抑制口腔變異鏈球菌的乳酸菌篩選及其抑菌機(jī)理

郭夏蕾，張　健，楊貞耐*

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

抑制口腔變異鏈球菌的乳酸菌篩選及其抑菌機(jī)理

郭夏蕾，張健，楊貞耐*

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

利用乳酸菌能抑制有害菌的特性，從實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌中篩選能抑制口腔變異鏈球菌的菌株，并測(cè)定了篩選菌株的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），以及其對(duì)變異鏈球菌菌膜形成和黏附性的影響，初步研究其抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，有5 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1對(duì)變異鏈球菌具有明顯的抑制作用。4 株變異鏈球菌指示菌中，變異鏈球菌（Streptococcus mutans）1.2499、1.2500對(duì)植物乳桿菌比較敏感。植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌的抑制作用比其他4株植物乳桿菌的作用更明顯，其MIC最低（1.25×107～2.50×107CFU/mL）。同時(shí)，菌株K25對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的抑制率較高，還顯著地降低變異鏈球菌的黏附率。對(duì)菌株K25抑菌機(jī)理的初步研究表明，其代謝過程中產(chǎn)生的乳酸和過氧化氫起到了主要的抑菌作用。

變異鏈球菌；益生菌；植物乳桿菌；抑菌活性

齲齒是一種常見的口腔疾病，對(duì)口腔健康危害很大。其原因是變異鏈球菌（Streptococcus mutans）與口腔中的碳水化合物共同作用，形成的有機(jī)酸（主要是乳酸）不斷地侵蝕包裹在牙齒外面的牙釉質(zhì)，進(jìn)而使牙齒硬組織發(fā)生去礦化作用而形成齲齒［1］。變異鏈球菌的致病作用依賴于其對(duì)光滑牙面的黏附能力，一般來說，這種黏附作用主要通過兩個(gè)階段實(shí)現(xiàn)［2-4］：首先是變異鏈球菌通過氫鍵和疏水作用等蔗糖非依賴性黏附實(shí)現(xiàn)初始黏附；然后是經(jīng)蔗糖依賴性黏附，主要是水不溶性胞外多糖，使變異鏈球菌黏附到牙面上，該過程在變異鏈球菌定殖到牙面的過程中發(fā)揮主要作用。對(duì)于齲齒的治療通常是使用抗生素藥物，但長(zhǎng)期使用抗生素不僅會(huì)使口腔中微生物系統(tǒng)失衡，還會(huì)使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，不利于口腔健康［5］。乳酸菌是一種有益于人體健康的重要微生物，同時(shí)也存在于人口腔中，對(duì)于維持口腔微生態(tài)平衡具有重要作用［6］。從乳酸菌中篩選有益于口腔健康的益生菌受到了研究者們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

隨著益生菌療法在防治胃腸道感染疾病方面的優(yōu)勢(shì)日益明顯，這種治療方式也逐漸應(yīng)用到口腔領(lǐng)域［7-8］。近年來，很多的研究表明，益生菌在保持口腔健康、預(yù)防口腔疾病等方面都起到了重要作用［9］。益生菌能夠在一定程度上抑制致齲菌的活性，尤其可減少變異鏈球菌的數(shù)量，大大減小了齲病的發(fā)生率［10］。此外，口腔中的乳桿菌還能夠抑制牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）等導(dǎo)致牙周炎的致病菌和中間普雷沃菌（Prevotella intermedia）的生長(zhǎng)［11］。所以，利用益生菌的抑菌特性來抑制口腔中有害菌，減少齲齒等口腔疾病的發(fā)生，同時(shí)不破壞口腔微生物平衡，是一種很好的預(yù)防和治療方法。

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌菌株中篩選出對(duì)口腔變異鏈球菌具有抑制作用的優(yōu)良菌株，并研究了乳酸菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成和黏附性的抑制作用，為進(jìn)一步利用乳酸菌的益生特性來預(yù)防與改善齲齒等口腔疾病提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

