(jiàn)表2。尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h尿蛋白定量結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠第16周末尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h

注：*表示與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，#表示與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異與模型組比較，強(qiáng)的松組、益腎方組大鼠尿紅細(xì)胞、24h尿蛋白均有降低(P<0.05)，強(qiáng)的松組、益腎方組尿紅細(xì)胞、24h尿蛋白測(cè)定結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

3討論目前IgAN動(dòng)物模型建立方法有以下幾種：自發(fā)病變型、免疫誘導(dǎo)型和繼發(fā)病變型。自發(fā)病變型采用ddy小鼠和高IgA小鼠，而這種小鼠價(jià)格昂貴，且該小鼠腎臟與人類腎臟組織結(jié)構(gòu)差別較大；免疫誘導(dǎo)型多采用尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)誘發(fā)IgAN[3]，但葡萄球菌腸毒素是外毒素易引起機(jī)體損害,還有采用皮下注射注射CCL4和蓖麻油，灌胃牛血清白蛋白及尾靜脈注射0.05mg脂多糖(LPS)，誘發(fā)IgA腎病模型，該模型模型雖有較強(qiáng)IgA的沉積，但肝功能損害嚴(yán)重，常伴有肝細(xì)胞壞死變性和假小葉生成[4]。

繼發(fā)病變型則采用體外將MOPC-315雜交瘤的二硝基苯酚抗體與牛血清白蛋白(二硝基苯酚化)配成免疫復(fù)合物，通過(guò)鼠靜脈注入BAIb/c鼠體內(nèi)，而致免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū)，但此法模型動(dòng)物血尿不明顯[4]。

本研究采用尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)誘發(fā)IgAN，考慮到葡萄球菌腸毒素易引起機(jī)體損害，改為0.5mg/kg尾靜脈每周注射一次以減少損傷，從研究結(jié)果看造模成功。有研究結(jié)果顯示一般在造模12周左右可建立穩(wěn)定、可靠的IgA腎病模型。因此，本研究在造模12周時(shí)代謝籠留尿檢測(cè)模型動(dòng)物血尿和尿蛋白情況以確定動(dòng)物模型是否成功，在模型成功后進(jìn)行藥物干預(yù)4周以觀察藥物治療效果。

IgAN目前治療以糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒藥物為主，但有時(shí)這些藥物的副作用讓患者較難接受。中醫(yī)藥治療IgAN有一定療效。

本方為肝腎陰虛之方，證屬腎中真水不足，水虧無(wú)以養(yǎng)木，而致陰虛陽(yáng)亢且虛火內(nèi)生，治療宜采用滋補(bǔ)肝腎，方中熟地具有甘柔補(bǔ)血，滋腎填精之功，當(dāng)歸補(bǔ)血活血為君藥，山茱萸、枸杞子、女貞子滋養(yǎng)肝腎固腎氣為臣藥，黃芪可補(bǔ)氣升陽(yáng)，山藥健脾益胃可助運(yùn)化，茯苓滲利脾濕，而丹皮涼肝瀉火，生地、赤芍、白茅根具有清熱涼血之用，小薊涼血止血、金櫻子固精、旱蓮草滋陰、仙鶴草收斂共為佐使。全方補(bǔ)瀉結(jié)合，開(kāi)合相濟(jì)，共奏滋陰補(bǔ)腎固精、清熱涼血活血之功效。

腎穿刺活檢是診斷IgA腎病的金標(biāo)準(zhǔn)，近年來(lái)超聲引導(dǎo)下腎活檢使腎活檢的安全性得到提升，本研究采用的腎穿刺均是在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行的，但是腎穿刺活檢是有創(chuàng)性檢查，有發(fā)生出血等風(fēng)險(xiǎn)，且腎穿刺活檢結(jié)果有時(shí)不足以準(zhǔn)確評(píng)估腎小球病變嚴(yán)重程度。因此，尋找能夠用于IgA腎病診斷、病情評(píng)估或判斷預(yù)后的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物已成為研究熱點(diǎn)[5]。

