補(bǔ)腎中藥復(fù)方對缺血性損傷大鼠薄型子宮內(nèi)膜厚度及組織病理學(xué)的影響

李　楠　陳　梅　李　翡　孫　康

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽712000)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)腎中藥復(fù)方對缺血性損傷大鼠薄型子宮內(nèi)膜厚度及組織病理學(xué)的影響

李楠陳梅李翡孫康

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽712000)

目的：觀察補(bǔ)腎中藥復(fù)方對缺血性損傷致薄型子宮內(nèi)膜模型大鼠子宮內(nèi)膜厚度及組織病理學(xué)的影響。方法：SD實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對照組、模型組、西藥組和中藥組。除空白對照組以外，其余3組均采用阻斷卵巢動脈的方法建立“缺血性損傷”薄型子宮內(nèi)膜模型，造模成功后空白對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，西藥組給予小劑量阿司匹林灌胃，中藥組灌服補(bǔ)腎中藥復(fù)方，連續(xù)灌胃15d后處死。結(jié)果：模型組與空白對照組比較,子宮內(nèi)膜厚度明顯萎縮變薄，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；西藥組和中藥組的內(nèi)膜厚度與模型組比較均增加，中藥組增加的幅度更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與空白對照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，中藥組與西藥組比較，雖然顯示出明顯增厚的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鏡下觀察模型組子宮內(nèi)膜層變薄，腺體數(shù)量減少，排列疏松，間質(zhì)致密、細(xì)胞變少、變小，血管分布稀疏。西藥組和中藥組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量較模型組均明顯增加，間質(zhì)血管分布密度集中。而中藥組內(nèi)膜腺體及間質(zhì)血管發(fā)育較西藥組成熟度更高。結(jié)論：阻斷卵巢血供后子宮內(nèi)膜發(fā)生缺血性改變，可以導(dǎo)致內(nèi)膜厚度變薄。補(bǔ)腎中藥復(fù)方在增加薄型子宮內(nèi)膜厚度改善其組織形態(tài)中發(fā)揮著與小劑量阿司匹林相似且較優(yōu)的效應(yīng)。

30余年來，人類輔助生殖技術(shù)(Assisted reproduction technique，ART)經(jīng)過不斷的發(fā)展成熟,給越來越多的不孕夫婦帶來了福音。然而在助孕周期中仍有相當(dāng)一部分患者因?yàn)楦鞣N原因以失敗告終，其中子宮內(nèi)膜過薄導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜容受性的改變是重要的原因之一。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：子宮內(nèi)膜血流減少與不明原因薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生有關(guān)。我們已通過阻斷卵巢動脈減少子宮內(nèi)膜血供的方法成功建立了“缺血性損傷”薄型子宮內(nèi)膜動物模型。本研究將基于此探討補(bǔ)腎中藥復(fù)方對該模型動物子宮內(nèi)膜厚度及組織病理學(xué)的影響，旨在為補(bǔ)腎法及補(bǔ)腎中藥用于不孕癥及婦科內(nèi)分泌疾病患者提供重要參考及依據(jù)。

1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組:6-8周齡SD雌性大鼠，體重180-200g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：合格證號：SCXK(陜)2012-003。大鼠被隨機(jī)分為4組：空白對照組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:補(bǔ)腎中藥復(fù)方組成：主要成分由紫河車、菟絲子、枸杞子、熟地、當(dāng)歸、黃芪等共100g，藥物均為配方顆粒劑，購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。阿司匹林腸溶片(25mg/片，陜西白鹿制藥廠)。

1.1.3 主要試劑和儀器:蘇木素、伊紅染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)；4%多聚甲醛、1%HCl-75%乙醇、堿液、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、丙三醇、二甲苯、PBS(中國國藥集團(tuán))；冷凍切片機(jī)(Leica公司 CM3050S)；倒置顯微鏡(Leica公司 IX71)。

1.1.4 動物模型建立:運(yùn)用10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g體重)麻醉大鼠，腹部常規(guī)消毒后，打開腹腔，暴露子宮，用微動脈夾阻斷雙側(cè)卵巢動脈血供20min，隨后恢復(fù)血流，逐層關(guān)腹，1個(gè)動情周期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物灌胃。

1.1.5 給藥方法和劑量:按照60kg成人與大鼠等效劑量比率為1:6，計(jì)算出大鼠灌胃劑量。中藥組：10g/kg·d，按1ml/100g灌胃；西藥組：小劑量阿司匹林0.5mg/kg·d，按1ml/100g灌胃；空白對照組及模型組每日灌服生理鹽水1ml/100g。各組大鼠連續(xù)灌胃15d后，剖腹取子宮。