乳酸菌共96株，由北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室保藏，其中植物乳桿菌K25由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供?？谇恢虏【儺愭溓蚓?.3771、1.2500、1.2499購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏所；變異鏈球菌10438購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2試劑與培養(yǎng)基

甲醇、冰醋酸、結(jié)晶紫、乳酸、乙酸 北京化工廠；胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶 美國(guó)Sigma公司。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母浸粉5.00 g、無水乙酸鈉5.00 g、檸檬酸鈉5.00 g、磷酸氫二鈉2.00 g、吐溫-80 1 mL、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸錳0.05 g，加水至1 000 mL，1 mol/L乙酸調(diào)至pH 6.6。121 ℃、102 kPa條件下滅菌15 min。

BHI液體培養(yǎng)基：心提取物5.0 g、腦提取物12.5 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、Na2HPO42.5 g、瓊脂15.0 g，蒸餾水定容至1.0 L，pH 7.4。121 ℃、102 kPa條件下滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌器 日本三洋公司；CR21GⅢ立式高速冷凍離心機(jī)、U-3900紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；數(shù)顯pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)的乳酸菌篩選

采用牛津杯法篩選出可以抑制變異鏈球菌的乳酸菌，具體操作參考Bosch等［12］的實(shí)驗(yàn)方法。將1.5 g/100 mL的BHI瓊脂培養(yǎng)基倒入平板中，待凝固后分別取20 μL變異鏈球菌10438、1.2499、1.3771、1.2500菌液涂布于平板上，然后將牛津杯固定在平板上，取100 μL提前活化好的乳酸菌的上清液加入到牛津杯中，將平板放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。測(cè)量抑菌圈的直徑，最終抑菌圈的大小可以反映菌株對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)抑制作用的強(qiáng)弱［13-14］。抑菌效果按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定：無抑菌圈，代表無抑制作用（-）；抑菌圈直徑0～3 mm，代表抑菌效果弱（+）；抑菌圈直徑3～6 mm，代表抑菌效果良好（++）；抑菌圈直徑＞6 mm，代表抑菌效果強(qiáng)（+++）［10］。

1.3.2植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)過程的影響

將篩選到的植物乳桿菌菌株按體積分?jǐn)?shù)3%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h后10 000r/min離心 15 min得上清液，分別測(cè)定不同植物乳桿菌培養(yǎng)上清液對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響。每株變異鏈球菌按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于5 mL BHI液體培養(yǎng)基中，分別添加5 mL植物乳桿菌培養(yǎng)上清液，37 ℃培養(yǎng)48 h，每4 h取出一定量培養(yǎng)液，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度（OD）值。每組設(shè)置3 個(gè)平行，繪制變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線。以不添加植物乳桿菌上清液的變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線為對(duì)照。

1.3.3植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度的測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)將篩選出的抑菌效果較好的植物乳桿菌菌株的上清液，調(diào)整到1.00×108CFU/mL，分別稀釋至菌液濃度5.00×107、2.50×107、1.25×107、6.25×106、3.12×106CFU /mL，分別對(duì)變異鏈球菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，方法見1.3.1節(jié)牛津杯法。最小抑菌濃度以有抑菌圈的最小濃度為準(zhǔn)。

1.3.4植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的抑制作用

利用BHI液體培養(yǎng)基將活化好的變異鏈球菌的菌液濃度調(diào)整到1.0×108CFU/mL，將植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1活化后， 5 000 r/min離心5 min，用濾膜（0.22 μm）過濾，得到上清液，取100 μL菌液與100 μL上清液混合均勻，加入到96 孔微量板中，以只添加MRS液體培養(yǎng)基的孔為陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄掉孔中培養(yǎng)液，加入200 μL PBS，將每孔清洗3 次，清洗時(shí)需不斷強(qiáng)烈振動(dòng)以除去未黏附的細(xì)菌。棄掉PBS，每孔加入200 μL 95%甲醇，固定15 min，棄掉甲醇后，置于室溫下自然干燥。再在每孔加入200 μL 2%的結(jié)晶紫，革蘭氏染色5 min，用去離子水沖洗，去掉多余的染料，室溫條件下自然干燥。每孔再加入160 μL 體積分?jǐn)?shù)33%的冰醋酸，重新將黏附在細(xì)菌上的染料溶解下來。從每孔取125 μL可溶性染料轉(zhuǎn)移到新的96 孔板中，在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值［15］。菌膜抑制率計(jì)算見公式（1）。