細(xì)胞因子IL-6是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等分泌的糖蛋白，具有多種生物學(xué)活性，研究發(fā)現(xiàn)IL-6可增加系膜細(xì)胞蛋白激酶的活性，加重腎損害[6]。本研究結(jié)果顯示：IgA腎病模型大鼠血清IL-6水平明顯高于正常對(duì)照組，兩者比較有顯著性差異(P<0.05)；服用益腎方治療后，IL-6水平顯著下降，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示IL-6表達(dá)升高是IgA腎病的生物標(biāo)記物之一，益腎方可降低IL-6的表達(dá)促進(jìn)組織修復(fù)。

總之，本研究結(jié)果提示，IL-6、Leptin和PDGF水平與臨床腎間質(zhì)病理?yè)p傷之間具有一定的相關(guān)性。血清IL-6、Leptin和PDGF水平可作為無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)記物，若能有大數(shù)據(jù)樣本檢測(cè)結(jié)果支持，血清IL-6、Leptin和PDGF水平有可能成為IgA腎病診斷、病情評(píng)估或判斷預(yù)后的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物。

[1]Zhou FD，Zhao MH，Zou WZ，et al．The changing spectrum of primary glomerular diseases within 15 years: a survey of 3331 patients in a single Chinese centre[J]. Nephrol Dial Transplant,2009,24(3):870-876．

[2]王楠楠，卜茹，蔡廣研，等.IgA腎病相關(guān)尿液無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].中華腎病研究電子雜志，2015，4(2)：37-41.

[3]賀敏敏，董晨，李俊霞.I gA腎病小鼠模型的建立與鑒定[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30(3)：151-154.

[4]陸慧瑜，張巧玲,蔣小云，等.IgA腎病大鼠模型的建立[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志，2011，11(6)：1264-1267.

[5]孫燕，穆喆，高妍婷，等.腎活檢1363例病理譜分析[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43(10)：1413-1415.

[6]何澤云，廖春來(lái)，何雅琴，等.六味地黃湯對(duì)IgA腎病大鼠IL-6及TNF-α表達(dá)的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，29(3)：61-65.

(收稿2016-04-03；修回2016-06-16)

The experimental study on the effects of cytokine expression of Yishen-Fang in IgAN rats

Hospital of northwestern polytechnical university

(Xi’an 710072)WangSanheKang XiaolingFan Ping et al

Objective：To observe the effects of cytokine expression of Yishen-Fang treatment in IgAN rats. Methods： 40 SD rats were randomly divided into two groups, 10 for normal control group, 30 for model group. 30 IgAN rats were randomly divided into 3 groups: Yishen-Fang treatment group, model group, prednisone treatment group. There are 10 rats in each group. After Gavage for four weeks, the blood was collected. The IL-6, Leptin and PDGF values were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results：Compared with the model group, the expression of IL-6, Leptin and PDGF values decrease were shown in all drug treatment groups. Compared with the normal control group, the values of IL-6, Leptin and PDGF in each group were significantly increased(P<0.05). The expression of IL-6, Leptin and PDGF in the Yishen-Fang treatment group was significantly reduced when compared with the model group. Conclusion:Yishen-Fang may treat the IgAN rats by reducing the expression of IL-6, Leptin and PDGF.

Kidney Diseases (TCM)/Chinese traditional medicine therapyYishen-FangAnimal ExperimentationRats

*陜西省中醫(yī)管理局項(xiàng)目(13-LC085)

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部地方病研究所(西安710000)

腎病/中醫(yī)藥療法益腎方 動(dòng)物 ，實(shí)驗(yàn)大鼠

R692

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.079

陜西省衛(wèi)生計(jì)生委研究項(xiàng)目(2014ZD072)

△西安市新城區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)

▲陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)