1.2方法1.2.1大鼠子宮內(nèi)膜厚度測定及組織病理學(xué)變化的觀察將大鼠斷頸處死，75%乙醇中浸泡消毒5-10min。無菌條件下，小心剖取大鼠子宮，-20℃保存。將大鼠子宮包裹于包埋劑后，于冷凍切片機(jī)上進(jìn)行冷凍切片，設(shè)置切片厚度為5um。選取平整的切片進(jìn)行HE染色。將切片于4%多聚甲醛中固定10～30s，水洗。染蘇木素3～5min，水洗。1%HCl-75%乙醇分化5～10s，水洗。堿水促藍(lán)20s，水洗。伊紅染色30～60s，水洗。80%乙醇洗3～5s，95%乙醇洗3～5s，無水乙醇洗3～5s，丙三醇封片。結(jié)果判定：子宮內(nèi)膜厚度采用Leica Qwin Plus圖像處理軟件對HE染色后組織切片進(jìn)行測量。形態(tài)學(xué)變化運(yùn)用光鏡觀察子宮內(nèi)膜厚度、腺體及螺旋動脈分布、腺上皮細(xì)胞形態(tài)、間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。

2結(jié)果2.1各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較 模型組與空白對照組比較,子宮內(nèi)膜厚度明顯萎縮變薄，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明阻斷卵巢血供后子宮內(nèi)膜發(fā)生缺血性改變，可以導(dǎo)致內(nèi)膜厚度變薄。西藥組和中藥組的內(nèi)膜厚度與模型組比較均增加，中藥組增加的幅度更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與空白對照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣，中藥組與西藥組比較，雖然顯示出明顯增厚的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1　各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較

注：與模型組比較，*P<0.05

2.2各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化與空白對照組比較，模型組子宮內(nèi)膜層變薄，腺體數(shù)量減少，排列疏松，腺上皮細(xì)胞完整，呈單層立方上皮，間質(zhì)致密、細(xì)胞變少、變小，大部分區(qū)域血管分布稀疏。西藥組和中藥組子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量較模型組均明顯增加，間質(zhì)血管分布密度集中。而中藥組內(nèi)膜腺體及間質(zhì)血管發(fā)育較西藥組成熟度更高。 見圖1。

3討論胚胎成功的著床有賴于一定厚度的子宮內(nèi)膜提供營養(yǎng)，這是良好妊娠結(jié)局的保證。相對于較厚的子宮內(nèi)膜而言，排卵后子宮內(nèi)膜厚度<7～8mm時(shí)其臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率均明顯降低，這一點(diǎn)被大量的臨床研究證實(shí)[1-5]。到底在種植窗口期子宮內(nèi)膜厚度需要達(dá)到多少，才可以引起胚泡成功植入，目前對這一具體數(shù)值的界定尚不統(tǒng)一，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為子宮內(nèi)膜厚度至少>7mm，是獲得妊娠的前提[6]，當(dāng)內(nèi)膜厚度<6mm則很難獲得妊娠[7]。 Richer[8]等曾對子宮內(nèi)膜厚度與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系進(jìn)行研究：1294個(gè)IVF周期中，在排除患者的年齡和種植胚胎數(shù)及質(zhì)量因素后，發(fā)現(xiàn)妊娠組HCG 日子宮內(nèi)膜厚度較非妊娠組厚：內(nèi)膜 6～8mm者妊娠率為53%，而內(nèi)膜>16mm者妊娠率升高至77%，活產(chǎn)率或繼續(xù)妊娠率從44%增高到67%。近年來國內(nèi)研究者也嘗試應(yīng)用各種方法增加子宮內(nèi)膜厚度以達(dá)到提高妊娠率的目的獲得成功[9-11]。由此證明子宮內(nèi)膜的厚度是影響輔助生殖技術(shù)結(jié)局的關(guān)鍵因素之一。

目前有關(guān)薄型子宮內(nèi)膜的確切發(fā)生機(jī)制尚不清楚，也無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此近年來并未形成規(guī)范化的臨床治療方案。但國外研究者M(jìn)ina[12-13]等人對薄型子宮內(nèi)膜血流及內(nèi)膜生長相關(guān)因子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)了內(nèi)膜薄的共性特征：內(nèi)膜血流阻力增加，血供減少導(dǎo)致腺上皮細(xì)胞發(fā)育受損以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)下降，后者分泌減少造成子宮內(nèi)膜血管生長不良，進(jìn)而又會影響內(nèi)膜的血流。此過程循環(huán)往復(fù)，最終導(dǎo)致內(nèi)膜生長受限表現(xiàn)為薄型子宮內(nèi)膜。內(nèi)膜阻力增加作為始動因素的原因不明，但通過給予改善血流的藥物后，內(nèi)膜血流阻力下降，VEGF表達(dá)上調(diào)，子宮內(nèi)膜增厚，進(jìn)一步證實(shí)了子宮內(nèi)膜缺血、血供減少是薄型子宮內(nèi)膜的原因之一。