1.3.5植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響

參照文獻(xiàn)［16］中的方法進(jìn)行細(xì)菌的黏附性實(shí)驗(yàn)。將試管與水平面呈30° 角放置并固定，每組設(shè)3 個(gè)平行管，每個(gè)試管分別加3 mL植物乳桿菌上清液和3 mL變異鏈球菌菌懸液，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。取出試管，分別收集試管中緊密黏附、松散黏附和非黏附于試管壁的細(xì)菌，收集方法參考周智等［17］的方法。以只添加MRS培養(yǎng)基的孔為對(duì)照。將收集好的菌懸液分別加入96 孔微量板中，每孔加200 μL，用PBS調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔630 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按公式（2）計(jì)算細(xì)菌黏附率，其中緊密黏附菌懸液的吸光度記為A緊，非黏附和松散黏附菌懸液的吸光度記為A非+松。

1.3.6植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌抑菌機(jī)理的分析

1.3.6.1乳酸對(duì)變異鏈球菌的影響

用乳酸溶液調(diào)MRS液體培養(yǎng)基直至與植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液相同的pH值（pH 4.04），釆用牛津杯法分別做植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液和乳酸培養(yǎng)液對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500的抑菌實(shí)驗(yàn)，靜置24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)組為用乳酸調(diào)節(jié)的上清液，對(duì)照組為植物乳桿菌K25培養(yǎng)物上清液。

1.3.6.2過氧化氫酶對(duì)變異鏈球菌的影響

在植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液中分別加入適量過氧化氫酶，使過氧化氫酶的最終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，于28 ℃恒溫水浴2 h 后取出，靜置24 h后用牛津杯法測(cè)定過氧化氫酶對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500抑菌圈的大小，對(duì)照組為不加過氧化氫酶的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液。

1.3.6.3蛋白酶對(duì)變異鏈球菌的影響

在植物乳桿菌K25的培養(yǎng)上清液中加入一定量胃蛋白酶和胰蛋白酶，使蛋白酶最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于28 ℃恒溫水浴2 h后取出，靜置24 h后牛津杯法測(cè)定對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500的抑菌圈大小，對(duì)照組為未經(jīng)蛋白酶處理的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，Turkey檢驗(yàn)方法用于比較各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異的顯著性。P＞0.05表示差異不著性，P＜0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)變異鏈球菌具有抑制作用的乳酸菌的篩選

從實(shí)驗(yàn)室保藏的96 株乳酸菌中篩選到對(duì)變異鏈球菌具有一定抑制作用的7 株植物乳桿菌。由表1可知，不同的植物乳桿菌對(duì)4 株變異鏈球菌的抑菌活性不同，其中菌株K25對(duì)4 株變異鏈球菌都有明顯的抑菌活性，且對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.3771、10438 這3 株變異鏈球菌的抑菌圈都達(dá)到了13.00 mm以上，抑菌圈最大可達(dá)16.30 mm，因此表明植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果比較好。另外4 株植物乳桿菌SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1也具有較明顯的抑菌效果，抑菌圈最大也可達(dá)到12.50 mm。植物乳桿菌QH25-1和QH35-3-2對(duì)變異鏈球菌抑制作用相對(duì)較弱。

表1　7 株植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果Table1　Inhibitory effect of seven L. plantarum strains on Streptococcus mutans

