心腦寧片對大鼠腦缺血模型凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

馬珍珍，謝國旗，郝少君，張正臣，劉　艷

心腦寧片對大鼠腦缺血模型凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

馬珍珍，謝國旗，郝少君，張正臣，劉艷＊

目的研究心腦寧片對大鼠腦缺血模型腦組織勻漿中凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。方法取體重180～200 g雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為3組：第一組為假手術(shù)組，其余2組造腦缺血模型。模型Ⅰ、Ⅱ組分別灌服0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）和同體積的0.75 g/kg含量的心腦寧片混懸液，采取酶聯(lián)免疫技術(shù)測定勻漿中Bcl-2及Bax的含量。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型Ⅰ組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2含量顯著增加（P＜0.05），而Bax含量非常顯著增加（P＜0.01）；與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ組有顯著高的Bcl-2含量（P＜0.05）和顯著低的Bax含量（P＜0.05），且Bcl-2/Bax顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論心腦寧片可以提高抑凋亡基因含量，降低促凋亡基因含量，明顯增加抑凋亡基因與促凋亡基因的濃度比率，表明其對腦組織有著明顯的保護(hù)作用。

心腦寧片；大鼠；腦缺血；Bcl-2；Bax；Bcl-2/Bax

DOI:10.14172/j.issn1671-4008.2016.10.019

心腦寧片是根據(jù)中醫(yī)理論和現(xiàn)代藥理研究成果擬定的院內(nèi)協(xié)定處方［1］。心腦寧片由人參、當(dāng)歸及川芎等組成。制作方法：各取120 g人參、黃芪，粉成100目細(xì)粉備用。剩余部分人參、黃芪及其他組成藥均被粉碎成10目粗粉，加水（8倍）煎煮二次，均為2 h，之后合并煎液，過濾，80℃濃縮濾液（相對密度1.15～1.30）。加入備好的細(xì)粉，取淀粉適量，混勻，干燥成干膏，粉碎，經(jīng)14～16目篩制粒，烘干，用14目篩整粒，加入1%硬脂酸鎂混勻，壓片（每片0.3 g），包衣，制成1000片即得（每片相當(dāng)含生藥1.75 g）。該制劑具有活血化瘀，益氣安神，用于冠心病，腦血栓形成等，亦可用于記憶力減退，抗衰老等作用，有滿意的臨床效果［1-3］。

為了進(jìn)一步探究其療效原理，筆者對灌服心腦寧片的大鼠腦缺血模型腦組織勻漿液中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax等含量做了測定，旨在為進(jìn)一步解釋心腦寧片治療心腦血管等疾病的療效提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥品心腦寧片由解放軍第371醫(yī)院制劑室提供，批號20110606；羧甲基纖維素鈉（Sodium salt of Caboxy Methyl Cellulose，CMC），天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號20090723；生理鹽水，河南華利制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號11041806；大鼠凋亡相關(guān)因子（BCL-2）ELISA試劑盒，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號：F01425；大鼠Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bax）ELISA試劑盒，上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司，產(chǎn)品貨號：EIA-01319。

1.2實(shí)驗(yàn)動物清潔級，Wistar大鼠，河北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號1112028。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器FA（N）/JA（N）系列電子天平，由上海民橋精密儀器有限公司生產(chǎn)；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋，由北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；微量加樣器（規(guī)格：2～20 μl、5～50 μl、10～100 μl、20～200 μl和100～1000 μl），由美國Thermo Electron生產(chǎn)；Thermo酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法取體質(zhì)量180～200 g Wistar大鼠36只，雄性。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組及造腦缺血模型（模型Ⅰ、Ⅱ組）。模型Ⅱ組灌服0.75 g/kg含量的心腦寧片混懸液 （用0.5%CMC配成37.5 mg/ml，為臨床用量的10倍，2 ml/100 g）、模型Ⅰ組灌服同體積的0.5%CMC，假手術(shù)組灌同體積的0.5%CMC；給藥1次/d，連續(xù)給藥7 d，于第6天晚上8點(diǎn)禁食不禁水，第7天上午給藥后1 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后做頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，動脈下各置一手術(shù)線，結(jié)扎血管；假手術(shù)組只麻醉解剖不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。各組動物結(jié)扎后掛線60 min（假手術(shù)組除外）后，斷頭取腦，取一半加9倍量生理鹽水，用勻漿機(jī)制成10%腦勻漿，分別采用酶聯(lián)免疫技術(shù)測定腦勻漿中Bcl-2、Bax的含量。測定方法按試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)本課題組前期報道，大鼠腦缺血模型造模成功［4］。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用方差分析（LSD法）。

2　結(jié)果

2.1心腦寧片對大鼠腦缺血模型腦組織勻漿中Bcl-2含量的影響與假手術(shù)組比較，模型Ⅰ組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2含量增加，但差異不顯著（P＞0.05）；與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2含量顯著增加（P＜0.05）。見表1。

2.2心腦寧片對大鼠腦缺血模型腦組織勻漿中Bax含量的影響與假手術(shù)組比較，模型Ⅰ組大鼠腦組織勻漿中Bax含量極顯著增加（P＜0.01）；與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ組大鼠腦組織勻漿中Bax含量顯著降低（P＜0.05）。見表1。

2.3心腦寧片對大鼠腦缺血模型腦組織勻漿中Bcl-2/Bax的影響與假手術(shù)組比較，模型Ⅰ組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2/Bax顯著降低 （P＜0.05）；與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2/ Bax顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表 1　心腦寧片對大鼠腦缺血模型腦組織勻漿中Bcl-2、Bax含量的影響（±s）