本研究基于上述薄型子宮內(nèi)膜病理生理學(xué)機(jī)制，通過阻斷卵巢動脈有效減少子宮動脈的血液供應(yīng)，使子宮內(nèi)膜處于低流量灌注狀態(tài)建立薄型子宮內(nèi)膜動物模型。實(shí)驗(yàn)證明，與空白對照組比較,子宮內(nèi)膜厚度明顯萎縮變薄，腺體數(shù)量減少，腺上皮細(xì)胞完整，呈單層立方上皮，間質(zhì)致密、細(xì)胞變少、變小，血管分布稀疏。說明阻斷卵巢血供后子宮內(nèi)膜發(fā)生缺血性改變，內(nèi)膜厚度變薄、腺體及血管發(fā)育不良。在分別給予模型動物小劑量阿司匹林及補(bǔ)腎中藥復(fù)方后，兩組模型動物內(nèi)膜腺體數(shù)量、間質(zhì)血管密度、內(nèi)膜厚度均增加。在促進(jìn)子宮內(nèi)膜厚度增加方面，雖然與小劑量阿司匹林相比較，無顯著性差異，但中藥組變化的趨勢更明顯。小劑量阿司匹林能使子宮血流增加，子宮內(nèi)膜腺體面積、腺腔周長間質(zhì)面積和腺/間比值增大，使內(nèi)膜增厚，改善薄型子宮內(nèi)膜容受性及容受性相關(guān)因子表達(dá)[14]，對增加胚胎種植率有一定的幫助，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎中藥復(fù)方在逆轉(zhuǎn)薄型子宮內(nèi)膜形態(tài)及功能中發(fā)揮著與小劑量阿司匹林相同且較優(yōu)的效應(yīng)。我們認(rèn)為這與該復(fù)方具有的補(bǔ)腎填精，益氣養(yǎng)血的功效密不可分。方中紫河車為血肉有情之品，生精益血，溫補(bǔ)腎陽，溫和而滋養(yǎng)力強(qiáng)；枸杞子、熟地、菟絲子補(bǔ)益肝腎，生精助陽；黃芪為補(bǔ)中升陽之要藥，張錫純謂之：其補(bǔ)益之功能生肌肉；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，增加內(nèi)膜生長的速度。全方補(bǔ)中有散，動靜結(jié)合，溫潤并行，諸藥合用，充分顯現(xiàn)了改善缺血后子宮內(nèi)膜血流、增加內(nèi)膜厚度的作用。

由于受到研究水平的限制，人們對薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生機(jī)制認(rèn)識還很有限，文獻(xiàn)報(bào)道的各種治療手段也都處于嘗試性探索階段。這為具有悠久歷史及豐富經(jīng)驗(yàn)的中醫(yī)學(xué)提供了廣闊的研究空間。中醫(yī)藥非線性調(diào)節(jié)的特點(diǎn)對該疾病的治療已初步顯現(xiàn)出整體療效，但因其成分復(fù)雜，對其療效機(jī)制的研究、作用路徑及靶點(diǎn)的研究還有待于我們深入探討。

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(收稿2016-04-20;修回2016-05-16)

Effect of kidney-reinforcing recipe on the thickness and histopathology of thin endometrium caused by Ischemic injury models in experimental rats

Affiliated Hospital of Shaanxi University Of Chinese Medicine

(Xianyang 712000 )Li Nan Chen MeiLi Feiet al

Objective：To observe kidney-reinforcing recipe on the thickness and histopathology of thin endometrium caused by Ischemic injury models in experimental rats.Methods：SD rats werer andomly divided into four groups, respectively blank control group, model group ,western medicine group and Chinese medicine group. All groups were established animal model of thin endometrium caused by Ischemic injury, but blank control group. After established model, blank control group and model group were given intragastric administration normal saline. Western medicine group was given low-dosage aspirine. Chinese medicine group was given. Gastric volume was 1ml/100g. all animals were put to death after 15days.Results:compared with blank control group, the thickness of endometrium of model group was obvious atrophy thinning. The difference was significant.The endometrial thickness were increased both western medicine group and Chinese medicine group compared with model group, the latter increased more significant.there was no difference with blank control group. Although showed obvious thickening trend in chinese medicine group, but There was no statistically significant difference compared with western medicine group. It was observed that endometrium was thinn ing, gland was fewer, loosely arranged. The stoma was less dense and vascular distribution was sparse in microscope. The number of endometrial glands both western medicine group and Chinese medicine group compared with model group were significantly increased, interstitial vascular distribution was density and Chinese traditional medicine group of endometrial glands and stroma vascular development maturity was higher than western medicine group.Conclusion Endometrial Ischemic injury caused by temporary interrupting the ovary artery blood supply will lead to endometrial thickness thinning. Kidney-reinforcing recipe can increase the thickness and form of thin endometrium and play a similar to low-dose aspirin and a better effect.

Kidney-reinforcing recipeThin endometriumEndometrial thicknessHistopathology

*陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2013JQ4010)

補(bǔ)腎中藥復(fù)方薄型子宮內(nèi)膜子宮內(nèi)膜厚度組織病理學(xué)

R96

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.078

陜西省教育廳自然科學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(14JK1205)