2.2植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500、1.3771、10438生長(zhǎng)過程的影響如圖1所示。在變異鏈球菌培養(yǎng)過程中添加上述植物乳桿菌培養(yǎng)上清液，可使4 株變異鏈球菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，其培養(yǎng)基OD值均低于對(duì)照組的OD值。由圖1還可知，添加上述植物乳桿菌培養(yǎng)上清液，可不同程度地延緩變異鏈球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而使變異鏈球菌的增殖速率減慢；不同的植物乳桿菌菌株對(duì)同一株變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響不同，同一株植物乳桿菌對(duì)不同的變異鏈球菌菌株生長(zhǎng)的影響也不同。同時(shí)，添加植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液，使4 株變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線均處于最低水平，說明植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌的抑制活性最強(qiáng)，與上述基于牛津杯固體培養(yǎng)基抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

圖1　植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1對(duì)變異鏈球菌1.2499（A）、1.2500（B）、1.3771（C）、10438（D）生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effect of Lactobacillus plantarum K25， SKT109， YW3-2，YW5-1， YW1-1 on the growth of Streptococcus mutans 1.2499 （A），1.2500 （B）， 1.3771 （C） and 10438 （D）

2.3植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度

植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度可以在某種程度上反映變異鏈球菌對(duì)植物乳桿菌的敏感性，同時(shí)也反映植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果；抑菌濃度越低，說明變異鏈球菌對(duì)植物乳桿菌越敏感，植物乳桿菌的抑菌作用越強(qiáng)［18-19］。由圖2可知，植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌1.2499的最小抑菌濃度為1.25×107CFU/mL，對(duì)1.3771、1.2500和10438菌株的最小抑菌濃度為2.5×107CFU/mL。而植物乳桿菌SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1對(duì)4 株變異鏈球菌的最小抑菌濃度相對(duì)較高，在5.0×107～1.0×108CFU/mL之間。5 株植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌1.2499和1.2500的最小抑菌濃度為1.25×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL，低于對(duì)其他2 株變異鏈球菌的最小抑菌濃度，表明此2 株變異鏈球菌對(duì)本實(shí)驗(yàn)的植物乳桿菌的抑制作用更敏感。

圖2　植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度Fig.2　Minimum inhibitory concentration of Lactobacillus plantarum against Streptococcus mutans

2.4植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的抑制作用

圖3　植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的影響Fig.3　Effect of Lactobacillus plantarum on the biofilm formation of Streptococcus mutans

由圖3可知，5 株植物乳桿菌對(duì)4 株變異鏈球菌的菌膜形成具有不同程度的抑制作用，但都對(duì)變異鏈球菌1.2499具有最高的抑制率，達(dá)到60%以上，其次是變異鏈球菌1.2500，抑制率略高于40%，說明這2 株變異鏈球菌對(duì)植物乳桿菌比較敏感。對(duì)于變異鏈球菌1.3771和10438，植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌1.3771的抑制活性較明顯（抑制率為51.1%），而其他4 株植物乳桿菌對(duì)菌株1.3771和10438菌膜形成的抑制率較低。此外，植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌1.2500和10438的菌膜形成抑制率也略高于其他4 株菌。菌膜的形成能提高致病菌對(duì)抗生素的抗性，繼而可能誘導(dǎo)感染疾?。?5］。因此，本研究篩選的5 株植物乳桿菌對(duì)于通過抑制變異鏈球菌的菌膜形成，降低口腔齲齒病的發(fā)生幾率具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.5植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響