表 1　心腦寧片對大鼠腦缺血模型腦組織勻漿中Bcl-2、Bax含量的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05，△P＜0.01；與模型Ⅰ組比較，#P＜0.05。

組別　　動物數(shù)（只）　　劑量（g/kg）　Bcl-2（pg/ml）　Bax（pg/ml）　Bcl-2/Bax假手術(shù)組　12　111.03±21.10　231.09±36.71　0.48±0.16模型Ⅰ組　12　126.89±23.63　483.21±43.19△　0.26±0.09＊模型Ⅱ組　12　0.75　187.72±38.08#　372.40±44.35#　0.50±0.12#

3　討論

Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，并且在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要的作用［5］。Bcl-2被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白家族中最重要的調(diào)控蛋白，Bcl-2的功能受其蛋白產(chǎn)物Bax和Bcl-xl的調(diào)節(jié)［6］。已知Bcl-2不像其他典型的癌蛋白那樣破壞細(xì)胞正常的增殖調(diào)控機(jī)制，而是通過阻止凋亡而促進(jìn)細(xì)胞存活。Bax能允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素C等穿過線粒體膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封閉Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，從而保護(hù)細(xì)胞凋亡［7］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生取決于促凋亡成員和抑凋亡成員的相對濃度，因而，Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例形成了細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能［8］。Bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體（Bcl-2/Bax）與同二聚體（Bax/Bax）的比值，這對決定細(xì)胞凋亡的易感性起關(guān)鍵作用。一般而言，Bcl-2的過度表達(dá)與Bax形成異二聚體而阻抑凋亡。

研究表明，針刺能促進(jìn)腦缺血后大鼠抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制促細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白的表達(dá)，增大Bcl-2/Bax比值，達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用［9］。與假手術(shù)組比較，腦缺血模型組Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)上升、Bcl-2/Bax比值下降；經(jīng)肌肽處理后Bcl-2表達(dá)上升、Bax表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值上升，表明這可能是肌肽發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制之一［10］。與腦缺血模型組比較，失荅剌治丸組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2表達(dá)增加、Bax表達(dá)降低，同時凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明失荅剌知丸對腦可起到保護(hù)作用［11］。井穴放血與安宮牛黃丸結(jié)合在腦缺血早期能使Bcl-2增多、Bax減少，能有效抑制永久性大腦中動脈閉塞大鼠腦細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用［12］。與假手術(shù)組相比，缺氧缺血組在2 h、12 h、24 h、48 h、72 h腦組織中Bcl-2、Bax的表達(dá)均增加，與缺氧缺血組相比，氨基甲?；偌t細(xì)胞生成素 （CEPO）干預(yù)組在不同時間點(diǎn)Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)下降［13］。銀杏達(dá)莫可提高Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)，進(jìn)一步對局灶缺血性腦損傷起到預(yù)防性保護(hù)作用［14］。

心腦寧片主要由活血藥和補(bǔ)氣藥組成。呂宏迪等報道心腦寧片均可顯著降低腦勻漿LD水平，升高腦勻漿LDH活力，并可顯著升高腦勻漿ATP酶的活力，說明心腦寧片具有明顯改善腦缺血作用［4］。馬珍珍等認(rèn)為心腦寧片有顯著改善腦組織形態(tài)的作用［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型Ⅰ組大鼠抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax含量均增加，但Bax含量增加大于Bcl-2，導(dǎo)致Bcl-2/Bax顯著降低，對大鼠腦細(xì)胞起到了促凋亡作用；與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ組大鼠腦組織勻漿中Bcl-2含量顯著增加，Bax含量明顯下降，Bcl-2/Bax顯著升高，表明心腦寧片對腦缺血大鼠腦組織起著明顯的保護(hù)作用。

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［2016-02-12收稿，2016-03-10修回］［本文編輯：韓仲琪］

Effect of Xinnaoning tablets on the Bcl-2，Bax levels of the cerebral ischemia model rat

MA Zhenzhen①，XIE Guo-qi，HAO Shao-jun，et al.①Dept.of Bone，the 371st Central Hospital of PLA，Xinxiang，Henan 453000，China

ObjectiveTo study the effect of Xinnaoning tablets on the Bcl-2，Bax levels of the rat cerebral ischemia model.MethodsThirty-six male Wistar rats were divided into three groups.The first group was the sham operation group，and the other two groups were made into the cerebral ischemia model，i.e model groupⅠ was fed with CMC suspension and model groupⅡ was fed with 0.75 g/kg suspension of this tablets，and then the Bcl-2，Bax levels in three groups were detected by ELASA.ResultsCompared with the sham operation group，model groupⅠ had the higher Bcl-2 level（P＜0.05），and significantly higher Bax level（P＜0.01）；Compared with the model groupⅠ，model groupⅡ had significantly higher Bcl-2 level and Bcl-2/Bax（P＜0.05），but lower Bax level（P＜0.05）.ConclusionXinnaoning tablets could have a protective effect on the brain tissue，which showedbyitupliftingthelevelofsuppression-apoptosisgene，decreasingpromotion-apoptosisgene，and significantly in creasing the ration of both.

Xinnaoning tablets；Rat；Cerebral ischemia；Bcl-2；Bax；Bcl-2/Bax

R743

A

453000河南新鄉(xiāng)，解放軍371醫(yī)院（馬珍珍，謝國旗，郝少君，張正臣，劉艷）

劉艷，Email：184969914@qq.com