5 株植物乳桿菌對(duì)4 株變異鏈球菌在光滑面上的黏附性的影響如圖4所示，對(duì)于同一株變異鏈球菌，加入不同的植物乳桿菌培養(yǎng)上清液之后，其黏附率不同。而同一株植物乳桿菌對(duì)不同的變異鏈球菌的黏附率的影響也不同。但對(duì)于4株變異鏈球菌在添加了所有的植物乳桿菌培養(yǎng)上清液之后都比未添加時(shí)的黏附率低，說明5 株植物乳桿菌都降低了4 株變異鏈球菌的在光滑面上的黏附率。對(duì)于變異鏈球菌1.2499，對(duì)照組的黏附率為47.46%，在添加植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液后，其黏附率下降為24.6%，比其他4 株植物乳桿菌對(duì)其抑制率要低，說明菌株K25對(duì)變異鏈球菌1.2499黏附的抑制效果最好。同樣，對(duì)于其他3 株變異鏈球菌，在添加了菌株K25之后，其黏附率也低于其他4 株植物乳桿菌的黏附率，分別為15.64%、8.36%和7.02%，所以，植物乳桿菌K25對(duì)4 株變異鏈球菌黏附的抑制作用都強(qiáng)于其他4 株植物乳桿菌。據(jù)報(bào)道，口腔變異鏈球菌必須首先附著于人體牙齒表面，才能造成對(duì)人體牙齒的危害，導(dǎo)致齲病的發(fā)生［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)篩選獲得的植物乳桿菌，尤其是菌株K25，對(duì)于降低變異鏈球菌在牙齒表明的黏附，防止齲病具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖4　植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響Fig.4　Effect of L. plantarum on the adhesion ability of Streptococcus mutans

2.6植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌抑菌機(jī)理的分析

以對(duì)變異鏈球菌具有明顯抑制活性的植物乳桿菌K25為例，對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行分析。

2.6.1乳酸對(duì)變異鏈球菌的影響

由表2可知，菌株K25培養(yǎng)上清液對(duì)變異鏈球菌1.2499和1.2500的抑制作用略高于對(duì)照組樣品，但二者差異不顯著（P＞0.05）。因此，植物乳桿菌K25的抑菌作用與其產(chǎn)生的乳酸有關(guān)，同時(shí)還存在其他的抑菌因素。

表2　植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液（或培養(yǎng)基）的不同處理方式對(duì)變異鏈球菌的抑制作用Table2　Effect of different treatments for medium and culture　supernatant of L. plantarum on its inhibition against Streptococcus mutans

2.6.2過氧化氫酶對(duì)變異鏈球菌的影響

比較添加和不添加（對(duì)照組）過氧化氫酶的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液對(duì)變異鏈球菌1.2499和1.2500的抑制作用（表2）可知，對(duì)照組的抑菌圈直徑分別為（15.50±0.93）mm和（14.76±1.06）mm，而實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑分別為（12.65±0.78）mm和（12.15±0.83）mm，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈大小有顯著性差異（P＜0.05）。因此可以推測(cè)，過氧化氫對(duì)菌株K25的抑菌作用起到了重要的貢獻(xiàn)。

2.6.3蛋白酶對(duì)變異鏈球菌的影響

比較添加和不添加（對(duì)照組）蛋白酶的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液對(duì)2株變異鏈球菌的抑菌作用（表2）。結(jié)果表明，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑無顯著差異（P＞0.05）?？梢酝茰y(cè)，菌株K25沒有產(chǎn)生對(duì)變異鏈球菌具有明顯抑制作用的蛋白質(zhì)類細(xì)菌素。

3　討 論

近年來，有關(guān)益生菌對(duì)人體健康的有益作用及在疾病預(yù)防方面的研究應(yīng)用越來越多［21］。有研究者發(fā)現(xiàn)，人體口腔中的益生菌可以抑制口腔致病菌的黏附和定殖，對(duì)于保持口腔微生態(tài)的平衡及齲齒等口腔疾病的預(yù)防具有重要作用［22-24］。目前報(bào)道的益生菌主要包括乳桿菌和雙歧桿菌兩大類［9］。本研究篩選到7 株對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)、黏附和菌膜形成具有明顯抑制作用的植物乳桿菌，尤其是菌株K25曾被報(bào)道具有良好的益生特性［25］，其在口腔疾病預(yù)防方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

變異鏈球菌具有較強(qiáng)的耐酸能力，通常乳酸菌對(duì)變異鏈球菌的抑制作用弱于對(duì)其他常見口腔致病菌的抑制，表現(xiàn)為前者具有更小的抑菌圈［11，26］。由于變異鏈球菌具有較強(qiáng)的菌體聚集能力，因此，在采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)將變異鏈球菌均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，以便獲得邊緣清晰的抑菌圈。據(jù)報(bào)道，乳酸菌對(duì)變異鏈球菌的抑制作用與其在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的各種初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物，如乳酸、過氧化氫和一些細(xì)菌素等密切相關(guān)［27］。本研究的抑菌實(shí)驗(yàn)表明，植物乳桿菌K25的抑菌作用主要?dú)w因于其代謝過程中產(chǎn)生的乳酸和過氧化氫。

變異鏈球菌作為齲齒的主要病原細(xì)菌，它能使糖轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)雜的多糖類，產(chǎn)生黏稠性多糖物質(zhì)附著于牙齒表面從而形成牙斑，并有利于變異鏈球菌黏附定殖到牙面上發(fā)揮其致病作用［28］。本研究的黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，植物乳桿菌能有效地降低變異鏈球菌1.2499、1.2500等致病菌的黏附率，可以阻斷變異鏈球菌黏附到牙齒表面的過程，進(jìn)而減少牙斑的生成。

變異鏈球菌黏附于口腔牙面之后會(huì)產(chǎn)生菌膜，生成的菌膜又進(jìn)一步促進(jìn)其在牙面上的黏附，菌膜還起到保護(hù)菌體不被酸、堿、抗生素等殺死的作用。本研究的菌膜抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1都可以抑制變異鏈球菌菌膜的形成，從而減少變異鏈球菌在牙齒上的定殖黏附，使變異鏈球菌更容易被口腔或者人體中的抑菌和殺菌物質(zhì)抑制或直接將其殺死，減少齲病的發(fā)生，保護(hù)口腔健康。

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Screening of Lactic Acid Bacteria for Inhibiting Oral Streptococcus mutans and Preliminary Study of Antibacterial Mechanism

GUO Xialei， ZHANG Jian， YANG Zhennai*
（Beijing Laboratory of Food Quality and Safety， Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

Considering that lactic acid bacteria （LAB） that can inhibit harmful bacteria， LAB strains stored in our laboratory were screened for inhibiting oral Streptococcus mutans. The screened strains were measured for minimum inhibitory concentration （MIC） and inhibitory effect on biofilm formation adhesion properties of S. mutans， and the underlying mechanism was preliminarily studied as well. The results showed that 5 Lactobacillus plantarum strains including K25，SKT109， YW3-2， YW5-1 and YW1-1 exhibited clear inhibition against S. mutans. Among 4 indicator S. mutans strains，1.2499 and 1.2500 were more sensitive to L. plantarum. L. plantarum K25 showed stronger inhibition than 4 other strains against S. mutans. The MIC value （1.25 × 107-2.50 × 107CFU/mL） of strain K25 was the lowest， the inhibition rate on biofi lm formation of S. mutans was signifi cantly higher， and the inhibitory effect on the adhesion ability of S. mutans was clear. Preliminary studies on the antibacterial mechanism of L. plantarum K25 indicated that lactic acid and hydrogen peroxide produced by the strain played major roles in this activity.

Streptococcus mutans； probiotic； Lactobacillus plantarum； inhibitory activity

10.7506/spkx1002-6630-201619020

TS201.3

A

1002-6630（2016）19-0117-06

郭夏蕾， 張健， 楊貞耐. 抑制口腔變異鏈球菌的乳酸菌篩選及其抑菌機(jī)理［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 117-122. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619020. http：//www.spkx.net.cn

GUO Xialei， ZHANG Jian， YANG Zhennai. Screening of lactic acid bacteria for inhibiting oral Streptococcus mutans and preliminary study of antibacterial mechanism［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 117-122. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619020. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571857）

郭夏蕾（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。E-mail：610850207@qq.com

楊貞耐（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)及加工技術(shù)。E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn